本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及利用玉米无叶舌基因lg1连锁的ssr分子标记辅助快速缩小玉米叶夹角改良京科968株型的方法。
背景技术：
：近些年来，随着玉米耐密植、高光效育种目标的提出，株型紧凑、叶片上冲等成为玉米育种家关注的重要表型性状。玉米叶夹角是一个重要的株型指标，直接影响光在冠层内的分布及群体的光能利用，从而影响植株生长发育的过程和生理特性，是影响产量的重要农艺性状。直立的叶片可显著提高光合效率和植株密植度，进而增加产量，叶夹角小，株型紧凑；相反叶夹角大，株型平展。研究表明玉米叶夹角是多基因控制的数量性状，具有作用方式相对复杂、且易受环境影响的特点，因此利用常规的回交转育方法来缩小亲本自交系的叶夹角、改良杂交种的株型，存在耗时长、选择准确性差、改良效果不理想等缺点。无叶舌种质由于叶舌叶耳消失、叶鞘包茎、叶片直立上冲、光合面积大、光能利用率高，是开展耐密植杂交种选育的重要资源。目前已发现的玉米无叶舌性状有显性和隐性两种，其中lg1基因是隐性无叶舌基因，位于第二条染色体短臂的末端。利用回交转育的方法，可以实现无叶舌性状lg1基因的定向改良。由于lg1基因为隐性，如果仅将玉米杂交种的双亲之一转育成无叶舌，与有叶舌的另一个亲本组配，杂交种仍然表现为有叶舌。但是由于存在剂量效应，当杂交种的基因型为lg1lg1时，其叶夹角较原杂交种有明显降低。在将亲本自交系转育成无叶舌过程中，如果利用传统的育种方法把无叶舌性状lg1基因导入到轮回亲本选育自交系时，由于该性状是隐性单基因控制，需要对回交1代自交，在分离的自交后代中选择无叶舌植株继续回交，然后自交、回交、再自交，直至回交多代遗传背景与轮回亲本基本一致，再自交2代，才能获得性状稳定的无叶舌自交系。可见，利用常规回交转育方法，对于隐性单基因控制的性状来说，需要使用回交、自交交替的方法，才能将目标性状准确的选择出来，选系时间长、效率低。分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，即不受环境、基因互作、基因与环境互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。简单重复序列(simplesequencerepeats，ssr)是一类广泛存在于基因组上的、由几个核苷酸重复单位组成的串联重复序列。由于其在基因组上的大量分布，多态性高，且操作技术简单，费用低廉，在分子辅助育种中已被广泛使用。因此，筛选出与无叶舌基因紧密连锁的分子标记，利用分子标记对玉米无叶舌基因进行选择，同时结合分子标记辅助背景选择加快轮回亲本遗传背景的回复速度，对无叶舌玉米自交系选育有着独特的优势。利用上述方法快速将玉米杂交种双亲之一转育成无叶舌自交系后，与另一个亲本组配，即可快速获得遗传背景与原杂交种基本一致、且叶夹角明显缩小的紧凑型杂交种。技术实现要素：本发明的目的在于提供利用玉米无叶舌基因lg1紧密连锁的ssr分子标记，结合分子标记辅助背景选择将玉米杂交种双亲之一转育成无叶舌自交系，并将选育得到的玉米无叶舌自交系与杂交种另一个亲本组配，获得遗传背景与原杂交种基本一致、且叶夹角明显缩小的紧凑型玉米杂交种的选育方法。申请人利用玉米基因组数据库maizegdb(http://www.maizegdb.org/)，选择与位于玉米第二条染色体短臂末端lg1基因遗传距离较近，上下游区间共计9个ssr分子标记。提取b73无叶舌突变体rla1(玉米ems突变体库构建及突变体初步鉴定，安徽农业科学，2014，42(11):3162-3165)和自交系材料(京2416和京92)的基因组dna，利用上述分子标记，进行pcr反应条件的优化和筛选，最终确定在b73无叶舌突变体rla1分别与京2416和京92间具有多态性，分辨率良好，且距离lg1基因遗传距离较近的两个ssr分子标记。在北京基地(春播)，将受体自交系京2416和京92作为母本，分别与b73无叶舌突变体rla1进行杂交配制f1。在三亚基地(秋播)种植f1自交，收获2个相应的f2群体。利用rla1×京2416，rla1×京92的f2分离群体，分析标记与表型的连锁关系，以验证本发明筛选得到的2个ssr标记可用于无叶舌性状的田间分子标记辅助选择。本发明提供了玉米无叶舌基因lg1紧密连锁的ssr分子标记，由核苷酸序列如seqidno.1-2或seqidno.3-4所示的引物对pcr扩增获得。本发明提供了一种快速缩小玉米叶夹角的杂交种选育方法：选育玉米无叶舌自交系，将其与玉米自交系杂交后即得叶夹角小的玉米杂交种；所述玉米无叶舌自交系，其选育过程包括在回交转育过程中对杂合基因型lg1lg1进行ssr分子标记辅助前景选择，前景选择所用的ssr分子标记由核苷酸序列如seqidno.1-2或seqidno.3-4所示的引物对pcr扩增获得；将选育得到的玉米无叶舌自交系。进一步地，为改良玉米材料京科968，使其叶夹角缩小，可选用的正常有叶舌玉米自交系为玉米材料京724。具体地，本发明提供了玉米无叶舌自交系的选育方法，是在回交转育过程中对杂合基因型lg1lg1进行ssr分子标记辅助前景选择，前景选择所用的ssr分子标记由核苷酸序列如seqidno.1-2或seqidno.3-4所示的引物对pcr扩增获得。本发明所述的玉米无叶舌自交系选育方法，包括以下步骤：(1)以杂交种亲本之一作为轮回亲本，以含lg1基因的具有无叶舌性状玉米自交系作为非轮回亲本，杂交组配f1代，收获f1代的种子；种植f1代的种子，得到f1代玉米植株；(2)回交第一次bc1代的获得；利用核苷酸序列如seqidno.1-2和seqidno.3-4所示分子标记对bc1代进行分子标记辅助前景选择；(3)回交第二次bc2代的获得；利用核苷酸序列如seqidno.1-2和seqidno.3-4所示分子标记同时对bc2代进行分子标记辅助前景选择；(4)回交第二次bc3代的获得；利用核苷酸序列如seqidno.1-2和seqidno.3-4所示分子标记同时对bc3代进行分子标记辅助前景选择；(5)通过前景选择入选的bc3f1代单株，进行自交得到bc3f2，种植bc3f1代群体的种子，在bc3f2代植株中选择无叶舌性状的植株继续自交，即获得了遗传背景与轮回亲本基本一致，同时表现无叶舌性状的新自交系。步骤(2)-(3)回交转育过程中利用分子标记辅助进行前景选择标准为：同时选择核苷酸序列如seqidno.1-2和seqidno.3-4所示的分子标记进行，核苷酸序列如seqidno.1-2的分子标记，扩增产物大小为193/230bp，同时核苷酸序列如seqidno.3-4所示的分子标记鉴别时，扩增产物大小为153/157bp，则待测玉米具有lg1基因，可作为前景选择的入选单株。步骤(4)回交转育过程中利用分子标记辅助进行前景选择的标准为：当选择核苷酸序列如seqidno.1-2的分子标记鉴别时，若扩增产物大小为193/230bp，且选择核苷酸序列如seqidno.3-4所示的分子标记鉴别，若扩增产物大小为153/157bp，则待测玉米具有lg1基因，可用于步骤(5)的自交。步骤(2)前景选择之后，还包括对bc1代做分子标记辅助背景选择，方法为：分别以非轮回亲本和轮回亲本的dna为模板，利用中国专利zl201310751112.6(cn104285776b)的40对ssr引物分别进行pcr扩增，筛选在非轮回亲本和轮回亲本之间存在多态性的引物，利用筛选出的引物对前景选择入选的单株进行检测，与轮回亲本得到的对应pcr扩增图谱进行比较，选取与轮回亲本差异等位基因数最少的前10-15个单株作为下一步回交的母本。步骤(3)前景选择之后，还包括对bc2代做分子标记辅助背景选择，方法为：利用bc2代单株对应的母本bc1代与轮回亲本扩增带型不同的ssr引物对，对分子标记辅助前景选择入选的单株进行pcr扩增；与轮回亲本得到的对应pcr扩增图谱进行比较，选取与轮回亲本无差异等位基因的单株作为进一步回交的母本。本发明中，非轮回亲本选自rla1，轮回亲本为京92。在本方面的实施例中，筛选在非轮回亲本rla1和轮回亲本京92之间存在多态性的引物分别为umc1335y5、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi072k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、umc1506k12、umc1147y4、bnlg1671y17、phi96100y1、umc1536k9、bnlg1520k1、bnlg490y4、umc1999y3、umc2115k3、umc1429y7、bnlg249k2、phi299852y2、umc2160k3、bnlg2235y5、umc2084w2、phi041y6、umc2163w3。本发明方法中，利用核苷酸序列如seqidno.1-2或seqidno.3-4所示分子标记进行辅助前景选择时，采用的pcr扩增条件为94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，共30个循环；72℃7min。本发明提供了上述选育方法在改良京科968株型中的应用，所述改良是缩小玉米叶夹角。本发明还提供了上述选育方法在玉米种质资源改良中的应用。本发明的有益效果在于：本发明利用适用于特定改良群体的，与lg1基因紧密连锁的共显性分子标记，在回交转育过程中对杂合基因型lg1lg1进行鉴定筛选，免去对回交后代进行自交的步骤，与常规育种方法相比，既可以提高选择的准确性，又能够节省将近一半的选系时间。同时，针对传统回交转育方法背景回复周期长的问题，结合利用分子标记辅助背景选择的方法，仅需要回交3代，自交1代，即可获得遗传背景基本回复到轮回亲本的无叶舌改良系。具体应用中，本发明选用玉米京92作为轮回亲本，以含lg1基因的具有无叶舌性状玉米自交系作为非轮回亲本，通过杂交、三次回交和分子标记辅助前景和背景选择、自交获得遗传背景与轮回亲本基本一致，表现无叶舌性状的玉米自交系，将亲本无叶舌自交系与京724组配，即可快速获得遗传背景与原杂交种基本一致、且叶夹角比原品种京科968明显缩小、其他性状与原品种京科968无明显差异的紧凑型玉米杂交种。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明实施例中所用的玉米种质资源来自北京市农林科学院玉米研究中心。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1玉米无叶舌lg1基因ssr分子标记的筛选1、利用玉米基因组数据库maizegdb(http://www.maizegdb.org/)，选择与位于玉米第二条染色体短臂末端lg1基因遗传距离较近，上下游区间共计9个ssr分子标记。表1无叶舌基因lg1上下游标记的位置与引物序列primer名称序列(5′to3′)染色体位置umc2245-lgccctgttattggaacagtttacg30.9umc2245-rcgtcgtcttcgacatgtacttcacisu308337-lttcttgcttgtctctagcagctt35.6isu308337-rtgtggcgatgtccatgattisu488638-laggcaactcctgtgtctgtgt45.2isu488638-rcatgatcgcccactccttumc1165-ltatcttcagacccaaacatcgtcc47.4umc1165-rgtcgattgatttcccgatgttaaaphi098-lgagatcaccggctagttagagga56.72phi098-rgtatggttgggtacccgtctttctaumc1542-ltaaagctatgatggcacttgcaga57.60umc1542-rcatatttgcctttgcccttttgtaumc2536-lcatacgtaatcctacgcgacaaca58.99umc2536-rttgtgaaacaaaaagaaagcacgabnlg1338-lgtgcagaatgcaggcaatag51.3bnlg1338-rgcaaatgttttcacacacacgmagi44170-ltgtgggatgtggtctctaacg48.5magi44170-racatcagagcacaccactgc注：位置表示在maizegdb网站上的ibm22008neighborsframe2中相对的遗传位置，其中lg1基因为50.9提取b73无叶舌突变体rla1和自交系材料(京2416和京92)的基因组dna，利用上述分子标记，进行pcr反应条件的优化和筛选，最终确定两个在无叶舌rla1和有叶舌京2416、京92间具有多态性，分辨率良好，且距离lg1基因遗传距离较近的ssr分子标记。这两个ssr分子标记为isu488638和umc1542，用于pcr扩增两个标记isu488638和umc1542的引物对序列分别如seqidno.1-2和seqidno.3-4所示。2、两个ssr分子标记与玉米无叶舌lg1基因连锁关系分析在北京基地(春播)，将自交系京2416和京92作为母本，分别与无叶舌的rla1进行杂交配制f1。在三亚基地(秋播)种植f1自交，收获相应的f2群体。利用rla1×京2416，rla1×京92的f2分离群体，分析与表型的连锁关系。用自交系rla1、京2416和京92，以及2个f2分离群体，检测分子标记isu488638和umc1542与表型的连锁关系。rla1×京2416的f2分离群体79株，其中26株田间表型为无叶舌，53株为有叶舌，rla1×京92的f2分离群体81株，其中25株田间表型为无叶舌，56株为有叶舌。提取基因组dna，利用isu488638和umc1542进行检测。结果显示，这两个标记与lg1基因紧密连锁，用isu488638进行pcr检测时，在160株分离群体(rla1×京2416的f2分离群体79株和rla1×京92的f2分离群体81株)中有7株基因型与表型不符；用umc1542进行检测时，在160株分离群体中有3株基因型与表型不符(详见表2)；当用isu488638和umc1542两个标记同时进行辅助选择时，基因型与表型完全吻合，即isu488638基因型为230/230、且umc1542基因型为157/157的株数为45株，田间表现均为无叶舌；isu488638基因型为193/230或193/193、且umc1542基因型为153/157或153/153的株数为105株，田间表现均为有叶舌，说明isu488638和umc1542可用于京2416、京92等系列自交系回交转育无叶舌性状的分子标记辅助选择。表2isu488638和umc1542基因型和有无叶舌表型的对比实施例2玉米无叶舌自交系的选育1、杂交子代f1的获得第一年夏，以玉米自交系rla1(非轮回亲本，无叶舌)做供体、京92(可购自北京市农林科学院玉米研究中心)(轮回亲本，有叶舌，杂交种京科968的父本)做受体杂交组配f1代，收获f1代的种子。同年冬海南第一代，种植f1代的种子，得到f1代玉米植株。2、回交一次bc1代的获得(1)回交以f1代植株做母本，继续与轮回亲本京92回交，收获bc1代的种子。同年冬海南第二代，种植bc1代群体的种子，得到bc1代群体。(2)bc1代分子标记辅助前景选择对通过田间表型选择初步入选的bc1代单株，首先利用目标性状选择标记进行检测，选择核苷酸序列如seqidno.1-2的分子标记鉴别，若扩增产物大小为193/230bp，并且选择核苷酸序列如seqidno.3-4所示的分子标记鉴别时，若扩增产物大小为153/157bp，则待测玉米具有lg1基因，可作为前景选择的入选单株，进行下一步的分子标记辅助背景选择。本实施例同时利用上述2个分子标记进行辅助选择，综合二者的结果进行选择，以获得最准确的筛选结果。样品的基因组dna采用ctab提取，浓度稀释到200ng/μl。合成的分子标记引物用灭菌的ddh2o稀释至终浓度为10pm，将待测样品的dna进行pcr扩增。pcr反应为20μl体系，dna模板1μl，上下游混合后的引物1μl，mix(含2×buffer)10μl，ddh2o为8μl。反应程序：预变性，94℃，3min；pcr循环30次(变性，94℃，30s；退火，55℃，30s；延伸，72℃，30s)；最后延伸，72℃，7min。扩增产物利用3730xldna分析仪进行检测。(3)bc1代分子标记辅助背景选择以rla1和京92的dna为模板，对40对ssr引物(参见中国专利zl201310751112.6/cn104285776b)进行pcr扩增和电泳检测，筛选在二者之间存在多态性的引物。通过扩增产物电泳图谱比对，发现umc1335y5、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi072k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、umc1506k12、umc1147y4、bnlg1671y17、phi96100y1、umc1536k9、bnlg1520k1、bnlg490y4、umc1999y3、umc2115k3、umc1429y7、bnlg249k2、phi299852y2、umc2160k3、bnlg2235y5、umc2084w2、phi041y6、umc2163w3等30对引物在rla1和京92上存在差异。利用30对差异引物对分子标记辅助前景选择入选的单株进行检测，与京92得到的对应pcr扩增图谱进行比较。根据扩增结果，选取与京92差异等位基因数最少的前10-15个单株作为进一步回交的母本。3、回交二次bc2代的获得(1)回交选取与京92差异等位基因数最少的前10-15个单株作母本，以京92作为父本，组配bc2代。次年夏，种植bc2代群体的种子，按穗行田间种植，每个穗行种植50株。(2)bc2代分子标记辅助前景选择对通过田间表型选择初步入选的单株，首先利用目标性状选择标记进行检测，将核苷酸序列如seqidno.1-2所示的分子标记扩增产物为193/230bp、同时核苷酸序列如seqidno.3-4所示的分子标记扩增产物为153/157bp的单株挑选出来，作为前景选择的入选单株，进行下一步的分子标记辅助背景选择。(3)bc2代分子标记辅助背景选择利用bc2代单株对应的母本bc1代与京92扩增带型不同的ssr引物对，对分子标记辅助前景选择入选的单株进行pcr扩增；与京92得到的对应pcr扩增图谱进行比较。选取与京92无差异等位基因的单株作为进一步回交的母本。4、回交三次bc3代的获得(1)回交以bc2代中与京92无差异等位基因的单株作母本，以京92作为父本，组配bc3f1代。种植bc3f1代群体的种子，按穗行田间种植，每个穗行种植50株。(2)bc3代分子标记辅助前景选择对通过田间表型选择入选的单株，首先利用目标性状选择标记进行检测，将核苷酸序列如seqidno.1-2所示的分子标记扩增产物为193/230bp、同时核苷酸序列如seqidno.3-4所示的分子标记扩增产物为153/157bp的单株挑选出来进入下一代。5、bc3f2代的获得(1)自交：通过前景选择入选的bc3f1代单株，进行自交得到bc3f2。田间种植bc3f1代群体的种子，按穗行田间种植，每个穗行种植50株。(2)bc3f2代目标性状表型选择在bc3f2代植株中选择无叶舌性状的植株继续自交，即获得了遗传背景与京92基本一致，同时表现无叶舌性状的新自交系，命名为京92y。实施例3改良京科968株型以获得叶夹角缩小的玉米杂交种京科968是由北京农林科学院玉米研究中心用京724×京92选育而成的玉米品种。本实施例以玉米自交系京724作母本，以实施例2获得的无叶舌自交系京92y做父本组配，获得了比原京科968(由京724与京92组配获得)叶夹角缩小10度左右、其他性状与原品种京科968无明显差异的紧凑型玉米杂交种。虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京市农林科学院<120>分子标记辅助快速缩小玉米叶夹角改良京科968株型的方法<130>khp181111066.5<160>18<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aggcaactcctgtgtctgtgt21<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2catgatcgcccactcctt18<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3taaagctatgatggcacttgcaga24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4catatttgcctttgcccttttgta24<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gccctgttattggaacagtttacg24<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cgtcgtcttcgacatgtacttcac24<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ttcttgcttgtctctagcagctt23<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tgtggcgatgtccatgatt19<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tatcttcagacccaaacatcgtcc24<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gtcgattgatttcccgatgttaaa24<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gagatcaccggctagttagagga23<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gtatggttgggtacccgtctttcta25<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13catacgtaatcctacgcgacaaca24<210>14<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ttgtgaaacaaaaagaaagcacga24<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15acatcagagcacaccactgc20<210>16<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16tgtgggatgtggtctctaacg21<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gcaaatgttttcacacacacg21<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gtgcagaatgcaggcaatag20当前第1页12