申请人：brain·p·hanley
相关应用
本申请是基于并要求2016年5月12日提交的美国专利申请62/335,561的优先权的pct申请，其全部内容通过引用并入本文，如同完整阐述一样。
公开内容的背景
公开内容的技术领域
本发明属于基因疗法及其促成科技的领域。
相关技术的描述
本发明需要理解脓毒症的机制和toll样受体(tlr)的刺激。本发明还需要对crispr、什么是基因疗法和什么是chysel系统接头有基本理解。
免疫系统对高剂量刺激脓毒症样综合征的易感性
通常认为脓毒症的原因是感染。然而，从技术上讲，脓毒症是由于免疫系统对其敏感的病原体相关分子模式(pamp)所造成。这些触发toll样受体(tlr)c型凝集素受体(clr)和响应于核酸基序的细胞质模式识别受体(cprr)。此外，来自细胞碎片的损伤相关分子模式(damp)也会触发炎性细胞因子。
脓毒症的根本原因可能是来自细菌、真菌或病毒的pamp，但它通常由细菌细胞壁破碎引起，技术上称为内毒素或脂多糖(lps)。因此，脓毒症的标准实验室模型是注射无菌lps。这也可以复制多器官衰竭，这通常由damp过度刺激引发。在本发明的情况下，触发剂是病毒体衣壳，最常见的是腺相关病毒(aav)菌株或慢病毒(lv)菌株。另外，存在核酸的细胞溶质受体，并且tlr之间存在相互作用。
在小鼠模型中，lps的ld50取决于肝脏蛋白合成。25克小鼠中正常lpsld50约为150微克(6毫克/千克)，需要35小时才能完成其过程。然而，在用β-半乳糖胺预处理以抑制肝脏蛋白合成的小鼠中，小鼠ld50约为5纳克(200ng/kg)，少30,000倍。相比较地，正常人显示每公斤2-4纳克lps时的反应。对于lps的人ld50低于5微克/千克，比小鼠低三个数量级。人类重6000倍，但在仅为杀死25克小鼠的剂量的两倍剂量下死亡。如果人类具有小鼠的免疫系统，对于普通成年人而言，lpsld50应该是900毫克左右而不是300微克。据认为人lps敏感性是由于唾液酸结合ig样凝集素(siglecs)中的突变造成。表型上，敲除siglecs产生高反应性免疫系统组分。缺失的siglec-13和在其他灵长类动物中有活性的失活的siglec-17影响对tlr4的控制。tlr4是lps的受体。它也是damp信号通路中hmgb1的靶标。
在查看任何动物模型(包括所有非人类灵长类动物)的研究结果时，应始终记得已将控制tlr4过度刺激的人体免疫系统敲除的事实。动物可以容易地容忍杀死人类的免疫系统攻击。腺病毒相关病毒(aav)引发与内毒素不同的tlr。存在用于基因治疗递送的不同aav株。在肝脏中，库普弗细胞通过tlr2对aav2敏感，但其他细胞通过tlr9对aav2敏感。通过阻断受体，这些反应可以减弱但不能消除。
“tlr2识别来自革兰氏阳性细菌的肽聚糖，来自酵母细胞壁的酵母聚糖和来自克氏锥虫(trypanosomacruzi)的糖磷脂酰肌醇锚。当与tlr1二聚化时，tlr2还可以识别细菌脂蛋白，当与tlr6二聚化时，tlr2可识别支原体脂蛋白。...tlr9由存在于细菌dna和病毒诸如小鼠巨细胞病毒和单纯疱疹病毒中的未甲基化的cpgdna基序所激活。”
存在两个主要的炎症途径，经典(典型，直接)和替代(非典型，间接)。经典途径通过“骨髓分化初级应答基因88”(myd88)进行刺激，该替代方案通过含有tir结构域的衔接子诱导干扰素-β'(trif)进行刺激。两者均达到“核因子-κb”(nfκb)。trif刺激irf3，而myd88刺激irf7，两者均导致产生i型干扰素。
人类中i型干扰素是：ifn-α(13种亚型)，ifn-β1和ifn-β3，ifn-κ，ifn-ω1。只有一种ii型干扰素：ifn-γ。
toll样受体9(tlr9)受体由胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)寡脱氧核苷酸(odn)或cpg寡脱氧核苷酸(cpg-odn)触发。该受体使用trif系统。
细胞年概念
在本文件中将使用crispr(成簇的规律间隔的短回文重复序列)细胞年的概念来说明本方法和结构的发明特征。对于这个概念，假定了永远不会有一个绝对完美的crispr系统。修饰非预期dna的脱靶事件的概率低于表达水平的极低的数倍，乘以细胞数乘以crispr系统在那些细胞中有活性的年数。
e·p(e)·s(e)·c·y＝p(r)式1
其中：e＝表达水平，p(e)＝脱靶错误的概率，s(e)＝脱靶错误的严重度，c＝细胞的数目，y＝年数，和p(r)＝潜在危险脱靶事件的概率。需注意地是，潜在危险脱靶事件并不等于癌症。
等式1可以以整理形式(collativeform)使用，其对具有不同值的一组表达求和。例如，e可以基于一个细胞内的活性盒的数量以及脱靶事件的严重度而变化。该等式1可以用作生成风险估计值的指南。然而，注意到细胞培养中的辐射损伤使haldane于1955年对于人类中全身辐射的突变倍增率估计作出了0.05戈瑞的估计。后来的研究显示，实际最小辐射剂量为2戈瑞，可能为4至6戈瑞(例如，致死剂量范围)。哺乳动物非常擅长摧毁含有错误的细胞。
chysel系统
chysel系统是在识别了具有特殊的氨基酸序列的病毒后开发的，该系统允许它们在翻译后分裂蛋白质。这项创新使得从单一启动子表达等摩尔量的不同蛋白质成为可能。这可以大大简化表达。
待解决的问题
总体而言，有两个问题阻碍了基因治疗的发展，特别是“规律间隔的短回文重复序列”(crispr)基因治疗。这些问题是：将dna或rna传递给人体中足够的细胞；和过度表达的crispr。
问题1－递送到足够的细胞数
基因治疗患者，jessegelsinger，死于施用于其肝静脉的3.8×1013腺病毒颗粒以进行基因治疗。因此，注射以完成基因治疗的病毒体的正常限度是1012。本发明旨在预防导致其死亡的综合症。本发明人意识到通过研究生院了解这个问题，但与其他大多数人一样，承认其难以解决，而且解决其的途径是找到替代的、免疫原性相较于腺病毒衣壳、腺相关病毒(aav)衣壳、慢病毒衣壳等更低的递送方法。迄今为止，许多提倡者都采用这种策略。然而，在先前的公开中，美国专利申请号13/298,251描述了使用基因治疗方法治疗hiv，所述基因治疗方法递送编码可能在细胞内起作用的抗hiv抗体的基因。该专利的递送方面使他专注于人体内转染的数量。在他的观念中免疫系统的炎症方面，控制其的方法，以及合成产生的脓毒症与感染中发生的脓毒症之间的反应差异是清楚的。不幸的是，包括使用微生物方法治疗癌症的医生和科学家在内，很少有人意识到人类免疫学相对于免疫系统过度激活的独特性。因此，大多数专家没有意识到使用现有方法时什么是必要的和什么是可能的差距。为了解决这个问题，需要用调节剂控制免疫系统，所述调节剂抑制或阻止免疫系统的炎症循环。
作为本发明的进一步框架，注意到在人体中有3.72×1013个细胞给予或花费数千亿。为了比较，小鼠具有大约1012个细胞。按比例，20克的小鼠应该具有大约1.2×1010个细胞。通常，当使用基因治疗质粒的病毒衣壳包装时，大约1/1,000个衣壳存活以转染细胞。
泊松分布描述了培养皿中细胞在不同转染倍数(mot)下接收的病毒粒子数。
p(k)＝e-mk/k！等式2
其中p(k)是被k病毒颗粒感染的细胞的分数，而m是mot。可以简化该等式以计算未感染的细胞(k＝0)、具有单一感染的细胞(k＝1)和具有多次转染的细胞(k>1)的分数：
p(0)＝e-m等式3
p(1)＝me-m等式4
p(k>0)＝1-e-m等式3.1(如上所述)
出于本公开的目的，具有一个或多个转染的任何细胞是良好的。首要考虑因素是p(0)是否足够小以至于可以接受。因此，使用公式3.1得到各种值的mot(m)，可以准备下表，其中mot范围从10-10到10。
表1-mot和p(0)，按照等式3.1
存在其他转染方法。存在将dna封闭到转染细胞的替代的合成载体，所有这些都具有一定程度的毒性，并且所有这些都适用于本发明。
可将裸dna质粒静脉内施用于转染的细胞，但是这样做需要极大量并且局部地在血管中产生过压，这在人类中并不可行。这需要复杂且有潜在危险的手术干预。可以使用电穿孔，但其在小区域中是可用的。
问题2-crispr的表达
crispr在其作用方面是非常有效的，其存在dna改变的脱靶问题。存在具有极低脱靶分数的比原始cas9更好的酶。cas9酶有活性的时间越长，它就越有可能在有潜在问题的情况下产生脱靶变化。可能这种可能性非常低，但仍然是一个问题。身体中有大量细胞，比银河系中的恒星数量至少多100倍，而且非常低概率的事件变得相对可能。因此，期望通过特定crispr系统使活性的细胞年最小化。假定在任何转染的细胞中进行接近完美的修饰应该花费不超过几天。
本实施方案通过实现这些目标克服了该领域中存在的缺点。
发明概述
为了最小化现有技术中的限制，并最小化在阅读说明书时将会显而易见的其他限制，本发明的优选的实施方案提供了用于向人和动物体内大部分体细胞安全递送crispr和其他基因疗法的方法和相关结构。
这主要通过两个关键部分来完成：通过转染10％或更多的体细胞来递送到足够大量的体细胞以进行显著的生物体转化，以及crispr的短期表达。本发明使用多种方法来实现全部这三个方面，从而可以解决这些基因治疗的障碍。另外，递送至大部分体细胞的方法可用于其他类型的基因治疗。
首先，使用一种或多种药物，抑制免疫系统直至注射的病毒衣壳载量不再是危险。药物可以通过药物领域已知的任何方式进行施用，包括但不限于，口服、静脉内、淋巴内、皮下、腹膜内、肌内、栓剂或透皮施用。其次，选择已知待数周内控制的质粒作为递送crispr盒的骨架，和/或需要存在四环素或相关药物(例如，多西环素)的启动子如真核生物四环素/强力霉素诱导剂(tetr，tre)以激活crispr基因盒。
具体地描述了本发明的这些和其他优点和特征，以使本领域普通技术人员可理解本发明。
发明详述
在以下讨论中，其解决了本发明的许多实施方案和应用。应当理解，可以使用其他实施方案，并且可以在不脱离本发明的范围的情况下进行改变。
以下描述了各种发明特征，每个发明特征可以彼此独立地使用或者与其他特征组合使用。然而，任何单个发明特征可能不会解决上面讨论的任何问题或仅解决上面讨论的问题之一。此外，上面讨论的一个或多个问题可能不能通过下面描述的任何特征完全得到解决。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数的指示。除非另有明确说明，如本文所用的“和”可以与“或”互换使用。如本文所用，术语“约”是指所述参数的+/-5％。除非上下文另有明确规定，本发明任何方面的所有实施方案可以组合使用。
除非上下文另有明确要求，在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”，“包含”等应被解释为包含性意义而不是排他性或穷举性意义；也就是说，“包括，但不限于”的意义。使用单数或复数的单词也分别包括复数和单数。此外，当在本申请中使用时，词语“本文”、“其中”、“以上”和“以下”和具有相似意义的词语应指本申请整体，而不是本申请的任何特定部分。
该描述包括两个主要部分。第1部分使得可以用足够高的mot接种患者。第2部分设计表达盒质粒，使它们具有短的和受控的表达寿命。
第1部分：将核酸递送至足够数量的细胞
要解决的第一个问题是如何在人类中招致高达100的真实mot。鉴于所涉及的机制的性质，真正的100的mot可能提示在体内需要10,000至100,000的正式的mot。需要一组免疫系统调节剂来充分抑制炎症，如下所述。
tlr9应该由核因子κb(nfκb)和干扰素调节因子3(irf3)抑制剂的组合涵盖。然而，如果这成为问题，则存在抑制这些途径的特定药物，包括但不限于：
a.3-[4-(6-(3-(二甲基氨基)丙氧基)苯并[d]恶唑-2-基)苯氧基]-n,n-二甲基丙-1-胺；
b.6-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]-2-(4-(3-(吡咯烷-1-1)丙氧基)苯基]苯并[d]恶唑；
c.和羟氯喹。
核因子-κb(nfκb)具有作为抑制剂的药物。
表2-nfκb抑制剂
干扰素调节因子3(irf3)和toll样受体3(tlr3)，tlr4和tlr7/8也具有用作抑制剂的药物。在选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(ssri)和5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(snri)中可能存在更多此类药物。
表3－irf3-tlr3，tlr4，和tlr7/8抑制剂
还存在可被抑制的关键细胞因子肿瘤坏死因子α(tnfα)。肿瘤坏死因子α(tnfα)是成功控制类风湿性关节炎炎症的靶标。有几种fda批准的tnfα抑制剂，阿达木单抗，依那西普和英夫利昔单抗。5ht2a/2c受体药物，2,5-二甲氧基-4-碘苯丙胺(doi)是已知的最强的tnfα抑制剂，然而在短时间内不应服用它，因为它会击中5ht2c受体。注意到这些生物制剂会恶化真实的感染中的生存。
雷帕霉素(mtor)途径的机制性目标是另一个目标。雷帕霉素和类似药物将会使敲低适应性免疫系统成为可能，从而不会产生对抗病毒载体特异性的抗体和t细胞。因此，将雷帕霉素或另外的mtor途径抑制剂如坦罗莫司，依维莫司或deforolimus添加到方案中是有意义的。
核酸递送载体
主要的免疫刺激风险是由于用于将核酸递送到活动物(尤其是人类)的细胞中的核酸递送载体(nadv)所导致。通常，这些是现有病毒的重组版本，例如腺病毒(av)，腺相关病毒(aav)，人免疫缺陷病毒(hiv)等。
其他(nadv)存在并正在进行实验。复合物是合成的肽序列，通常是树突状的，具有高比例的组氨酸、精氨酸和赖氨酸。将聚合物以按质量计大于1:1的比例(通常为4:1)与dna混合，并在注射前共孵育45分钟。
包封的复合物，例如pct/us2014/057000中描述的复合物，是另一种nadv。这些将复合物包封在二氧化硅涂层中，所述二氧化硅涂层可具有附着于外部的聚合物，其目的是靶向特定细胞类型。
本发明人已经讨论了利用本发明的复合物和包膜复合物进行免疫系统刺激的问题，并且在人体中保持了这样的位置，即执行将核酸递送到大部分人体细胞所需的这些类型的nadv的特殊剂量将会导致所阐述的问题。
其他形式的nadv将在未来发明，并且前面的讨论并非详尽无遗。所描述的两个替代nadv目前是发明人知道的最好的可能的方法。它们是足够好的，本发明人认为有理由使用它们。
在大多数情况下，合成的nadv具有相当大的毒性，因此在其目前形式中几乎没有理由尝试将它们用于所述的大规模体内核酸递送的类型。脂质体是这种合成的毒性nadv的类型的一个例子。
风险管理
上述使用药物和生物制剂的方法旨在通过与药物的反作用来减少或消除免疫系统的活化。因此，如果药物剂量不足，则对合成的脓毒症/多器官衰竭的表征作出反应可能是所公开方法的整体部分。本说明书的其余部分中，该综合征将简称为脓毒症，因为对于大多数实际目的而言这已足够，并且如果发生危机，它很好地传达危险。脓毒症诱导取决于所施用的抗原的剂量，所述抗原在本案中是nadv，以及肝功能状态和可能的未知因素。应仔细监测患者，并在递送基因治疗方案之前进行评估。
在治疗之前，应评估患者相对于蛋白质合成的肝脏状态。原因在于，如果患者的肝功能受损，则有效剂量可能是未受损患者中有效剂量的1/10,000。虽然这不一定是患者的不合格，但可能需要调整剂量，治疗患者的时间长度以及可能使用其他药剂。
在开始该方案之前，应施用两个连续剂量的iv内毒素，首先是2.5ng/kg和第二个5ng/kg，以观察患者的反应，间隔36小时。患者反应可以作为给药时患者是否需要更高剂量或更长时间的指示。
如果该部分方案存在问题，并且患者反应过度，可以通过以下方式来处理：
a.施用iv多粘菌素b硫酸盐，起始剂量为24小时内1mg/kg，最多5mg/kg。这种抗生素的ld50尚不清楚。啮齿动物耐受100mg/kg或更多。狗于8mg/kg开始死亡，5mg/kg可能是一个指导原则。仔细监测患者，特别注意在紧急情况下肾功能可以允许更高的剂量。
b.注射或口服施用dmog。
c.注射il-10。其基础是，只要没有潜在的感染，已显示il-10在脓毒症的动物研究中有效。
d.注射胃饥饿素(ghrelin)。已显示ghrelin可以从脓毒症中进行拯救，并且效果显著。
e.施用阿达木单抗、依那西普、英夫利昔单抗、doi或其他一些作为tnf-α拮抗剂。doi剂量在每公斤100至500微克的范围内，并且不是批准的药物。
f.抗炎性甾族化合物的施用。
免疫系统关闭风险
然而，当患者服用这些药物时，如果病症是长期的话，其病症不太可能会变得类似于一个正在经历严重辐射中毒的人。例如，对于患有意外肝脏损害的患者，或者如果有必要给患者提供不寻常的时间来清除基因治疗接种中的抗原物质，患者可能会看到中性粒细胞、nk细胞和t细胞的下降。这可能需要用epogen、胃饥饿素和/或抗生素和用于放射性中毒的其他药物标准对其进行治疗。应注意确保肠道保持运动以防止感染。如果患者在这种状态下发生感染，应该在1.6-2.25巴的高压氧下进行初始治疗1小时并重复直到患者明显好转。
对过敏反应的反应
患者可能会对治疗的某些组分发生过敏反应。处理这种情况的标准材料最好随时可用(例如肾上腺素，皮质类固醇，抗组胺药，气道设备)。由于皮质类固醇会显着干扰免疫系统反应，肾上腺素和抗组胺药是优选的。抗组胺药作为预防剂的施用类似于其在化疗中进行的方式，其不应干扰本文所述的程序。
第2部分：crispr盒的表达
出于本申请的目的，crispr盒指的是crispr系统活跃所需的所有基因，或该系统的任何部分。该用途的crispr盒可以包括一种以上的质粒，或者它可以全部在一种质粒中。在该用途中，质粒还包括如下系统：在原代大肠杆菌基因组中产生表达盒并使用拓扑异构酶或类似酶以从大肠杆菌基因中切出表达盒的系统。
第2部分包括使用cpg-odn作为载体或表达盒的部分，和使用启动子变体如tetr或tre，该启动子变体因为四环素或多西环素的存在而活化。可以使用其他开关。
有两种基本类型的技术将使crispr基因疗法的脉动表达最大化并使其长期表达最小化。这些是利用含有哺乳动物细胞识别的cpg-odn基序的碱基质粒，并使用诱导型启动子控制表达。dna表达中的cpg序列的问题已经被认为是多年来的问题，其导致异位质粒基因表达在数周内降至单个数字表达百分比。本说明书第2部分的内容利用这个问题作为一个期望的特征，扭转了无cpg系统以实现短期表达。
如果继续提供cpg-odn基序可以导致动脉粥样硬化并且允许tlr9以显著水平表达，这是一个重要问题。
crispr盒将在tetr或一些其他真核活化的启动子系统的控制下表达。
使用chysel系统接头，表达盒可以具有与启动子和终止序列之间的表达盒的其余部分连接的hdr蛋白，通常是poly-a。
本发明的有利效果
本发明可应用于临床治疗的两个重要领域，crispr基因治疗和一般基因治疗。这两个领域对社会都非常重要，该领域中的改进可以带来显著的好处。因此，前述内容仅被认为是对本发明原理的说明。此外，由于本领域技术人员将容易想到许多修改和变化，因此不希望将本发明限制于所示和所述的确切公开内容，因此，可以采用所有适宜的修改形式和等价形式，其均落入本发明的范围内。
本说明书的第1部分解决了基因治疗递送中的主要问题，即如果试图递送所需剂量的基因疗法用于病症诸如需要转染大部分细胞的肌营养不良症，将会杀死患者。本发明解决了这个问题，因为它可以转化大多数重要的体细胞(例如，具有细胞核的细胞)。当不再需要时，本发明的第2部分改善了可控性并使crispr活性最小化。本发明的该部分还允许在需要滴定基因疗法的活性的情况下反复回转crispr活性。
工业应用性
上述发明是一种物理产品，其可在医学基因治疗领域和家畜的农业实践中制造并应用于其中。
实施方案的描述
第1部分的优选的实施方案
本发明第1部分的优选实施方案是包括递送药物以抑制免疫系统的方法，该方法包括以下步骤：
a.nfκb的抑制剂。
b.抑制剂或irf3、tlr3、tlr4和tlr7/8。ssri，舍曲林，由于其毒性较低而优选。其他ssri或snri药物也可证明可用于此目的。
c.如果需要，可以使用tlr9抑制剂。
d.tnfα抑制剂。
e.mtor抑制剂。
f.用于将核酸递送到活动物的细胞中的nadv。
第2部分的优选的实施方案
本发明的第2部分的优选实施方案是一种结构，包括：
a.含有cpg-odn的表达载体质粒。
b.具有依赖于tetr系统的启动子的表达载体质粒。
c.具有启动子的表达载体质粒，以及它们之间具有chysel接头的多个蛋白质编码序列。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开内容限制为所公开的精确形式。虽然本文中出于说明性目的描述了本公开的具体实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开内容的范围内可以进行各种等效的修改。
已经出于说明和描述的目的呈现了本发明的优选实施方案的前述描述。其并非旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式。鉴于上述教导，许多修改形式和变化形式都是可能的。意图是本发明的范围不受该详细描述的限制，而是受权利要求和所附权利要求的等效形式的限制。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于将核酸序列递送到受试动物细胞中的方法，其中受试动物是经修饰具有一种或多种人免疫系统脆弱性的人或非人动物，所述方法包括：
a.向受试动物施用包括以下的多个免疫系统调节剂：
i.肿瘤坏死因子α(tnfα)抑制剂；
ii.核因子κb(nfκb)抑制剂；
iii.干扰素调节因子3(irf3)抑制剂；和
iv.toll样受体9(tlr9)抑制剂；
b.将所述核酸序列递送到所述受试动物细胞中；
c.其中所述递送步骤发生在所述施用步骤之后；和
d.其中所述核酸序列利用核酸递送载体(nadv)来递送；和
e.其中nadv的剂量为1013nadv颗粒或更多。
2.如权利要求1所述的方法，还包括施用雷帕霉素抑制剂(mtor)的机制性靶标的步骤，和其中所述递送步骤发生在每个所述施用步骤之后。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述mtor抑制剂选自由雷帕霉素、坦罗莫司、依维莫司和地磷莫司(deforolimus)组成的组。
4.如权利要求1所述的方法，还包括施用选择性羟色胺再摄取抑制剂(ssri)的步骤，和其中所述递送步骤发生在每个所述施用步骤之后。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述ssri选自由西酞普兰(citalopram)、依地普仑(escitalopram)、氟西汀(fluoxetine)、氟伏沙明(fluvoxamine)、帕罗西汀(paroxetine)、达泊西汀(dapoxetine)、茚达品(indalpine)、苯吡烯胺(zimelidine)、西文氯胺(cericlamine)和帕奴拉明(panuramine)组成的组。
6.如权利要求1所述的方法，还包括施用羟色胺再摄取抑制剂(snri)的步骤，和其中所述递送步骤发生在每个所述施用步骤之后。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述snri选自由文拉法辛(benlafaxine)、西布曲明(sibutramine)、度洛西汀(duloxetine)、阿托西汀(atomoxetine)、去甲文拉法辛(desvenlafxine)、米那普仑(milnacipran)和左米那普仑(levomilnacipran)。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述tnfα抑制剂选自由阿达木单抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)或2,5-二甲氧基-4-碘代安菲他命(2，5-dimethoxy-4-iodoamphetamine)组成的组。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述nfκb抑制剂选自由ectinascidin743、洋地黄毒甙、哇巴因、硼替佐米(bortezomib)、色霉素a3(chromomycina3)、依米丁(emetine)、氟沙仑(fluorosalan)、那拉菌素(narasin)、来他替尼(lestaurtinib)、tribromsalam、别丁(bithionol)和红比霉素(daunorubicinum)。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述irf3抑制剂选自由舍曲林(sertraline)、三氟拉嗪(trifluoperazine)或氟奋乃静(fluphenazine)。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述tlr9抑制剂选自由3-[4-(6-(3-(二甲胺基)丙氧基)苯并[d]恶唑-2-基)苯氧基]-n,n-甲基丙-1-胺,6-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)-2-(4-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基]苯基[d]恶唑，或羟氯喹组成的组。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述nadv是病毒衣壳。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述nadv是复合物。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述nadv是包膜的复合物。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述递送步骤发生在所述施用步骤之前。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述递送步骤与所述施用步骤同时发生。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸序列包含在四环素诱导型启动子的调控下编码成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)的核酸序列。
18.如权利要求17所述的核酸序列，还包括胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)寡脱氧核苷酸(cpg-odn)核酸序列。
19.如权利要求17所述的核酸序列，还包括：
a.一个或多个顺式作用水解酶元件(chysel)序列，在所述四环素诱导性启动子的调控下与两个或多个基因序列相连接；和
b.其中所述两个或多个基因编码蛋白。