本申请要求2016年2月2日提交的美国临时申请号62/290,318和2016年9月21日提交的美国临时申请号62/397,790的权益。
序列表的引入
在此将序列表提供为2017年1月31日创建的标题为“用于控制蚂蚁的方法和组合物_ST25.txt”的文本文件，其大小为52KB。文本文件的内容全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明包括用于RNA介导的基因抑制的方法和组合物来作为一般控制蚂蚁并特别是红火蚁(火蚁)、宾夕法尼亚弓背蚁和佛罗里达弓背蚁(木蚁)、阿根廷蚁(阿根廷蚂蚁)、酸臭蚁(有气味的蚂蚁)、铺道蚁(路面蚂蚁)和小家蚁(法老蚁)的方式。所述方法和组合物可适用于控制这种蚂蚁的增殖，而不会对相关昆虫、植物或动物物种造成相应影响。
背景技术：
最初在秀丽隐杆线虫中描述的RNA介导的基因抑制(RNAi)已被证明是用于调节许多其它生物中的基因表达的有效方法(Fire等人，《双链RNA在秀丽隐杆线虫中的有效且特定的基因干扰(Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans)》，《自然(Nature)》，第391期，第806页(1998年))。许多研究小组已经使用双链RNA(dsRNA)证实RNAi在控制影响作物的昆虫的增殖方面的可行性(综述于Ivashuta等人，《食草昆虫中的环境RNAi(Environmental RNAi in herbivorous insects)》，《RNA》，第21期，第840页(2015年)中)。用于现有技术中描述的RNAi目的的重组RNA构建体一般由具有约18到约25个碱基对的dsRNA组成，但也包括通常在约100到约1,000个碱基对(bp)之间的较长dsRNA。为了成功地将dsRNA引入昆虫体内，当在昆虫饮食中进行供应时，需要长于或等于约60个bp的dsRNA才能进行有效摄取(Bolognesi等人，《在西方玉米根虫幼虫肠细胞(西方玉米根叶甲)中由Snf7RNAi引起的超微结构变化(Ultrastructural Changes Caused by Snf7RNAi in Larval Enterocytes of Western Corn Rootworm(Diabrotica virgifera virgifera Le Conte)，《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》，第7期，第e47534页(2012年))。通过宿主Dicer酶复合物在体内将长的dsRNA分子切分裂成多种多样的siRNA种群。或者，RNAi基因抑制也可经由相关过程通过针对特定序列的反义RNA的动作发生。用于控制田间昆虫的RNAi方法的实际应用受到体外RNA合成的成本和RNA对环境和酶促降解的化学脆性的限制。
毒素和成像剂的噬菌体MS2衣壳介导的递送已被证明是在体外将这种试剂递送到真核细胞的有效方法(Ashley等人，《通过噬菌体MS2病毒样颗粒对多种多样的货物的特定于细胞的递送(Cell-specific delivery of diverse cargos by bacteriophage MS2virus-like particles)》，《美国化学学会纳米(ACS Nano)》，第5期，第5729页(2011年))。尚不清楚这种噬菌体衣壳是否可能起向田间昆虫递送RNAi前体的类似功能的作用。将RNAi前体有效地递送到靶标昆虫体内需要防止非特异性RNA降解、简易施用途径、以及在靶标昆虫体内的适当位点处释放RNAi前体以使得RNAi前体可被昆虫细胞摄取并适当地加工的能力。理想地，RNAi前体和递送系统必须在生产和分配方面是经济且相对简单的。在此所述的发明满足所有这些标准，并且还附加了允许快速发现、原型制作和对新的RNAi分子的商业规模生产的益处。
已知火蚁属易受通过直接注射(Lu等人，《卵黄蛋白原受体的卵母细胞膜定位与雌性蚁王年龄一致，并且通过RNAi的受体沉默破坏处女火蚁蚁王体内卵子形成(Oocyte membrane localization of vitellogenin receptor coincides with queen flying age,and receptor silencing by RNAi disrupts egg formation in fire ant virgin queens)》，FEBS Journal 276 3110(2009))或通过饲喂(M.-Y.Choi等人，《PBAN RNA干扰对蚂蚁、即红火蚁和蛾子即棉铃虫的表型影响(Phenotypic impacts of PBAN RNA interference in an ant,Solenopsis invicta,and a moth,Helicoverpa zea)》《昆虫生理学杂志(Journal of Insect Physiology)》，第58期，第1159页(2012年))用RNAi前体来加工的诱饵材料而引入的RNAi影响。然而，由于RNA对特定于环境的降解和非特异性降解的敏感性，裸露RNA的现场应用一般是不切实际的。另外，RNA在饲喂和通过昆虫肠道的过程中极易降解。两个问题对于单链RNAi前体(例如反义RNA)尤其如此。高度稳定的形式的VLP用于在体外保护VLP内的RNA，但是尚不清楚VLP用作反义RNA和RNAi前体的递送系统的能力。其它问题包括：RNAi是否有效抑制除火蚁属以外的蚂蚁物种的生长或集落形成？靶标RNAi组合物可否区分蚂蚁物种？可否组合RNAi或反义RNA组合物以使得一种RNAi组合物可以靶向火蚁属、同时省去其它蚂蚁物种，而另一RNAi组合物可能靶向弓背蚁属、同时省去其它蚂蚁物种？VLP可否有效地将RNAi前体递送到一般是蚂蚁并特别是火蚁和弓背蚁属的RNAi加工途径，例如Dicer？VLP可否保护昆虫消化道内的反义RNA并仍将完整反义RNA递送到靶标昆虫的细胞中？可否有效地配制裸露RNAi前体以允许靶标蚂蚁物种直接摄取？
技术实现要素：
所公布的美国专利申请号2013/0167267、2014/0302593和美国专利号9,181,531中描述了在噬菌体衣壳(VLP)内产生、包装和/或纯化RNA的方法，上述文献各自内容以引用的方式并入本文。在此所述的发明使用VLP的唯一性质(或者称为APSE RNA容器，或“ARC”)来提供用于产生和递送RNAi前体以抑制优选地在昆虫宿主中、更优选地在蚂蚁中的靶标基因的表达的改进系统。用于RNAi的dsRNA的优选形式是作为单一转录RNA产生的发夹siRNA，发夹siRNA包括由非同源环序列分隔的靶标宿主序列的反向重复，使得通过使同源重复序列退火来允许由宿主DICER和DICER样酶对dsRNA区域进行适当加工而产生dsRNA形式。特别感兴趣的靶标生物是红火蚁(俗称红色火蚁)和宾夕法尼亚弓背蚁和佛罗里达弓背蚁物种(俗称木蚁)、阿根廷蚁(俗称阿根廷蚂蚁)、小家蚁(俗称法老蚁和家中蚂蚁，例如酸臭蚁(俗称有气味的蚂蚁))和铺道蚁(俗称路面蚂蚁)。感兴趣的靶标基因编码聚集体中存在的单独蚂蚁或蚁群生存所需的基本生理功能。尤其期望控制火蚁、木蚁、阿根廷蚂蚁、法老蚁以及各种家中蚂蚁的RNAi方法，因为这些蚂蚁是经济和生态破坏的主要来源。
通过本文所述的方法来产生RNAi前体的重要优点是避免昂贵且复杂的RNA前体的体外合成，并且可以通过简单且经济的发酵方法来生产所期望的RNA构建体。通过任选地将所期望的多核苷酸的合成与自组装噬菌体衣壳蛋白(例如，噬菌体Qβ或MS2的那些)的表达偶联以产生含有所期望的多核苷酸的容易纯化且相对稳定的ARC(VLP)来促成大量RNAi前体的产生和纯化，容易纯化且相对稳定的ARC可以直接地(例如，通过喷雾)施用于靶标害虫所进食的植物表面。或者，衣壳化的单链RNA可以稳定且大量地产生并与其它衣壳化的单链RNA共混，以产生每个链的所期望的摩尔比和通过去除病毒衣壳外壳蛋白并使RNA的单链退火成所期望的双链RNA产物而隔离的单独RNA链。另外，衣壳化的单链RNA可以用作反义RNA的源。
一旦摄入，ARC可以在通过昆虫宿主肠道和由肠道内的细胞吸收的RNA分子的过程中被消化掉。在一些情况下，未衣壳化的双链RNA也可转录昆虫宿主肠道而不降解，并被肠道内的细胞吸收。然而，除非包装在ARC中，否则所有RNA物种、尤其是单链RNA都将无法避免显著降解。在靶材昆虫细胞内，RNAi前体除其它外通过宿主Dicer酶复合物加工以产生靶向宿主基因转录物的有效RNAi形式来抑制必要宿主基因的表达。这种必要基因实例包括但不限于参与控制蜕皮或其它幼虫发育事件的基因、肌动蛋白或其它细胞结构组分，以及实际上与复制、转录或翻译或活力所需的其它基本过程有关的任何基因。另外，维持集落完整性但不一定对集落的单独成员致死所必需的基因也可能被认为是必要的，并且表示针对蚂蚁种群的长期控制的有吸引力的目标。
具体实施方式
本发明包括DNA序列，DNA序列在转录时产生RNAi前体和翻译成噬菌体外壳蛋白的mRNA，它们一起被组装成独特地稳定的VLP或可以被加工以产生经隔离的RNA。VLP和/或RNA可以以适于通过饲喂昆虫进行摄取的形式纯化。一旦被靶标昆虫所摄入，VLP和RNA通过肠道并然后被同化到昆虫细胞中，其中RNAi前体被加工成RNAi形式，其抑制了对昆虫活力重要的靶标基因的表达。在一些实施例中，对这种靶标基因的抑制被设计成造成靶标昆虫死亡。在另一实施例中，对靶标基因的抑制被设计成以产生无菌后代。在其它实施例中，对靶标基因的抑制造成集落崩溃。这些实施例中的每个可以单独地或组合地使用以产生所期望的结果。VLP的关键特征是它们足够稳定以保护衣壳化RNAi前体免于因非特异性环境动因或昆虫靶标细胞RNA酶而降解，但仍能够将RNAi前体在它们被摄入之后引入靶标昆虫细胞中的RNAi途径中。
在此呈现的示例DNA序列被设计成连接到合适细菌质粒载体中作为AsiSI-NotI限制性片段。这种DNA序列可通过直接合成或通过使用本领域的技术人员所熟知的技术对组分片段亚克隆来产生。可根据需要来修饰序列以操纵特定限制性酶位点并结合可选噬菌体pac序列。可修饰经编码的反义RNA和RNAi序列的特异性以靶向不同的基因和昆虫宿主。含有能够诱导性转录这些DNA序列的转录启动子的细菌质粒载体包括但不限于噬菌体T7基因1启动子、噬菌体T5启动子和噬菌体λPL和PR启动子。细菌质粒载体(例如pBR322、pUC衍生物和pACYC衍生物)也可含有由诱导性启动子表达的噬菌体Qβ或噬菌体MS2衣壳蛋白编码序列。为了在除细菌(例如大肠杆菌)以外的生物系统中表达，等同载体是本领域的普通技术人员已知的。或者，这种诱导性表达的衣壳基因可以存在于与携带诱导性RNAi前体或反义RNA编码序列的细菌质粒相容的单独细菌质粒上。这种RNAi或反义RNA分子可被称为“RNA货物分子”。在实施了中，诱导性表达的衣壳基因可以整合到细菌染色体中。
含有RNA货物分子的VLP的产生和纯化在美国专利申请号2013/0167267、2014/0302593和美国专利号9,181,531中详细地描述。这种方法还描述于美国专利申请号2010/0167981、2012/0046340、PCT/US12/71419和PCT/US14/41111、以及美国专利号5,443,969和6,214,982，上述文献各自内容以引用的方式并入本文。通过这些方法而产生的VLP可以以本领域的普通技术人员已知的许多不同的方式加工来促进将这种材料应用于本领域中。在一个实施例中，经纯化的ARC进一步被加工以用于喷洒操作。在另一实施例中，经纯化的ARC或与其隔离的RNA被加工成诱饵物质。这种加工可以包括喷雾干燥、稳定剂或润湿剂的引入、或在施用之前形成VLP与其它所期望的试剂的掺和物。现场施用可能涉及地面或空中喷洒方法、定点施用或掺入、以及掺入到诱饵材料中。
本领域的普通技术人员理解的是，通过修饰以下实例中描述的序列以反映其它靶标生物中的其它基因的序列，本发明可靶向不同昆虫宿主中的不同基因。因此，本发明提供了用于确定抑制任何给定靶标生物中的特定基因的最佳RNAi靶标的工具和用于产生靶向那些基因的大量RNAi的手段。另外，本发明提供了通过用组合克隆方法来筛选含有靶向特定基因或基因组合的各种RNAi前体的VLP或RNA的有效性，凭经验来确定哪个基因或基因群组可构成单个昆虫或昆虫群组内最有效的RNAi靶标的方法。本发明还支持将有效控制田间某些昆虫的VLP与有效控制可能存在的其它昆虫的不同VLP组合的方法以使昆虫控制性质适应于在施用位点处相关的那些。不同昆虫可以具有与原始VLP或RNA所靶向的那些不同的顺序、属或物种，或可以包括RNAi耐受性种群或RNAi耐受性种群组合，其中靶向靶标昆虫种群体内的不同基因的一种或多种VLP或RNA的组合确保不会出现RNAi耐受性的组合。
在本发明的一个实施例中，细菌宿主内的第一DNA序列被转录以产生第一RNA分子，第一RNA分子编码噬菌体外壳蛋白。细菌宿主内的第二DNA序列被转录以产生第二RNA分子，第二RNA分子包括噬菌体pac位点、接着是来自昆虫的靶标基因的有义序列、然后是能够形成单链的非同源环RNA序列、随后是与靶标基因序列的有义序列互补的反义序列、任选地之后是第二噬菌体pac位点的第二RNA分子。单个噬菌体pac位点可以存在于第二RNA分子的5'侧，或可存在于第二RNA分子的3'侧，或可定位于第二RNA分子的非同源环序列内。第一RNA分子是由细菌宿主翻译以产生多个噬菌体外壳蛋白的mRNA，当与包括噬菌体pac序列的第二RNA分子物理地相关联时，噬菌体外壳蛋白自发地形成VLP，其中第二RNA分子包装在VLP内。VLP在现场施用之前根据需要被隔离并进一步进行纯化。或者，裸露RNA与VLP隔离或直接地与细菌宿主隔离并且被加工以现场施用。摄取裸露RNA或含有RNAi前体的VLP的靶标昆虫将RNA分子(无论是否在VLP内)引入它们肠道内的宿主昆虫细胞中。一旦在宿主昆虫细胞中，RNA可通过宿主昆虫细胞的内源性RNAi途径加工，或可直接地用作反义RNA，从而造成对宿主昆虫靶标基因的基因表达的反义RNA或RNAi介导的抑制。在一个实施例中，昆虫是蚂蚁。在其它实施例中，蚂蚁是火蚁属。在优选实施例中，火蚁属是红火蚁。在其它实施例中，蚂蚁是弓背蚁属。在优选实施例中，弓背蚁属是宾夕法尼亚弓背蚁。在另一优选实施例中，弓背蚁属是佛罗里达弓背蚁。在其它实施例中，靶标蚂蚁是阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁。在一些实施例中，可使RNAi靶向所有这种蚂蚁物种或这种蚂蚁物种的任何特定组合。
在实施例中，隔离含有编码噬菌体外壳蛋白的第一DNA序列和编码各种RNAi前体序列的不同第二DNA序列的一系列的宿主细菌。每个经分离的宿主细菌克隆地扩增并且细菌细胞系存档。每个细菌细胞系的样本随后过度生长并被诱导来转录第一DNA序列和第二DNA序列，VLPS被允许在宿主细菌内组装并且VLP与之隔离。所得VLP系列内的RNA序列各自对不同的反义序列和任选地与不同昆虫靶标基因同源或在给定昆虫靶标基因的不同区域或在来自不同昆虫靶标的靶标基因上互补有义序列一起进行编码。将由一系列的宿主细菌产生的不同VLP中的每者饲喂给靶标昆虫，并且例如通过对靶标昆虫死亡率进行评分来测量它们抑制宿主昆虫基因表达的能力。产生对基因表达的最大水平的RNAi介导的抑制的那些VLP表示该特定靶标昆虫或定位在给定靶标昆虫基因内的位置的最有效的RNA靶标。求助于产生每个VLP的对应的细菌细胞系允许快速地识别对应的靶标序列或基因。同样，求助于对应的宿主细菌细胞系促进快速地放大用于宿主昆虫靶标基因的基因表达的RNAi介导的抑制的所期望的VLP，义工用于现场应用或进一步的实验研究。本领域的普通技术人员要认识到，可以使用多重或自动化克隆技术来筛选用于基于昆虫基因组序列数据或编码可能必要的基因的这种基因组序列的子集的互补DNA序列的随机或伪随机集合。可以采用类似过程来分析每种RNAi候选物的靶标特异性以确保非靶标的蚂蚁(或其它昆虫物种)物种不因RNAi组合物受损。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码卵黄蛋白受体蛋白(VgR)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的VgR的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的VgR的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的VgR的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的VgR的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的VgR基因的表达。
在一个实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁端粒酶变体X1蛋白(TVX1)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的TVX1的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的TVX1的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的TVX1的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的TVX1的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的TVX1基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁信息素生物合成激活神经肽(PBAN)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的PBAN的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的PBAN的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的PBAN的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的PBAN的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的PBAN基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁信息素生物合成激活神经肽受体(PBANR)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的PBANR的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的PBANR的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的PBANR的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的PBANR的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的PBANR基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁wntless蛋白(WLS)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的WLS的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的WLS的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的WLS的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的WLS的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的WLS基因的表达。
在一个实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁多表皮生长因子样结构域蛋白10(MEGF10)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的MEGF10的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的MEGF10的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的MEGF10的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的MEGF10的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的MEGF10基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁网格蛋白重链蛋白(CHCP)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的CHCP的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的CHCP的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的CHCP的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的CHCP的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的CHCP基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁细胞分裂周期7相关蛋白(CDC7)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的CDC7的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的CDC7的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的CDC7的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的CDC7的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的CDC7基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁中心体蛋白89kdal(Cep89)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的Cep89的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的Cep89的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的Cep89的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的Cep89的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的Cep89基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码1型蛋白酶体(PSMB1)的蚂蚁β亚基的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的PSMB1的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的PSMB1的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的PSMB1的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的PSMB1的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的PSMB1基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁anamorsin蛋白的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的anamorsin的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的anamorsin的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的anamorsin的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的anamorsin的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的anamorsin基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁肌动蛋白5C蛋白(A5C)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的A5C的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的A5C的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的A5C的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的A5C的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的A5C基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁β肌动蛋白的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的β肌动蛋白的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的β肌动蛋白的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的β肌动蛋白的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的β肌动蛋白的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的β肌动蛋白基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁ATP合成酶δ亚基(ATPSD)的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的ATPSD的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的ATPSD的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的ATPSD的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的ATPSD的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的ATPSD基因的表达。
在实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码蚂蚁Csp9蛋白的基因的表达。在优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码红火蚁的Csp9的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的Csp9的基因的表达。在另一优选实施例中，RNAi或反义RNA抑制编码宾夕法尼亚弓背蚁或佛罗里达弓背蚁的Csp9的基因的表达，但不抑制编码其它蚂蚁物种中的Csp9的基因的表达。在其它实施例中，靶向阿根廷蚂蚁、法老蚁、有气味的蚂蚁或路面蚂蚁的Csp9基因的表达。
在本发明的另一实施例中，基因表达的RNAi或反义RNA抑制针对关于另外的蚂蚁物种的靶标，以提供更广谱的蚂蚁控制。设计这种广谱抗蚂蚁控制组合物的重要考虑是尽可能地降低与已很脆弱的黄蜂和密封物种发生交叉反应的可能性。为了识别RNAi或反义蚂蚁抑制的靶标而与蜜蜂交叉反应的可能性最小，将识别和比对编码可能必要基因的所选择的蚂蚁基因组中存在的保守基因。在一系列的蚂蚁物种中(包括除S红火蚁(红火蚂蚁)和宾夕法尼亚弓背蚁(弓背蚂蚁)之外的另外的木蚁物种(佛罗里达弓背蚁)、阿根廷蚂蚁(阿根廷蚁)、有气味的屋中蚂蚁(酸臭蚁)和法老蚁(小家蚁))的独特序列针对可用蜜蜂和黄蜂基因组以及在蚂蚁与黄蜂和蜜蜂之间被识别到最低同源程度的情况下的必要基因进行筛选。在可用必要基因蚂蚁候选物中，选择编码网格蛋白重链蛋白和核糖体蛋白L32的两个基因作为蚂蚁物种中的最佳选择，并实际上与黄蜂和蜜蜂同源物没有显著的同源性。在实施例中，针对来自不同蚂蚁物种的这些基因的两种或更多种RNAi或反义RNA的组合提供了控制特定蚂蚁物种而不影响非靶标物种(包括其它蚂蚁物种)的有效方法。
以下实例是对本发明的说明，而非限制如上文详细地描述且如权利要求书中阐述的本发明的范围。实例1呈现了实践本发明的一般工具和方法。实例2呈现了涉及对使用作为本发明的代表的一种靶标基因序列(VgR)的这种通用工具和方法的详细描述。后续3至16呈现了本发明的其它实例。具体地讲，对实例3至16中呈现的靶标基因序列的了解足以使本领域的普通技术人员使用实例1中描述的工具和方法来产生与实例2中呈现的那些类似的组合物以实现对各种蚂蚁物种的一般和/或可选控制的总体目标。
实例1
表达构建体和一般测定程序。
用于抑制靶标基因表达的RNAi和反义RNA由基于大肠杆菌的表达系统产生。在每种情况下，获得所期望的RNAi前体作为合成DNA序列，合成DNA序列包括(5'-3')AsiSI限制性位点序列、靶标基因序列、150ntd环序列、与靶标基因序列同源的序列和NotI限制性位点序列。合成DNA序列用AsiSI和NotI消化并连接到质粒pAPSE10136(SEQ ID NO.1)中。
质粒pAPSE10136基于质粒pBR322，并且含有被T7终止子分开的两个T7表达结构域。这些表达结构域中的一个包括在噬菌体MS2外壳蛋白基因的单拷贝上游的T7启动子序列，接着的是T7终止子。第二表达结构域包括在独特AsiSI和NotI限制性位点上游的T7启动子序列(其由克隆位点的一个pac位点5'和克隆位点的一个pac位点3'围起)，接着的是MS2包装序列，之后的是T7终结子。将任何序列连接到AsiS1-NotI区域中并诱导T7启动子产生MS2衣壳蛋白和包括与MS2pac位点序列融合的AsiSI-NotI序列的非翻译RNA转录物。在诱导后，非翻译RNA转录物的pac位点序列与MS2衣壳蛋白相互作用以诱导将RNA转录物衣壳化VLP的形成。从诱导的培养物回收和纯化VLP并任选地将RNA与经纯化的VLP隔离为后续基因抑制研究提供了所期望的RNAi前体或反义RNA的源。
对经纯化的VLP或RNA抑制必要基因表达并且由此直接杀死蚂蚁的能力的简单生物测定包括向限定数量的工蚁饲喂在10％蔗糖溶液中呈已知浓度的测试物质并测量工蚁的死亡率。在测试条件下，被饲喂没有添加的测试RNA的10％蔗糖溶液的蚂蚁在12天时的死亡率为25％。此测定法和其变体可被称为工蚁死亡率测定法。
被设计成用于测量经纯化的VLP或RNA破坏集落完整性以提供长期根除的能力的更复杂测定法包括类似于Lu等人所述的那些的生物测定法。来自实验室集落的新出现的未受精的蚁后养育在3cm直径板巢中，盖上的孔小到足以隔离未受精的蚁后，但是大到足以接受来自属于蚁后的集落内的工蚁的护理并允许接触来自附近已交配的蚁后的引物信息素。在下午3点到4点交配飞行之后，从现场收集新配对的蚁后，并且将其安置在与未受精的蚁后相邻的容器中，以允许信息素启动，同时避免蚁后之间(以及保育工蚁与已交配和未受精的蚁后之间)之间的直接身体互动。
将经纯化的或衣壳化RNA溶解在10％蔗糖溶液(重量/体积)中达到已知浓度，并且经由毛细管在12天的时间段内提供到照顾蚁后幼虫的保育工蚁。通过RNA干扰(通过饲喂靶向VgR的衣壳化或裸露dsRNA)沉默未受精的蚁后体内的必要基因可以消除卵形成、造成畸形(包括未受精的蚁后的交配能力)，或以其它方式干扰集落繁殖。这种“未受精的蚁后生物测定法”的变体可蚁用于确定其它基因的RNAi抑制。
实例2
通过含有用于VgR基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi靶向编码卵黄蛋白受体蛋白(VgR基因)的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。另外，红火蚁VgR基因(NCBI序列标识符XM_011168460)的至少一个区域蚂蚁中是红火蚁独特的，其在位置2055到2745处(SEQ ID NO.2)包括691个核苷酸。此区域也被隔离为两个或多或少大小相等的RNAi前体，即，在位置-2055到2400(SEQ ID NO.3)处的345个核苷酸和在位置2401到2745处的344个核苷酸(SEQ ID NO.4)。基于这些序列的RNAi组合物的使用允许选择性控制红火蚁而不伤害与这些序列缺乏显著的同源性的蚂蚁物种。
编码包括蚂蚁VgR基因的691个bp独特区域的有义拷贝和反义拷贝的反向重复的1548个核苷酸合成DNA构建体(SEQ ID NO.5)由Life Technologies的GeneArt基因合成服务(Life Technologies，Grand Island，New York)设计并合成，其中重复拷贝被150个碱基对非同源环序列分开，在非同源环序列的侧面是AsiSI和NotI限制性位点。将构建体作为AsiS1-NotI限制性片段插入质粒pAPSE10136的对应的限制性位点以形成对应的表达质粒pAPSE10397(SEQ ID NO.6)。
将表达质粒(SEQ ID NO.6)转化到大肠杆菌宿主菌株HTE115(DE3)中(Timmons等，《摄入细菌表达的dsRNA可以在秀丽隐杆线虫中产生特定且有效的遗传干扰(Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans)》，《基因(Gene)》，第263期，第103到112页(2001年))。在LB琼脂平板上选择已转化的细菌菌株的氨苄青霉素抗性克隆。随后使所选择的克隆在37℃下在含有氨苄青霉素的100ml LB培养基中培养，直到培养物达到OD6000.8，此时加入异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷达到1mM的最终浓度以诱导MS2衣壳蛋白和VgR RNA前体的T7聚合酶定向转录。允许诱导的培养物在诱导后生长至少4小时以留出足够的时间来形成VLP。通过在4℃下以3,000g离心收集细胞。在4℃下存储每个颗粒，直到进行加工为止。
含有靶向蚂蚁gR基因的691个bp茎RNAi前体的VLP通过使每个颗粒重新悬浮在含有10mM NaCl约10体积的20mM Tris-HCl(pH7.0)中来纯化并被超声降解以裂解细胞。通过以16,000g离心除去细胞碎片。通过加入核酸酶(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)达到约100单位/mL的最终浓度并在37℃下温育2小时，进一步处理每个样本。然后，加入蛋白酶K达到150微克/mL的最终浓度，并且在37℃下再次温育3个小时。通过向水中加入硫酸铵达到4.1M的最终浓度来制备饱和硫酸铵溶液。将饱和硫酸铵加入酶处理的VLP达到186mM的最终浓度为(约1:22稀释度)并置于冰上两个小时。通过以16,000g离心从裂解物中去除非所要沉淀物。通过直接地向每mL的澄清的裂解物加入155mg无水硫酸铵来进行二次沉淀。将每个样品涡旋振荡并在冰上温育2个小时。将每种沉淀物以16,000g离心并使固体沉淀物重新悬浮在含有10mM NaCl的原始体积的20mM Tris-HCl(pH7.0)的十分之一中。
如上所述制备靶向VgR基因的另外两种RNAi前体序列。合成包括与SEQ ID NO.3同源的345个核苷酸有义序列和反义序列并由150ntd非同源环分离的858ntd合成DNA序列(SEQ ID NO.7)，并且将其作为AsiS1-NotI限制性片段插入质粒pAPSE10136的对应的限制性位点中，以形成表达质粒pAPSE10426SEQ ID NO.8(SEQ ID NO.8)。在诱导T7启动子后，此质粒产生包括345个bp茎RNAi前体的RNA转录物。合成包括与SEQ ID NO.4同源的344个核苷酸有义序列和反义序列并由150ntd非同源环分离的856ntd长的另一合成DNA序列(SEQ ID NO.9)，并且将其作为AsiS1-NotI限制性片段插入质粒pAPSE10136的对应的限制性位点中，以形成表达质粒pAPSE10427(SEQ ID NO.10)。在诱导T7启动子后，此质粒产生包括344个bp茎RNAi前体的RNA转录物。表达质粒SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10分别地转化成大肠杆菌宿主菌株HTE115(DE3)和与两个已转化的菌株中的每个隔离的VLP，它们分别含有靶向红火蚁VgR的345和344个bp茎RNAi前体。总共产生3种不同VLP变体，它们包括691、344和344个碱基对RNAi前体以抑制VgR表达。
用于降低卵黄蛋白产生的生物测定法与Lu等人所述的和实例1中所述的那些类似地进行。经由RNAi沉默未受精的蚁后体内的VgR基因(通过饲喂靶向VgR的衣壳化或裸露dsRNA)可以消除卵形成，从而直接证实对蚂蚁的有效控制。
实例3
通过含有用于端粒酶基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码端粒酶的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。另外，编码端粒酶的红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011174575)的至少五个区段对于红火蚁是独特的，它们包括在位置124到349(SEQ ID NO.11)处的226个核苷酸、在位置375到479处的105个核苷酸(SEQ ID NO.12)、在位置532到678处的147个核苷酸(SEQ ID NO.13)、在位置885到679处的207个核苷酸(SEQ ID NO.14)和在位置1035到1148处的114个核苷酸(SEQ ID NO.15)。构建包括与上文识别的端粒酶基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用未受精的蚁后生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体抑制蚂蚁繁殖的能力。未能产生活的幼虫指示端粒酶表示用于蚂蚁和蚁群根除的可行RNAi靶标。
实例4
通过含有用于信息素生物合成激活神经肽基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码信息素生物合成激活神经肽(PBAN)的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁。另外，编码PBAN的红火蚁基因(NCBI序列标识符NM_001304598.1)的至少一个区段对于红火蚁是独特的，其在位置116到223处(SEQ ID NO.16)包括108个核苷酸。构建包括与上文识别的PBAN基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体提高蚂蚁的死亡率的能力。除了死亡率之外，PBAN抑制被预测为有助于通过使觅食蚂蚁丧失构建信息素踪迹的能力来破坏觅食蚂蚁进行导航(并且因此定位集落)的能力以使集落崩溃。
实例5
通过含有用于信息素生物合成激活神经肽受体基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码信息素生物合成激活神经肽受体(PBANR)的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁。另外，编码PBANR的红火蚁基因(NCBI序列标识符JX657040)的至少四个区段对于红火蚁是独特的，它们包括在位置24到247(SEQ ID NO.17)处的224个核苷酸、在位置551到691处的141个核苷酸(SEQ ID NO.18)、在位置1462到1570处的109个核苷酸(SEQ ID NO.19)和在位置1613到1718处的106个核苷酸(图T；SEQ ID NO.20)。构建各自包括与上文识别的PBANR基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体提高蚂蚁的死亡率的能力。除了个体的死亡率之外，预测PBAN抑制以有助于通过使觅食蚂蚁丧失构建信息素踪迹的能力来破坏觅食蚂蚁进行导航(并且因此重新定位集落)的能力以使集落崩溃。
实例6
通过含有用于Wntless基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码wntless蛋白的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁。另外，编码wntless蛋白的红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011162771.1)的至少两个区段对于红火蚁是独特的，它们在位置292到431(SEQ ID NO.21)处包括141个核苷酸和在位置1489到1665(SEQ ID NO.22)处包括177个核苷酸。构建包括与编码上文识别的wntless的基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。可使用如实例2所述的未受精的蚁后生物测定法的变体来确定所得的衣壳化RNAi前体抑制蚂蚁繁殖的能力。未能产生有翅蚂蚁指示wntless表示用于蚁群根除的可行RNAi靶标。未发育翅膀就不能进行交配飞行，这可能会导致集落崩溃，并且将限制蚂蚁在生态系统中分散并建立新的集落的能力。
使用如实例2所述的未受精的蚁后生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体抑制蚂蚁繁殖的能力。未能产生活的幼虫指示wntless基因表示用于蚁群根除的可行RNAi靶标。
实例7
通过含有用于多表皮生长因子样结构域蛋白10基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码多表皮生长因子样结构域蛋白10(MEGF10)的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。另外，编码MEGF10的红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011169520.1)的至少一个区段对于红火蚁是独特的，其在位置1712到1848处(SEQ ID NO.23)包括137个核苷酸。构建包括与上文识别的MEGF10基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体破坏蚂蚁集落的能力。MEGF10的抑制被预测为产生严重的神经影响，从而引起个体蚂蚁死亡以及集落破坏。另外，MEGF10的抑制破坏正常幼虫发育。
实例8
通过含有用于网格蛋白重链蛋白基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
可通过RNAi有效地靶向编码网格蛋白重链蛋白的基因(NCBI序列标识符XM_0111613001)以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于在其它膜翅目昆虫中发现的基因序列的差异来控制蚂蚁种群。核苷酸3212到3314(SEQ ID NO.24)的序列表示在蚂蚁中对于红火蚁独特的RNAi靶标，在核苷酸2022到2092(SEQ ID NO.25)处和核苷酸4794到4894(SEQ ID NO.26)处的序列也是如此。构建包括与上文识别的网格蛋白重链蛋白基因的独特区域中的任一者同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。包括SEQ ID NO.24的VLP(在10％蔗糖溶液中以500mg/L的浓度提供)产生84％的12天死亡率。
用于其它蚂蚁物种例如佛罗里达弓背蚁(木蚁)、阿根廷蚁(阿根廷蚂蚁)、酸臭蚁(有气味的屋中蚂蚁)和小家蚁(法老蚁)的编码网格蛋白重链蛋白的基因也编码蚂蚁中独特的且在黄蜂和蜜蜂基因同源物中完全地缺失的序列。这些表示特定于每个单独蚂蚁物种的RNAi靶标。例如，可以如上所述合成在核苷酸2036到2106(SEQ ID NO.27)和4808到4908(SEQ ID NO.28)处的佛罗里达弓背蚁(NCBI序列标识符XM_0112680471)序列的网格蛋白重链蛋白基因以产生如所述的VLP来特定地控制佛罗里达弓背蚁。在核苷酸位置1951到2021(SEQ ID NO.29)和4723到4823(SEQ IDNO.30)处的阿根廷蚁的网格蛋白重链蛋白基因序列(NCBI序列标识符XM_0123694721)对阿根廷蚂蚁是特异性的，并且含有这些序列的如本文所述的合成构建体对控制阿根廷蚂蚁是特异性的。同样，在核苷酸位置2152到2222(SEQ ID NO.31)和4924到4894(SEQ ID NO.32)处的小家蚁的网格蛋白重链蛋白基因序列(NCBI序列标识符XM_0126717651)对法老蚁是特异性的，并且含有这些序列的如本文所述的合成构建体对控制法老蚁是特异性的。
实例9
通过含有用于细胞分裂周期7相关蛋白激酶基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码细胞分裂周期7相关蛋白激酶(CDC7)的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。另外，编码CDC7的红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011165089.1)的至少三个区段对于红火蚁是独特的，它们包括在位置175到301(SEQ ID NO.33)处的127个核苷酸、在位置703到803处的101个核苷酸(SEQ ID NO.34)和在位置796到902处的107个核苷酸(SEQ ID NO.35)。构建包括与上文识别的CDC7基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE 10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。
实例10
通过含有用于中心体蛋白89kdal基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码中心体蛋白89kdal(Cep89)的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。编码Cep89的红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011175256.1)的至少两个区段对于红火蚁是独特的，它们在位置461到579(SEQ ID NO.36)之间包括119个核苷酸并在位置1506到1610(SEQ ID NO.37)之间包括105个核苷酸。构建包括与上文识别的Cep89基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE 10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。包括SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29的VLP(在10％蔗糖溶液中以100mg/L的浓度提供)产生83％的12天死亡率。
实例11
通过含有用于1型蛋白酶体β亚基蛋白基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码1型蛋白酶体的β亚基的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011159663.1)的至少两个区段对于红火蚁是独特的，它们在位置74到226(SEQ ID NO.38)之间包括153个核苷酸并在位置885到1021(SEQ ID NO.39)之间包括137个核苷酸。构建各自包括与编码上文识别的1型蛋白酶体的β亚基的基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。包括SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39的VLP(在10％蔗糖溶液中以500mg/L的浓度提供)产生69％的12天死亡率。
实例12
通过含有用于anamorsin基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码anamorsin(凋亡抑制剂)的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011161006.1)的至少两个区段对于红火蚁是独特的，它们在位置319到538(SEQ ID NO.40)之间包括220个核苷酸并在位置996到1105(SEQ ID NO.41)之间包括110个核苷酸。构建各自包括与上文识别的anamorsin基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。
实例13
通过含有用于肌动蛋白5C基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向肌动蛋白5C基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011161006.1)的至少两个区段对于红火蚁是独特的，其在位置-16到283(SEQ ID NO.42)之间包括300个核苷酸。构建各自包括与上文识别的肌动蛋白5C基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。
实例14
通过含有用于β肌动蛋白基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向β肌动蛋白基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011175337.1)的至少一个区段对于红火蚁是独特的，其在位置-49到250(SEQ ID NO.43)之间包括300个核苷酸。构建包括与上文识别的β肌动蛋白基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用实例2中所述的工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。包括SEQ ID NO.35的VLP(在10％蔗糖溶液中以100mg/L的浓度提供)产生90％的12天死亡率。
实例15
通过含有用于抑制编码ATP合成酶的δ亚基的基因的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码ATP合成酶的δ亚基的基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。红火蚁基因(NCBI序列标识符XM_011158204.1)的至少一个区段对于红火蚁是独特的，其在位置1到387(SEQID NO.44)之间包括387个核苷酸。构建包括与编码上文识别的ATP合成酶的δ亚基的基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。包括SEQ ID NO.36的VLP(在10％蔗糖溶液中以500mg/L的浓度提供)产生81％的12天死亡率。
实例16
通过含有用于Csp9基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向调节体表和换羽的Csp9基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它昆虫的差异来控制蚂蚁种群。红火蚁基因(NCBI序列标识符EE129471.1)的至少一个区段对于红火蚁是独特的，其在位置46到283(SEQ IDNO.45)之间包括238个核苷酸。构建包括与上文识别的Csp9基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。
实例17
通过含有用于rpL32基因抑制的RNAi前体的VLP控制蚂蚁物种。
也可通过RNAi有效地靶向编码对于rRNA组装和成熟为功能性核糖体关键的蛋白的rpL32基因，以大体上基于在蚂蚁物种中的基因序列相对于其它膜翅目昆虫的差异来控制蚂蚁种群。红火蚁基因(NCBI序列标识符EE129471.1)的至少一个区段对于红火蚁是独特的，其在位置46到283(SEQ ID NO.45)之间包括238个核苷酸。红火蚁基因的在核苷酸464到536(SEQ ID NO.46)和452到532(SEQ ID NO.47)处的两个附加区段(NCBI序列标识符XM_0111755071)表示用于控制火蚁的独特RNAi或反义RNA靶标。佛罗里达弓背蚁的包括核苷酸位置417到489(SEQ ID NO.48)和405到485(SEQ ID NO.49)的rpL32基因(NCBI序列标识符XM_0112570271)的某个区域表示用于控制木蚁的独特RNAi或反义RNA靶标。阿根廷蚁的包括核苷酸位置433到505(SEQ ID NO.50)和421到501(SEQ ID NO.51)的rpL32基因(NCBI序列标识符XM_0123800581)的某个区域表示用于控制阿根廷蚁的独特RNAi或反义RNA靶标。小家蚁的包括核苷酸位置459到531(SEQ ID NO.52)和463到543(SEQ ID NO.53)的rpL32基因(NCBI序列标识符XM_0126715791)的某个区域表示用于控制小家蚁的独特RNAi或反义RNA靶标。
构建包括与上文识别的rpL32基因的独特区域同源的有义序列和反义序列的反向重复序列的合成DNA序列并克隆到pAPSE10136中，合成DNA序列由150个碱基非同源环序列分开。获得如实例1和2中所述的那样产生的VLP。使用工蚁死亡率生物测定法来确定所得的衣壳化RNAi前体控制蚂蚁的能力。