本发明属于生物工程及天然产物生物提取
技术领域：
，具体涉及一种应用银耳菌深层发酵及生物转化制造的有保健功能的银耳、玛咖和怀山药活性成分的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物及其制造方法。
背景技术：
：银耳，又称作白木耳，其味甘、淡、性平、无毒，既有补脾开胃的功效，又有益气清肠、滋阴润肺的作用。银耳富含有天然植物性胶质，外加其具有滋阴的作用，是可以长期服用的良好润肤食品。银耳中主要包括银耳多糖、钙、铁、氨基酸、海藻糖、多聚糖醇等活性物质，这些活性物质对于抗菌消炎、抗病毒、提高免疫、肝脏解毒、肾衰、癌症、肺气肿和糖尿病等有积极的治疗作用。玛咖(玛卡)，是原产南美洲的一种十字花科植物，叶子椭圆，根茎形似小圆萝卜，可食用，是一种纯天然食品，营养成份丰富，有“南美人参”之誉。其营养成分研究表明，玛咖具有高蛋白、高支链氨基酸、高果糖等营养特征，并发现玛咖中含有玛咖烯类、玛咖多糖、生物碱和牛磺酸等功能性活性成分，这些成分具有抗疲劳、提高免疫等功能。怀山药，味甘、性平，人脾、肺、肾三经，具有健脾、补肺、固肾、益精、延年益寿之功效.含有皂甙粘液质、胆碱、糖蛋白、多种氨基酸、维生素c、山药碱及cu、p、fe、se等多种微量元素目前，市场上以玛咖、怀山药、银耳为原料研制而成的产品未见，但作为功能性产品，现有报导的玛咖和怀山药的加工工艺，尚无法高效率地将这些原料中的功效成分提取成易为人体充分吸收利用的游离状态，其技术瓶颈为缺少一种既安全又效率高的提取方法。国内外对银耳、玛咖和怀山药中天然活性成份的提取分离工艺进行了许多的研究，其中大多数都采用热提取、醇提取、酶法提取、也有采用超声波提取的工艺等，这些方法的不足之处很明显，功效成分提取率低或提取效率较低或安全性较差或成本较高。技术实现要素：本发明的目的在于：提供一种功效成分提取率高，既安全又高效，且成本低的，有效利用银耳菌发酵玛咖和怀山药制造功能性组合物的方法，同时提供一种按该方法制造的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物。本发明以玛咖、怀山药为培养基质，采用银耳菌生物转化法，一方面可有效释放玛咖和怀山药中的各种功效成分，另一方面玛咖和怀山药可提供银耳生物合成多糖的前体物质，进而提高银耳多糖的合成水平，从而可解决现有技术中存在的效率低、安全性差、成本高的技术瓶颈问题。本发明从配方和工艺两个方面全面解决了上述技术问题。本发明的技术方案如下：本发明提供一种玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物的制造方法，包括如下步骤：(a)将玛咖粉、怀山药粉、大豆粉加冷水搅匀，然后加温灭菌，获得种子培养基溶液；(b)将所述步骤(a)获得的种子培养基溶液冷却，接入银耳菌，搅拌培养若干天，获得银耳菌种子培养液；(c)将玛咖粉、怀山药粉、大豆粉搅拌均匀，获得固料；将该固料与水混合均匀，经高温灭菌，获得银耳菌液态发酵的培养基；(d)接种发酵：将所述步骤(c)获得的银耳菌液态发酵的培养基冷却，接入步骤(b)获得的银耳菌种子培养液，两者混匀后装入发酵池或发酵罐进行发酵，获得玛咖和怀山药的银耳菌发酵组合物；(e)将所述步骤(d)获得的玛咖和怀山药的银耳菌发酵组合物，经调节ph、升温及保温处理，获得玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物。进一步地，该方法还包括以下步骤：(f)将所述步骤(e)获得的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物冷却至4℃-35℃，加入1倍-3倍的无水乙醇，4℃-25℃放置1小时-10小时，经3000转/分钟-10000转/分钟离心分离10分钟-30分钟，获得沉淀(i)和上清液(ii)；(g)将所述步骤(f)获得的上清液(ii)以0.1摩尔/升的盐酸调节ph至1-3，4℃-25℃放置1小时-10小时，经3000转/分钟-10000转/分钟离心分离10分钟-30分钟，获得沉淀(iii)和上清液(iv)；(h)按常规分析方法分析测试，测得：所述步骤(f)获得的沉淀(i)中含有的功效成分多糖(包括玛咖多糖、山药多糖和银耳多糖)的含量；所述步骤(g)获得的沉淀(iii)中含有的功效成分大豆卵磷脂和皂甙(山药皂甙)的含量；所述步骤(g)获得的上清液(iv)中含有的功效成分牛磺酸、玛咖烯类的含量。更进一步地，该方法还包括以下步骤：将所述步骤(e)获得的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物(转化液)，按常规制造工艺，制造成饮料、颗粒冲剂、片剂、胶囊、丸剂、膏剂等各种不同剂型的产品。进一步地，所述步骤(a)中，以水配制的培养基质即种子培养基溶液中，各物质的质量百分比：玛咖粉为0.5％～30％、大豆粉为0.1％～10％、怀山药粉为1％-30％；加温灭菌的条件为：在115-125℃下灭菌20-50分钟。进一步地，所述步骤(b)中，获得银耳菌种子培养液的方法为：将所述的种子培养基溶液冷却到20-40℃，加入质量比为0.5％-15％的银耳菌，在100转-400转/分钟的转速，培养温度10℃-40℃下，搅拌培养3天-10天，获得银耳菌种子培养液(银耳菌种液)。进一步地，所述步骤(c)中，所述的固料中，各组分的重量份数为：玛咖粉为10份-60份、怀山药粉为20份-80份、大豆粉为5份-20份；将该固料与10℃-60℃水按1:1-1:2比例混合均匀，获得银耳菌液态发酵的培养基。进一步地，所述步骤(d)中，将所述步骤(c)获得的银耳菌液态发酵的培养基冷却至室温，按1％-20％的质量比例，接入步骤(b)获得的银耳菌种子培养液(即：将步骤(b)获得的银耳菌种子培养液按1％-20％的质量比加入步骤(c)获得的银耳菌液态发酵的培养基中)，两者混匀后装入发酵池或发酵罐进行发酵，发酵温度为10℃-40℃，发酵时间为3天-20天。进一步地，所述步骤(e)中，其保温转化工艺条件为将所述步骤(d)获得的玛咖和怀山药的银耳菌发酵组合物，调节ph至3-7.5，经升温至35℃-100℃，保温处理0.5小时-5小时，获得玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物。进一步地，所述步骤(h)中，最终测得，所述步骤(e)获得的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物中，各功能组分(功效成分)的质量百分含量为：玛咖烯类0.1％～1.5％、大豆卵磷脂0.1％～3％、牛磺酸0.01％～0.1％、银耳多糖1.5％～9％、山药皂甙0.1％～1.2％。本发明还提供一种按上述方法制造得到的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物，其中包含功效成分：玛咖烯类、大豆卵磷脂、牛磺酸、银耳多糖和山药皂甙。进一步地，上述各功效成分的质量百分比为：玛咖烯类0.1％～1.5％、大豆卵磷脂0.1％～3％、牛磺酸0.01％～0.1％、银耳多糖1.5％～9％、山药皂甙0.1％～1.2％。本发明的有益效果：本发明经过广泛而深入的研究，首次采用玛卡粉+怀山药粉+大豆粉的独特组合，利用银耳菌的深层发酵及生物转化，逐级调节酸碱度、升温保温转化工艺，提供了一种玛咖及山药生物活性物质的生物转化提取方法。同时提供了一种利用银耳菌合成银耳多糖的方法，解决了玛咖、怀山药产品加工中功效成分提取率低、安全性差的问题，提高了银耳菌合成银耳多糖的水平。经动物实验证明，通过本发明的方法制得的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物，具有改善肺部纤维化功能、抗疲劳等功能。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除外另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1-种子培养液制备将玛咖粉3％、大豆粉0.5％、怀山药粉4％加冷水搅匀，然后加温，经121℃灭菌30分钟，冷却到30℃，无菌条件下接入10％的银耳菌，在200转/分钟的转速，培养温度30℃条件下，培养10天获得银耳菌种子培养液；经检验生物量大于1.5％。实施例2-种子培养液制备将玛咖粉30％、大豆粉10％、怀山药粉30％加冷水搅匀，然后加温，经125℃灭菌30分钟，冷却到40℃，无菌条件下接入0.5％的银耳菌，在400转/分钟的转速，培养温度40℃条件下，培养3天获得银耳菌种子培养液；经检验生物量大于1.5％。实施例3-种子培养液制备将玛咖粉0.5％、大豆粉0.1％、怀山药粉1％加冷水搅匀，然后加温，经115℃灭菌30分钟，冷却到20℃，无菌条件下接入15％的银耳菌，在100转/分钟的转速，培养温度10℃条件下，培养7天获得银耳菌种子培养液；经检验生物量大于1.5％。实施例4-银耳菌深层发酵、生物转化及冲剂生产按玛咖粉30份、大豆粉6份、怀山药粉20份的比例混合搅拌均匀，获得固料，将该固料与25℃水按1:1比例混合均匀，经121℃灭菌30分钟，获得银耳菌液态发酵的培养基；将该培养基冷却至室温，按10％的接种量接入种子液(即实施例1获得的银耳菌种子培养液)，混匀后装入转鼓式发酵罐，30℃发酵20天，获得银耳菌发酵物(玛咖和怀山药的银耳菌发酵组合物)；先用0.1摩尔/升的碳酸氢钠调ph至4.5，然后升温至55℃，保温处理3小时，再用0.1摩尔/升的碳酸氢钠调节ph至ph7.0，60℃保温转化1小时，获得全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物。将该全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物，在55℃真空干燥并粉碎后获得颗粒状冲剂。经常规分析，各功能成分的含量见表1。表1玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物(冲剂)中功效成分含量(％)玛咖烯银耳多糖卵磷脂牛磺酸山药皂甙保温前0.967.260.350.030.65保温后1.238.650.470.051.06实施例5-银耳菌深层发酵、生物转化及饮料生产将玛咖粉500克、大豆粉100克、怀山药粉300克混合搅拌均匀装入20升机械搅拌式发酵罐，加入10升10℃的纯净水，经125℃灭菌20分钟，获得银耳菌液态发酵的培养基；将该培养基冷却至室温，按20％的接种量接入种子液(即实施例1获得的银耳菌种子培养液)，混匀后，10℃发酵20天，获得银耳菌发酵物(玛咖和怀山药的银耳菌发酵组合物)；先用0.1摩尔/升的碳酸氢钠调ph至4.5，然后升温至55℃，保温处理3小时，再用0.1摩尔/升的碳酸氢钠调节ph至ph7.0，60℃保温转化1小时，获得全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物。经常规分析，测得其中各功能成分的含量见表2。将上述全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物进行均质，其条件为均质压力为20mpa，均质2次，获得均匀性溶液。对上述均匀性溶液进行灌装消毒，其条件为135℃，灭菌时间5秒，获得稳定的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物饮料，保质期可达18个月。表2全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物中功效成分含量(％)玛咖烯银耳多糖卵磷脂牛磺酸山药皂甙保温前0.172.630.250.010.16保温后0.323.510.310.020.38实施例6-银耳菌深层发酵、生物转化及片剂生产按玛咖粉15份、大豆粉3份、怀山药粉20份的比例混合搅拌均匀，获得固料，将该固料与60℃的水按1:1比例混合均匀，经115℃灭菌50分钟，获得银耳菌液态发酵的培养基；将该培养基冷却至室温，按1％的接种量接入种子液(即实施例1获得的银耳菌种子培养液)，混匀后装入转鼓式发酵罐，40℃发酵3天，获得银耳菌发酵物(玛咖和怀山药的银耳菌发酵组合物)；先用0.1摩尔/升的碳酸氢钠调ph至5.0，然后升温至50℃，保温处理5小时，再用0.1摩尔/升的碳酸氢钠调节ph至ph7.5，60℃保温转化1小时，获得全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物。经常规分析，其中各功能成分的含量见表3。将上述全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物，在55℃真空干燥并粉碎后获得颗粒剂；加入64％的组合物颗粒剂，18％蔗糖粉和6％糊精为填充剂，用10％的淀粉浆作粘合剂，经常规的粉碎、混合、制粒、干燥和压片等工艺制成玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物片剂。表3全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物中功效成分含量(％)玛咖烯多糖卵磷脂牛磺酸山药皂甙保温前0.413.560.150.0150.23保温后0.524.050.210.0260.37实施例7-银耳菌深层发酵、生物转化产物分离将玛咖粉60克、大豆粉8克、怀山药粉25克混合搅拌均匀装入2升玻璃式发酵罐，加入1升30℃的纯净水，经121℃灭菌30分钟，冷却至室温，获得银耳菌液态发酵培养基；按8％的接种量接入种子液，混匀后，30℃发酵12天，获得银耳发酵物(玛咖和怀山药的银耳菌发酵组合物)；先用0.1摩尔/升的碳酸氢钠调ph至4.5，然后升温至55℃，保温处理3小时，再用0.1摩尔/升的碳酸氢钠调节ph至ph7.0，60℃保温转化1小时，获得全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物。将上述全价玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物冷却至10℃，加入3倍体积的无水乙醇,4℃放置8小时，经5000转/分钟离心分离20分钟，获得沉淀(i)和上清液(ii)。将上清液(ii)以0.1摩尔/升的盐酸调节ph至3，4℃放置10小时，经6000转/分钟离心分离15分钟，获得沉淀(iii)和上清液(iv)。常规分析方法，沉淀(i)中含有粗多糖3.62％；沉淀(iii)中含有大豆卵磷脂0.85％和皂甙0.67％，上清液(iv)中含有牛磺酸0.03％、玛咖烯类0.72％。实施例8-银耳发酵的玛咖和怀山药组合物冲剂的改善肺部功能试验1、实验样品：实验样品为本发明实施例4制得的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物冲剂(简称组合物冲剂)，甘草酸二铵为阳性对照，无水葡萄糖为空白对照。2、小鼠造模、动物分组及给药。实验动物昆明大鼠60只，随机进行分组，共6组，分别为：空白对照组，模型对照组(未给药)、阳性对照组(甘草酸二铵)、组合物冲剂高剂量组、组合物冲剂中剂量组及组合物冲剂低剂量组。饲养3天后，除空白对照组外，所有模型组，大鼠气道内滴注博莱霉素致肺纤维化模型。对照组以等量的生理盐水代替博莱霉素气管内滴注。甘草酸二铵组和组合剂组于造模后第28天开始，分别给已制成的肺纤维化动物模型连续14天灌胃甘草酸二铵150mg/kg每天。按低、中、高剂量组分别灌胃组合物冲剂25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，连续用药30天,记录引咳潜伏期和3min内的咳嗽次数。3、检测指标及方法3.1普通病理观察肺组织常规染色。肺组织切片肺泡炎按khalin标准判断。一：无肺纤维化；+：轻度肺纤维化，受累面积少于全肺20％；++：中度肺纤维化，受累面积占20％～50％；+++：重度肺纤维化，受累面积大于50％，肺泡结构紊乱。3.2肺免疫组化检测和大鼠血清tgf-β1、il-4、ifn-γ的测定采用双抗体夹心eusa法，按试剂盒说明书进行。4、实验结果见表4、表5结果表明：(1)组合物冲剂组与甘草酸二铵组大鼠肺纤维化程度均较轻微，但高剂量组合物组纤维化程度更低；(2)模型组大鼠肺组织tgf-β1染色呈强阳性反应，ifn-γ染色较淡，而组合物冲剂组与甘草酸二铵组tgf-β1、ifn-γ染色及定量表达则相反；(3)模型组大鼠血清tgf-β1、il-4含量较高，ifn-γ含量较低；而组合物冲剂组与甘草酸二铵组则相反。结论：组合物冲剂组可以下调大鼠肺组织tgf-β1、il-4的表达，降低其血清含量；上调肺组织ifn-γ的表达，增加其血清含量，从而减轻肺纤维化。表4银耳发酵的玛咖和怀山药组合物(冲剂)对肺纤维分级影响(％)注：与空白对照组相比，p<0.05；p<0.01表5各组大鼠血清tgf-β1、il-4和ifn-γ含量(x±s。pg/ml。n-10)注：与空白对照组相比，p<0.05；p<0.01实施例9-银耳发酵的玛咖和怀山药组合物的抗疲劳试验1、样品样品为本发明实施例5制得的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物饮料(简称组合物饮料)；对照-纯净水。2、小鼠抗疲劳试验2.1材料与对象(1)实验动物：spf级昆明种雄性小鼠120只，5周龄，体重18.22g，由上海斯莱克实验动物中心提供，按实验组分笼饲养；同时购买基础饲料，适应性饲养l周后进行实验。2.2实验方法2.2.1动物预处理将小鼠随机分成安静组、迷宫组和游泳训练组，各组又分别设口服组合物饮料组和对照组。组合物饮料组小鼠除用基础饲料喂养外，每日以组合物饮料10g/kg体重灌胃，连续4周。对照组小鼠喂以基础饲料并以与组合物饮料组等体积的生理盐水灌胃，小鼠自由摄水和食物。训练组进行4周的游泳训练，水温(30土2)℃。第1周每天游泳为30分钟；以后每周递加10分钟。2.2.1耐缺氧实验每组10只小鼠，末次灌胃后放人250ml密封的广口瓶中，观察安静组及经训练后各组小鼠存活时间。2.2.2游泳实验每组15只小鼠。训练组与安静组小鼠在进行4周灌胃后，进行1次无负重的力竭性游泳，记录各自游泳时间。力竭判断的标准为：小鼠沉入水中超过10s，且放在平面上无法完成翻正反射。2.2.3统计学处理实验数据应用spss10.0统计软件进行单因素设计的方差分析。2.3组合物饮料对小鼠记忆力、游泳与耐缺氧时间的影响表6看出，与对照组相比，组合物饮料组走迷宫时间平均缩短38.3％，提示其有增强小鼠记忆的作用。表6组合物饮料对小鼠走迷宫的影响(秒)组别时间(n＝15)对照组196±51组合物饮料组121±57从表7可见，小鼠给予组合物饮料及训练后，其游泳至力竭时间和耐缺氧时间均明显延长。加组合物饮料组与安静对照组相比，游泳时间和耐缺氧时间均有显著性差异(p<0.01，p<0.05)；训练组与加组合物饮料组比较，力竭游泳时间有非常显著性差异(p<0.01)；而训练加组合物饮料组小鼠游泳时间及耐缺氧时间与训练对照组比较也均有显著性差异(p<0.01，p<0.05)，表明组合物饮料可显著提高机体的运动能力。表7组合物饮料对小鼠游泳与耐缺氧时间的影响(分钟)上述实验结果表明：本发明的玛咖和怀山药的银耳菌生物转化组合物饮料，能增强小鼠记忆能力，提高小鼠耐缺氧能力，具有一定的抗疲劳作用。以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12