本发明涉及动物冷冻精液生产的技术领域，具体涉及一种猪属动物冷冻精液稀释液及其配制方法。
背景技术：
近年来，人工授精技术已经广泛应用于现代养猪生产，但绝大部分为鲜精人工授精，冷冻精液的平均使用率不到1％，远低于鲜精和常温保存的精液使用率。采猪冷冻精液人工授精与新鲜精液相比，其配种后的受胎率降低10-25％，平均窝产仔数减少1-3头。冷冻-解冻程序对精液造成很多物理化学损伤，因此在这些程序中有很多可以优化提高的地方。尤其在冷冻-解冻程序的选择以及冷冻稀释液，因此对猪精液冷冻保存技术的研究就显得非常重要。
精液冷冻技术对现代畜牧业的发展有着十分重要的意义。随着我国国民经济的飞速发展，人民的生活质量得到不断提高，猪肉如今已成为老百姓日常生活中不可或缺的肉类食品。由于人们对猪肉需求量的增加，中国养猪业迅猛发展。中国生猪饲养量和猪肉消费量约占全世界总量的50％，所有冻精在优良公猪繁育工作中也发挥着越来越重要的作用。因此如何进一步改善精子冷冻后的品质、提高精子细胞的耐冻性，仍是一个值得探讨的问题。
技术实现要素：
为了进一步改善精子冷冻后的品质、提高精子细胞的耐冻性，本发明提供了一种猪属动物冷冻精液稀释液及其配制方法：
一种猪属动物冷冻精液稀释液的配制方法，采用两步稀释法，预先使用ⅰ液孵育半小时后，加入ⅱ液后分装进行冷冻程序，得到；
所述的精子的体积分数30-36％、稀释液ⅰ液的体积分数为30-36％、稀释液ⅱ液的体积分数为30-36％；
所述稀释液ⅰ液由以下体积分数的组分制成：tcg基础液74-84％、卵黄液15-25％、ptd-fnk0.2-1％(占精液与稀释液终浓度10-50nm)；
所述稀释液ⅱ液由以下体积分数的组分制成：tcg基础液91％，甘油9％；
所述的ptd-fnk，是一种抗凋亡蛋白ptd-fnk蛋白，该蛋白质为抗凋亡蛋白bcl-xl的突变体并添加膜穿梭序列ptd，其分子量为36kda，其序列为：
tatggcaggaagaagcggagacagcgacgaagaatgtctcagagcaaccgggagctggtggttgactttctctcctacaagctctcccagaaaggattcagctggagtaattttagcgatgtcgaagagaacaggactgaagccccagaagaaactgaaccagaaagggagacccccagtgccatcaatggcaacccatcctggcacctggcggatagccccgcggtgaatggagccactggccacagcagcagtttggatgcgcgggaggtaatccccatggcagcagtgaagcaagcgctgagagaggctggcgatgagtttgaactgcggtaccggagagcattcagtgatctaacatcccagcttcatataaccccagggacagcatatcagagctttgaacaggtagtgaatgaactctttcgggatggggtaaactggggtcgcattgtggccttcttctcctttggcggggcactgtgcgtggaaagcgtagacaaggagatgcaggtattggtgagtaagattgcaagttggatggccacctacctgaatgaccacctagagccttggatccaggagaacggcggctgggacacttttgtggatctctacgggaacaatgcagcagccgagagccggaaaggccaggagcgtttcaaccgctggttcctgacgggcatgactgtggctggtgtagttctgctgggctcactcttcagtcggaag。
所述的tcg基础液，包括葡萄糖、柠檬酸、tris、青霉素和链霉素，每100mltcg基础液：1.1g葡萄糖、1.48g柠檬酸、2.42gtris、青霉素的量为1000单位/ml、链霉素的量为1000单位/ml，双蒸水定容100ml，0.22μm滤器过滤，4℃保存。
所述的稀释液ⅰ中的卵黄液，是取卵黄10000rpm离心15min，取上清得到。
一种抗凋亡蛋白ptd-fnk蛋白的制备方法，包含如下步骤：
(1)取sd大鼠新鲜肝脏组织，按照rnaisolater试剂说明书进行总rna提取；
(2)构建克隆质粒pum19-t-bcl-xl；
(3)构建原核表达质粒pet28a(+)-ptd-bcl-xl；
(4)定点突变原核表达质粒pet28a(+)-ptd-bcl-xl得到重组质粒pet28a(+)-ptd-fnk质粒的；
(5)于bl21感受态细胞中诱导表达融合蛋白ptd-fnk，30℃的条件下，诱导14h；
(6)收集菌体，超声波破碎，功率400w，破碎30min，超声2s，暂停6s为一个循环，第一次离心，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清液，沉淀用包涵体洗涤液(10mmol/ltris-hcl，50mmol/lnacl，2mol/l尿素)两次后溶解(8murea，50mmtris-hcl，150mmnacl，ph8.0)过夜，第二次离心，12000rpm，4℃，离心45min，取上清；
(7)将收集到的两种上清液进行镍琼脂糖亲和层析，梯度过buffer，20mmimidazole的washbuffer(20/50/100/150mmimidazole，1mtris，300mmnacl，0.1％tritonx-100，ph8.0)和500mmimidazole的elutionbuffer(500mmimidazole，1mtris，300mmnacl，0.1％tritonx-100，ph8.0)，收集经层析得到的活性组分；
(8)将收集到的组分进行sds-page检测后，将纯度最好的组分复性48h，复性buffer是(50mmtris，50mmnacl，500mmarginine，3mmgssg，1mmgsh，1mmdtt，ph8.0)；透析buffer是不同浓度梯度尿素复性液(10％(v/v)甘油，pbs，ph7.6，其尿素浓度分别为：6mol/l、4mol/l、3mol/l、2mol/l、1mol/l、0mol/l)；
(9)梯度透析复性至pbs，2mmdtt，0.05％tritonx-100，ph8.0中，16h。0.45μm滤膜过滤浓缩分装，-80℃保存。
本发明还涉及上述配制方法得到的猪属动物冷冻精液稀释液。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明所述的抗凋亡蛋白ptd-fnk蛋白，以大鼠肝脏总rna为模板，通过分子克隆技术及基因点突变技术，构建ptd-fnk蛋白的原核表达载体pet28a(+)-ptd-fnk质粒，并将其转化入大肠杆菌bl21(de3)中诱导蛋白的表达，通过探索诱导蛋白表达的最优条件，大量诱导蛋白表达并且进行纯化。
2、本发明所述的抗凋亡蛋白ptd-fnk蛋白，以大肠杆菌为原料，利用低温诱导表达获得大量上清中的可溶性蛋白，取材容易，操作简便；制备方法细致严谨，重复性高。
3、本发明所述的稀释液，以ptd-fnk蛋白为添加物，以少量的蛋白获得对冷冻精子的保护作用，提高猪精冷冻解冻的存活。
附图说明
图1是本发明实施例流式细胞检测结果图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
实施例:
一种猪属动物冷冻精液稀释液，稀释液以tcg为基础，采用两步稀释法：ⅰ液包括80％tcg基础液、19.8％卵黄液和0.2％ptd-fnk，ⅱ液包括91％tcg基础液和9％甘油。每100m1tcg基础液中包括以下含的原料:1.1g葡萄糖、1.48g柠檬酸、2.42gtris，所述的青霉素的量为1000单位/ml，链霉素的量为1000单位/ml，双蒸水定容100ml，0.22μm滤器过滤，4℃保存。
对比例:
使用不加ptd-fnk稀释液(对照组)与实施例的稀释液冷冻保存猪的精液。按常规方法进行精液的冷冻及解冻，采用精子图像分析仪(sca自动精液分析仪，法国卡苏公司)分析解冻后精子活力、活率、质膜完整性及顶体完整率，结果如表1所示采用；流式细胞仪检测精子的凋亡结果如图1所示。
不同配方冷冻精液稀释液对冻融后精子品质的影响(平均数士标准差)
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的保护范围。