抗松材线虫病黑松体胚再生植株高效繁殖技术的制作方法

本发明涉及黑松体胚高效繁殖技术，具体涉及一种抗松材线虫病黑松体胚再生植株高效繁殖技术。技术背景松材线虫病(pinewiltdisease)，是由松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)引起的发生在松属树种上的一种毁灭性森林病害，具有易传播、发病快、防治难等特点，被称为松树的癌症。松材线虫病自1982年传入中国以来，给我国松林造成了巨大的损失。我国对该病施行了一系列的防治措施，取得了一定的防治效果，但由于该病发病机制复杂，致病力强，寄主死亡迅速等原因给治愈该病害带来了极大的困难。近年来松材线虫病在我国的扩散趋势越来越明显，现已成为我国一种重要检疫入侵病原生物。黑松(pinusthunbergii)，属于松科，松属，原产日本及朝鲜半岛东部沿海地区，因其耐海雾，抗海风，抗病虫能力强，可在海滩盐土地方生长，适生于温暖湿润的海洋性气候区域，在我国山东、江苏、安徽、浙江、福建等沿海诸省普遍栽培，是荒山造林，道路行道绿化首选树种。然而黑松是松材线虫病的高度感病树种，我国黑松林的健康发展受到松材线虫病的严重威胁。培育具有抗松材线虫病的松树品种，逐步替代易感病的松树品种，是提高松树抗性品质、保存松树资源、从根本上抵御松材线虫病危害的有效途径。日本从1978年对全国部分地区严重感病的黑松林分进行抗病选育工作，经多年抗性单株选择、穗条嫁接并进行两次人工接种松材线虫，取得了富有成效的结果。2004年，江苏省入侵有害生物预防与控制重点实验室从日本引进了抗松材线虫病黑松种子。同年，在南京建立抗松材线虫病黑松优良基因资源库。然而由于松属树种生命周期长，种子的结实率低，采用常规的有性繁殖方法进行树种改良往往要花费很长的时间，传统的无性繁殖方法如扦插生根或针叶束生根进行繁殖对松树而言亦相当困难。组织培养器官发生方法对松属树种来说又具有植株生根困难、繁殖率低等问题，组织培养体细胞胚发生方式具有繁殖周期短，繁殖率高，结构完整、再生率高等优点，是松属树种高效繁殖的最理想途径，然而目前黑松体胚发生未成熟合子胚诱导体胚成功率极低，尚不能满足生产应用需求，因此，应用组织培养的方法快速繁殖优良抗病无性系，是将抗病基因的优良个体和家系扩大应用于林业生产的重要途径。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗松材线虫病黑松体胚再生植株高效繁殖技术，利用抗病黑松未成熟种子胚性细胞所具有的不断裂生能力，通过固体增殖培养、经过维持与增殖、体胚发育成熟培养3个阶段，使胚性细胞形成发育完整、结构正常的体细胞胚，经萌发培养后形成再生植株，建立抗病黑松体细胞胚植株再生高效繁殖体系。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：抗松材线虫病黑松体胚再生植株高效繁殖技术，包括以下步骤：(1)抗病黑松胚性细胞团诱导：每年6-7月份采集抗病黑松未成熟球果，采集后将未成熟球果置于4℃预处理6-8天，预处理结束后将未成熟球果的珠鳞剥离后取出种子，将种子灭菌后在无菌条件下取出未成熟合子胚水平置于诱导培养基上，在25℃条件下暗培养60天，诱导获得胚性细胞团；(2)抗病黑松胚性细胞团维持与增殖：将直径大于3mm的胚性细胞团在无菌条件下转入固体增殖培养基，在25℃条件下暗培养，胚性细胞团在固体增殖培养基上稳定增殖后，将1g/l的胚性细胞团移入液体增殖培养基，在25℃、摇床转速为90r.p.m的条件下进行大量增殖暗培养，得到分散型胚性细胞；(3)抗病黑松胚性细胞团成熟培养：将在液体增殖培养基上培养的分散型胚性细胞转移至无菌滤纸上，平铺到成熟培养基上，在25℃的条件下暗培养60天，得到发育成熟的体细胞胚；(4)抗病黑松体胚萌发和植株再生：将发育完整的成熟体细胞胚水平放置萌发培养基上，在弱光下生长6-8天，放入完全光照下生长30天，得到萌发的体细胞胚，将萌发的体细胞胚转入体胚苗生长培养基，进行再生植株壮苗，光照培养60天，将根长大于3cm的再生植株进行移栽，半年后成活率为85％～88％。所述步骤(1)中诱导培养基的组成为：dcr培养基+2,4-d4mg/l+6-ba2mg/l+谷氨酰胺0.5g/l+水解络蛋白0.5g/l+肌醇1g/l+麦芽糖30g/l+琼脂5.2g/l。所述步骤(2)中固体增殖培养基的组成为：dcr培养基+2,4-d2mg/l+6-ba1mg/l+谷氨酰胺0.5g/l+水解络蛋白0.5g/l+肌醇1g/l+麦芽糖15g/l+琼脂5.2g/l。所述步骤(2)中液体增殖培养基的组成为：dcr培养基+2,4-d0.6mg/l+6-ba0.2mg/l+谷氨酰胺0.5g/l+水解络蛋白0.5g/l+肌醇1g/l+麦芽糖15g/l。所述步骤(3)中成熟培养基的组成为：lp培养基+aba10mg/l+谷氨酰胺1g/l+聚乙二醇130g/l+肌醇1g/l+麦芽糖30g/l+植物凝胶4g/l。所述步骤(4)中萌发培养基的组成为：1/2lp培养基+麦芽糖20g/l+琼脂4g/l。所述步骤(4)中体胚苗生长培养基的组成为：1/4wpm培养基+蔗糖20g/l。本发明具有有益效果：本发明以抗病黑松未成熟合子胚为外植体，利用不同培养基成功建立了一种高效繁殖黑松体胚再生植株的方法且移栽成活，获得再生植株的萌发率77％-84％，植株转化率82％-91％，半年的移栽成活率达到85％以上，本发明针对当前抗松材线虫病黑松种质资源有限，繁殖相对困难的现状，为快速生产大批高质量苗木，满足林业生产对抗病黑松种苗造林的需求提供一种有效途径。附图说明图1为外植体的获取及处理示意图，图1中a：未成熟的抗病黑松球果，b:未成熟的抗病黑松种子，c:诱导培养基中的外植体；图2为黑松合子胚不同发育阶段示意图；图3为抗病黑松胚性细胞团诱导示意图，图3中a：胚性细胞喷出，b：胚性细胞团，c：非胚性愈伤组织；图4为抗病黑松胚性细胞团维持与增殖示意图，图4中a：转入固体增殖培养基中，b：转入液体增殖培养基中，c：胚柄规律排列；图5为抗病黑松体细胞胚胎发育示意图，图5中a-h为体细胞胚胎按顺序发育进程示意图；图6为体胚苗萌发与植株再生，图6中a、b为萌发体胚苗，c、d为再生植株壮苗，e、f为移栽再生植株；具体实施方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。1.抗病黑松胚性细胞团诱导1.1抗病黑松外植体材料的获取抗病黑松未成熟球果采自抗松材线虫病黑松优良家系基因资源库，选取抗性较强的树木为母树，6月到7月每周采集1次，采集后保存于4℃冰箱备用。将抗病黑松未成熟球果(如图1a所示)的珠鳞剥离后取出种子(如图1b所示)，放入广口瓶中用无菌水洗涤干净，转入灭菌的小三角瓶中，在超净工作台上用无菌纱布包好，75％乙醇进行表面消毒30s，再用0.1％hgcl2灭菌30s～3min，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸去种子表面多余的水分，最后用镊子剥去种壳和内种皮，取雌配子体水平放置于诱导培养基上(如图1c所示)，每皿接种3～5个，用封口膜封住培养皿，对于那些还不能剥掉内种皮的幼嫩种子,则连同内种皮一起接种，暗培养60天，进行抗病黑松胚性细胞的诱导。1.2抗病黑松未成熟合子胚发育阶段检测与观察，确定合子胚发育进程从各个采集期中随机抽取黑松球果，剥出未成熟合子胚，在体式显微镜(leicamz16)下观察合子胚的发育阶段并拍照记录。经过两年的试验研究发现黑松的发育过程需经过以下八个阶段(如图2所示)：第1阶段(图2a)合子胚无明显胚头为多胚发育阶段，胚柄为长形的高度液泡化透明细胞。第2阶段(图2b)胚头胞质浓厚逐渐形成圆柱状较不透明，胚柄透明。第3阶段(图2c)合子胚胚头发育成圆筒状，顶部圆形不透明，胚柄逐渐增粗并开始萎缩。第4阶段(图2d)合子胚明显可见仅有一个胚体伸长生长，胚柄缩成细长的柱状体，胚体较不透明。第5阶段(图2e)合子胚胚头端可见突起的顶端分生组织，形似子弹头状，不透明的胚体迅速增大增粗。第6阶段(图2f)合子胚胚头端子叶组织发育，子叶原基开始显露，并逐渐伸长。第7阶段(图2g)子叶逐渐形成且闭合，高过顶端分生组织。第8阶段(图2h)子叶已形成，相互间可见明显的缝隙，形态上已形成明显的子叶、胚轴、胚根部分。1.3以未成熟合子胚为外植体诱导胚性细胞团发生，明确了适合于胚性细胞团诱导的合子胚发育阶段抗病黑松合子胚的胚性细胞团诱导与合子胚发育阶段关系密切。明确抗病黑松在各采集期的发育阶段(如表1所示)，能够有效的提高黑松胚性细胞团的诱导率。在抗病黑松胚性细胞团的诱导中，球果采集时间与抗病黑松胚性细胞团诱导率有较大的关联，实验研究表明，抗病黑松每年在6月20日～7月4日之间未成熟合子胚处于多胚期，是诱导抗病黑松胚性细胞团的最佳时期。诱导胚性细胞团的时间约为60天，25℃条件下暗培养。表1合子胚发育阶段对抗病黑松胚性细胞团诱导的影响本发明以1号培养基作为抗病黑松胚性细胞团的诱导培养基。外植体接种至诱导培养基上，10～30天，不断有呈粘稠、半透明状或微黄从珠孔处喷出的胚性细胞团逐渐在培养基上扩展。这种呈粘稠、半透明状或微黄的胚性细胞团在适当的增殖培养基上能稳定增殖并在后期培养中发育形成体细胞胚(如图3a、b所示)。少数呈黄褐色或淡黄色，质地致密且表面偏硬的非胚性细胞团，在随后的培养中不能发育形成体细胞胚(如图3c所示)。2.抗病黑松胚性细胞团的维持与增殖胚性细胞团在诱导培养基上生长直径大于3mm时需及时转入2号增殖培养基(如图4a所示)中进行维持培养，25℃、暗培养，继代周期为2周。胚性细胞团在2号维持培养基上稳定增殖后转入3号增殖培养基上进行胚性细胞团的扩繁(如图4b所示)。培养细胞的初始密度为3.33％(m/v)，摇床转速为90rpm，25℃、暗培养。3号培养基培养周期为7天。维持与增殖阶段，固体培养的主要目的是维持培养物的胚性和扩大培养物基数；液体培养的主要目的是提高培养物的增殖速率，调节培养物的同步化发育。在液体培养阶段，要严格将摇床转速、温度和增殖培养时间控制在规定的范围内。在液体培养条件下，经过更换培养液2到3次的继代培养，胚性细胞呈现胚头细胞质更浓密，胚柄呈现有规律排列(如图4c所示)。3.抗病黑松体胚成熟体细胞胚的成熟主要反映在体细胞胚在生理学和形态学上具有正常萌发和发育的能力，将增殖阶段发育良好的胚性细胞团转移至适合的成熟培养基后，原胚细胞团逐渐向体细胞胚发育并最终形成成熟的体细胞胚。早期原胚细胞团向体细胞胚的转变在原胚细胞团增殖和组织化的胚胎发育中扮演着重要的过渡和衔接作用，同时该阶段又是相对独立的过程。有研究显示，许多胚性细胞系后期难以形成发育良好的体细胞胚，在很大程度上和早期原胚团向体细胞胚的转变能力的紊乱或丧失有关。能够完全形成成熟的体细胞胚的原胚团在早期胚性细胞系中所占的比例通常很低。本发明利用成熟培养基获得了较多的成熟子叶胚，攻克了松属树种产胚率低的难题。具体操作：利用液体增殖培养基获得了形态上较一致的悬浮细胞，用移液枪吸取1ml悬浮细胞在无菌滤纸上平铺于4号成熟培养基上。体胚成熟培养在25℃，暗培养，时间控制为40到60天。培养过程中不要经常观察以免培养物见光影响体胚发育。经过近2个月的培养，体胚完成形态和生理成熟，形成具有子叶，胚轴和胚根的完整结构的成熟子叶胚。如图5可见，抗病黑松在体细胞胚胎发生过程中与合子胚成熟呈现极为相似的发育进程，这也间接体现了获得的体细胞胚的质量较高。目前国内还未有关于抗病黑松体细胞胚发生的研究报导。本发明使用成熟培养基于胚性细胞系的成熟培养试验，结果如表2所示：胚性细胞系在成熟培养基上均获得了较高数量的成熟体细胞胚，胚性细胞系每皿最高可获得500以上成熟体胚。该发明方法获得的成熟体细胞胚较先前黑松体胚发生体系报导有了较大的提高，基本克服了胚性细胞团产胚率低的问题。表2抗病黑松胚性细胞系出胚情况4.抗病黑松体胚萌发和植株再生将诱导产生的黑松成熟体胚置于萌发培养基上进行萌发，非直射光培养6-8d左右，再放入直射光下培养30d左右，观察体胚的萌发状况，统计萌发率。将萌发的体细胞胚转入体胚苗生长培养基，进行再生植株壮苗，光照培养2个月。体细胞胚在萌发培养基上暗培养6-8d后，体胚子叶由白色变为黄色变为淡绿色，光照后子叶呈墨绿色，逐渐张开；胚轴伸长；基部有微小红色根尖(如图6a所示)。待萌发的体胚苗生长出具有根、茎、叶的再生植株后(如图6b所示)，将再生植株转入体胚苗生长培养基以促进再生植株的进一步生长(如图6c所示)，经过两个月的壮苗，将根长大于3cm(如图6d所示)的再生植株移栽，半年后再生植株移栽成活率为85％-88％(如图6e、f所示)。目前关于松属树种体细胞胚发生的研究大多都还处理实验室研究阶段，对再生植株进行野外移栽处于国际领先水平，如表3所示，本发明方法获得再生植株的萌发率77％-84％，植株转化率82％-91％。日本学者torutaniguchi对抗病日本黑松的体细胞胚研究发现，萌发率为6％-28％，未提到再生植株转化及移栽成活情况。2012年李清清第一次在国内报道了黑松体细胞胚发生和植株再生体系，体细胞胚的萌发率为43.8％-63.8％，植株转化率为33.3％-43.5％，未提到再生植株移栽成活情况，目前国内还未有关于抗病黑松体细胞胚再生植株移栽的研究报导。本发明为抗松材线虫病黑松优良基因材料的快速繁殖提供了一条高效的途径，不仅有利于抗病黑松的优良基因资源的保存，而且对于加速抗病黑松优良材料的繁殖，提供大量遗传基础一致的黑松种植材料，为缓解抗松材线虫病黑松苗木造林的迫切需求，提供了一条周期短，效率高，成本低的苗木生产技术。表3抗病黑松体细胞胚的萌发率和植株转化率试验体胚数(个)萌发率(％)植株转化率(％)53779.5291.3352183.3086.8751776.6087.6351079.8082.8049184.3290.34本实施例中，诱导培养基的组成为：dcr培养基+2,4-d4mg/l+6-ba2mg/l+谷氨酰胺0.5g/l+水解络蛋白0.5g/l+肌醇1g/l+麦芽糖30g/l+琼脂5.2g/l；固体增殖培养基的组成为：dcr培养基+2,4-d2mg/l+6-ba1mg/l+谷氨酰胺0.5g/l+水解络蛋白0.5g/l+肌醇1g/l+麦芽糖15g/l+琼脂5.2g/l；液体增殖培养基的组成为：dcr培养基+2,4-d0.6mg/l+6-ba0.2mg/l+谷氨酰胺0.5g/l+水解络蛋白0.5g/l+肌醇1g/l+麦芽糖15g/l；成熟培养基的组成为：lp培养基+aba10mg/l+谷氨酰胺1g/l+聚乙二醇130g/l+肌醇1g/l+麦芽糖30g/l+植物凝胶4g/l；萌发培养基的组成为：1/2lp培养基+麦芽糖20g/l+琼脂4g/l；体胚苗生长培养基的组成为：1/4wpm培养基+蔗糖20g/l。当前第1页12