本发明涉及一种用紧穗野生稻成熟种子繁育再生植株的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术：
野生稻资源是水稻育种中获得有利外源基因的一个重要来源。紧穗野生稻(oryzaeichingeri)具有cc染色体组，与栽培到亲缘关系较远，并具有许多优良特性，如抗虫、抗病、抗旱、植株高大、功能叶片耐衰老、良好生长优势等。目前，紧穗野生稻的繁殖手段主要是茎干扦插和分根移栽，但繁殖率低、繁殖时间长；紧穗野生稻结实率不高，种子落粒性强，即使收获的种子品质较差并严重畸形，种子萌发率非常低，紧穗野生稻基本不能用种子进行繁殖，严重妨碍了紧穗野生稻的保存、保护和利用。
研究发现紧穗野生稻种子种皮坚硬，并有一层釉质包裹，种子极难吸收膨胀，造成种子萌发率极低，利用常规的浸泡和高温催芽处理也很难提高紧穗野生稻种子的发芽率，利用种子诱导愈伤效率和成苗率也极低。本发明利用砂纸将紧穗野生稻种子的坚硬种皮磨破，使种子能充分吸水，提高种子萌发率来提高愈伤组织诱导率，运用不同植物激素组合和培养条件变化，成功的利用紧穗野生稻成熟种子诱导出愈伤组织并得到分化苗。
本发明提供的一种用紧穗野生稻成熟种子繁育再生植株的方法，经文献检索，未见与本发明相同内容的公开报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于突破了紧穗野生稻通过成熟种子获得再生植株的困题，提供一种用紧穗野生稻成熟种子繁育再生植株的方法。
本发明的用紧穗野生稻成熟种子繁育再生植株的方法，其方法的具体步骤如下：
a.外植体选择：收获的紧穗野生稻成熟种子，用纸袋装好，晒干，储存于干燥通风的地方；
b.外植体处理：将晒干的成熟种子剥去谷壳，用购买的400目牛皮纸水砂纸将种皮磨掉，除干净种皮的种子用蒸馏水洗2遍，装在100ml的三角瓶中，用体积百分比为75％的酒精表面灭菌1分钟，无菌水洗3遍，再加入50ml体积百分比为0.1％的氯化汞和10ul体积百分比为20％的吐温灭菌处理20分钟，期间每5分钟摇动一次，倒掉氯化汞，再用体积百分比为75％的酒精表面灭菌1分钟，用无菌水洗3遍，将种子取出用无菌吸水纸吸干种子表面的水分；
c.种子催芽：将b步骤处理后的种子放到铺有一层滤纸的培养皿中，加入20ml无菌水，用封口膜将培养皿封口，置于人工气候箱中28℃暗培养9天，期间每2天换一次水，待萌动芽长至0.2-0.5cm时，用于愈伤组织诱导；
d.愈伤组织诱导：将带芽的种子取出放入诱导培养基，置于人工气候箱28℃暗培养35天，芽的基部长出透明的带有粘液的愈伤组织，继续培养10-16天，待愈伤长至直径0.2cm时进行愈伤继代培养；愈伤诱导培养基为：n6基本培养基+2,4-d5.0mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
e.愈伤组织继代：将带有粘液的愈伤组织从种子上分离下来，接入愈伤继代培养基中，置于人工气候箱中28℃暗培养，每20天继代一次，继代2-3次后愈伤组织由白色变成淡黄色紧实颗粒；愈伤继代培养基为：n6基本培养基+2,4-d3.0-4.0mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
f.愈伤组织增殖：挑选直径为0.2-0.5cm的淡黄色紧实颗粒状愈伤组织，接入装有继代培养基的100ml三角瓶中，每瓶20个愈伤，置于温度为28℃、光照为2000lx的培养箱中进行弱光培养，每7天更换一次培养基，继代培养基同e步骤所述，21-28天后，愈伤组织大量增值覆盖整个培养基表面，并呈现黄绿色；
g.愈伤组织分化：将黄绿色紧实颗粒状的愈伤组织接入装有分化培养基ⅰ的100ml三角瓶中，每瓶10-15个，置于温度为28℃,光照为4000lx的培养箱中，10-12天后，愈伤组织变为深绿色后，将深绿色的愈伤组织转入分化培养基ⅱ中于温度为28℃,光照为4000lx的培养箱中继续培养20-25天，愈伤分化出小苗，待小苗长至2-3cm长时，转入壮苗培养基进行壮苗；分化培养基ⅰ为：n6基本培养基+6-ba6mg/l+naa0.5mg/l+kt2mg/l+zt2mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；分化培养基ⅱ为：n6基本培养基+6-ba4mg/l+naa0.3mg/l+kt2mg/l+zt2mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
h.壮苗培养：将2-3cm长的小苗从培养瓶中取出接入壮苗培养基中，置于28℃，4000lx的光照培养箱中培养20-27天，小苗茎干增粗并长至4-5cm高时，进行生根培养；壮苗培养基为：n6基本培养基+6-ba2mg/l+iaa0.3mg/l+tdz2mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
i.生根培养：将4-5cm高的健壮无根苗接入装有生根培养基的直径5cm、长20cm的试管中，没根试管2-3株，置于28℃，2000lx的光照培养箱中进行生根培养，每10天更换一次培养基，20-25天后，根长至5-7cm，苗长至10-12cm后进行炼苗；生根培养基为：n6基本培养基+iaa0.3mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
j.炼苗：将苗从试管中取出，用28℃自来水将苗根部的培养基冲洗干净，放入直径5cm、长20cm的试管中，加水淹没根部，管口敞开，置于28℃，2000lx的光照培养箱中，5天后，将苗从光照培养箱中移出，栽到购于市场的营养基质中，置于温室进行常规培养，直至叶片展开、新根长出，移入较大的花盆中，常规培养直至种子成熟。
本发明的优点在于：大幅度提高了紧穗野生稻成熟种子的愈伤诱导率和成苗率，突破了种子繁育后代的难题，促进了紧穗野生稻的保存、保护和利用，为大量获得紧穗野生稻后代提供了高效的方法。
具体实施方式
实施例一：
本实施例采用了斯里兰卡紧穗野生稻的成熟种子为实验材料，采用本发明方法获得了再生植株。实施具体步骤如下：
a.外植体选择：收获的紧穗野生稻成熟种子，用纸袋装好，晒干，储存于干燥通风的地方；
b.外植体处理：将晒干的成熟种子剥去谷壳，用购买的400目牛皮纸水砂纸将种皮磨掉，除干净种皮的种子用蒸馏水洗2遍，装在100ml的三角瓶中，用体积百分比为75％的酒精表面灭菌1分钟，无菌水洗3遍，再加入50ml体积百分比为0.1％的氯化汞和10ul体积百分比为20％的吐温灭菌处理20分钟，期间每5分钟摇动一次，倒掉氯化汞，再用体积百分比为75％的酒精表面灭菌1分钟，用无菌水洗3遍，将种子取出用无菌吸水纸吸干种子表面的水分；
c.种子催芽：将b步骤处理后的种子放到铺有一层滤纸的培养皿中，加入20ml无菌水，用封口膜将培养皿封口，置于人工气候箱中28℃暗培养9天，期间每2天换一次水，待萌动芽长至0.2cm或0.35cm或0.5cm时，用于愈伤组织诱导；
d.愈伤组织诱导：将带芽的种子取出放入诱导培养基，置于人工气候箱28℃暗培养35天，芽的基部长出透明的带有粘液的愈伤组织，继续培养10天或13天或16天，待愈伤长至直径0.2cm时进行愈伤继代培养；愈伤诱导培养基为：n6基本培养基+2,4-d5.0mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
e.愈伤组织继代：将带有粘液的愈伤组织从种子上分离下来，接入愈伤继代培养基中，置于人工气候箱中28℃暗培养，每20天继代一次，继代2次或3次后愈伤组织由白色变成淡黄色紧实颗粒；愈伤继代培养基为：n6基本培养基+2,4-d3.0-4.0mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
f.愈伤组织增殖：挑选直径为0.2cm或0.35cm或0.5cm的淡黄色紧实颗粒状愈伤组织，接入装有继代培养基的100ml三角瓶中，每瓶20个愈伤，置于温度为28℃、光照为2000lx的培养箱中进行弱光培养，每7天更换一次培养基，继代培养基同e步骤所述，21天或26天或28天后，愈伤组织大量增值覆盖整个培养基表面，并呈现黄绿色；
g.愈伤组织分化：将黄绿色紧实颗粒状的愈伤组织接入装有分化培养基ⅰ的100ml三角瓶中，每瓶10个或13个或15个，置于温度为28℃,光照为4000lx的培养箱中，10天或11天或12天后，愈伤组织变为深绿色后，将深绿色的愈伤组织转入分化培养基ⅱ中于温度为28℃,光照为4000lx的培养箱中继续培养20天或22天或25天，愈伤分化出小苗，待小苗长至2cm或3cm长时，转入壮苗培养基进行壮苗；分化培养基ⅰ为：n6基本培养基+6-ba6mg/l+naa0.5mg/l+kt2mg/l+zt2mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；分化培养基ⅱ为：n6基本培养基+6-ba4mg/l+naa0.3mg/l+kt2mg/l+zt2mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
h.壮苗培养：将2cm或3cm长的小苗从培养瓶中取出接入壮苗培养基中，置于28℃，4000lx的光照培养箱中培养20天或24天或27天，小苗茎干增粗并长至4cm或5cm高时，进行生根培养；壮苗培养基为：n6基本培养基+6-ba2mg/l+iaa0.3mg/l+tdz2mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
i.生根培养：将4cm或5cm高的健壮无根苗接入装有生根培养基的直径5cm、长20cm的试管中，没根试管2株或3株，置于28℃，2000lx的光照培养箱中进行生根培养，每10天更换一次培养基，20天或24天或25天后，根长至5cm或6cm或7cm，苗长至10cm或11cm或12cm后进行炼苗；生根培养基为：n6基本培养基+iaa0.3mg/l+植物凝胶2.8g/l+蔗糖30％，ph6.0；
j.炼苗：将苗从试管中取出，用28℃自来水将苗根部的培养基冲洗干净，放入直径5cm、长20cm的试管中，加水淹没根部，管口敞开，置于28℃，2000lx的光照培养箱中，5天后，将苗从光照培养箱中移出，栽到购于市场的营养基质中，置于温室进行常规培养，直至叶片展开、新根长出，移入较大的花盆中，常规培养直至种子成熟。
实施例二：
实施例二基本同实施例一。不同之处在于实施例二的实验材料为乌干达紧穗野生稻的成熟种子。
实际应用表明：本发明不仅突破了种子繁育后代的难题，且紧穗野生稻成熟种子的愈伤诱导率和成苗率高，是一种大量获得紧穗野生稻后代的高效方法。