本发明属于甘蓝育种技术领域，具体涉及结球甘蓝无蜡粉亮叶育种纯合材料的创制方法。
背景技术：
结球甘蓝又称包菜、卷心菜、圆白菜等，属十字花科芸苔属甘蓝种，具有营养价值丰富，抗性强，适应性广，易栽培，产量高等特点，世界各地普遍种植，也是我国主要蔬菜作物之一。甘蓝植株表面的蜡粉多少是决定商品品质的一个重要指标。蜡粉少商品叶色亮绿，感官好，品质优良，受到消费者欢迎。选育球色绿的甘蓝品种是育种工作者的主要育种目标之一。在中国长江流域及以南地区，牛心(尖球)类型甘蓝一直是大家喜欢种植和消费的品种类型，但牛心甘蓝普遍存在蜡粉较多、球色不够绿的问题。
在育种工作中，于优良牛心型纯合材料‘429wt’(图1和2)的超大群体中，发现了其蜡粉缺失突变体‘429mt’(图1和2)。对其营养生长期和生殖生长期的农艺性状调查显示，野生型和突变体除蜡粉有无(多少)的显著差异外，其他农艺性状指标均无显著差异。经对其蜡粉缺失性状遗传规律分析，‘429mt’的蜡粉缺失性状由隐性单基因控制。由隐性基因控制的无蜡粉亮叶性状作为亲本材料利用，需另一亲本同样具有该隐性基因，才能培育出具有无蜡粉亮叶性状的杂种一代。含有该隐性性状的新纯合材料的创制，利用传统育种程序，需要经过与其他材料间的杂交、多代自交、回交转育；培育出一个新的含有该无蜡粉亮绿性状的育种纯合材料大约需要8年以上时间。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供结球甘蓝无蜡粉亮叶育种纯合材料的创制方法，利用传统育种与生物技术育种相结合的技术手段，解决现有育种技术中隐性性状转育时间漫长的技术问题，加快培育新的结球甘蓝无蜡粉亮叶种质资源，以期创新结球甘蓝种质资源，改良现有品种的叶色商品性状。
为了实现本发明目的，本发明一种结球甘蓝无蜡粉亮叶育种纯合材料的创制方法，包括以下步骤：
(1)以无蜡粉亮叶结球甘蓝突变体纯合材料429mt为母本，有蜡粉结球甘蓝优良纯合材料为父本进行杂交，获得杂交f1代种子；所述的无蜡粉亮叶结球甘蓝突变体纯合材料429mt保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏号为：cctccno:p201801；
(2)选取f1代单株进行自交，获得f2代种子；
(3)在结球期，从f2代群体中选取无蜡粉亮叶优良株系；
(4)在开花期，对选取的f2代株系通过包括胚胎发生、胚植株再生、再生植株倍性鉴定、单倍体加倍在内的技术进行游离小孢子培养；
(5)在结球期，选取性状优良的无蜡粉亮叶株系，移栽到大棚内待翌年春季进行自交授粉，留种，从而获得无蜡粉亮叶育种纯合材料。
所述步骤(1)中的无蜡粉亮叶突变体材料为野生型纯合材料429wt(尖球类型)自然突变产生，经遗传分析该突变体含有亮绿单基因隐性遗传基因，编号为429mt，保藏于cctcc，保藏日期为2018.1.10，保藏编号为cctccno:p201801，其特征为：早熟，球形尖，耐抽薹，耐寒性强。
本发明中，作为父本的有蜡粉纯合材料可以为任何一个结球甘蓝材料。进一步，所述的有蜡粉优良甘蓝纯合材料分别选自423、09c2112、09c1593、z1733-6、683-2。
所述的步骤(1)和步骤(2)中杂交和自交授粉的具体操作方法如下：在开花期将花序套上硫酸纸袋，待每枝花序开放5～7朵花后，剥蕾进行杂交或自交授粉，然后再套上纸袋，并在纸袋上用授粉镊子尖扎数个小孔以利于通风透气，整枝花序授粉完毕后去掉未授粉花蕾，7天后去掉纸袋。
步骤(4)所述的胚植株再生阶段，小孢子胚诱导植株再生方法为：将获得的胚状体转至含有0.15mm丁胱亚磺酰亚胺的b5培养基(琼脂浓度为1.0％，蔗糖浓度为2％，ph5.8，不含激素)上，于三角瓶中继续培养1～2周长成幼苗。
步骤(4)对选取的f2代株系进行游离小孢子培养的步骤如下：
选取单核靠边期花蕾，灭菌后加入适量b5液体培养基(ph＝6.0)，研磨、过滤、离心后取沉淀，用nln-13液体培养基(ph＝6.0)将小孢子密度调至1×105ml-1，加入适量的活性炭(ac)分装到无菌玻璃培养皿中进行培养；经33℃热激培养1d后转入25℃暗培养，直至胚状体产生；将获得的胚状体转至含有0.15mm丁胱亚磺酰亚胺的b5固体培养基(琼脂浓度为1.0％，蔗糖浓度为2％，ph5.8)上，于三角瓶中继续培养直至成幼苗；7～9月份，采用气孔保卫细胞叶绿体计数法对再生植株群体组培苗进行倍性鉴定；9月下旬，将经鉴定为单倍体的再生植株植株根部浸泡在含2％二甲基亚砜浓度为0.3％的秋水仙素溶液中处理18h进行加倍，然后将经气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定为双单倍体的植株，以及经秋水仙素加倍处理的植株移入穴盘驯化，15天后定植到田间。
无蜡粉亮叶结球甘蓝突变体纯合材料429mt在培育结球甘蓝无蜡粉亮叶育种纯合材料中的应用。
有益效果
本发明利用牛心型结球甘蓝无蜡粉亮叶突变体为材料，采用传统育种技术与游离小孢子培养技术相结合，加速结球甘蓝无蜡粉亮叶新种质的创制，为进一步新品种的创制和改良奠定基础。本发明提供的一结球甘蓝无蜡粉亮叶育种纯合材料的创制方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
(1)本发明利用的牛心型结球甘蓝无蜡粉亮叶突变体，其农艺性状优良，具有耐抽薹、耐寒、球形美观等特点，是一个非常优异的种质资源。
(2)本发明将传统育种技术与游离小孢子培养技术相结合，使得具有无蜡粉亮叶育种纯合材料的创制3～4年即可完成，加速了种质资源的培育进程。
(3)本发明在游离小孢子培养的胚再生植株阶段，在胚再生植株的b5培养基中添加了0.15mmbso(丁胱亚磺酰亚胺)，提高了胚再生植株的转化频率。
生物材料保藏信息
429mt，分类命名为结球甘蓝种子429mtbrassicaoleracal.varcapitatal.429mt，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年1月10日，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：cctccno:p201801。
附图说明
图1优良牛心型纯合材料429wt和429mt结球期的照片
图2优良牛心型纯合材料429wt和429mt莲座期的照片
具体实施方案
实施例1
以‘429mt’单株为母本，分别以有蜡粉结球甘蓝纯合材料423(曾爱松，高兵，宋立晓，李健绮，严继勇.牛心甘蓝新品种探春的选育.长江蔬菜，2011，(22):9-11),09c2112、09c1593(曾爱松，高兵，宋立晓，严继勇.早熟春甘蓝新品种‘春喜’.园艺学报，2015，42(s2)：2889-2890)、z1733-6(曾爱松，高兵，宋立晓，严继勇.秋季专用牛心甘蓝新品种锦秋55的选育.江苏农业科学,2015,43(11):230-231)、683-2(曾爱松，宋立晓，高兵，严继勇.秋季专用平头甘蓝新品种锦秋60的选育.长江蔬菜，2015，(4):10-12)为父本进行杂交，具体操作方法是：将花序套上硫酸纸袋，待每枝花序开放5～7朵花后，剥蕾进行杂交授粉，然后再套上纸袋，并在纸袋上用授粉镊子尖扎数个小孔以利于通风透气，整枝花序授粉完毕后去掉未授粉花蕾，7天后去掉纸袋，待种荚里种子变褐后收获种子。于7月中旬播种，11月初选取单株移栽到授粉棚，翌年自交获得f2代种子。在f2代群体中选取无蜡粉、综合性状优良株系移栽到授粉棚，翌年开花期进行游离小孢子培养。游离小孢子培养的步骤为：选取单核靠边期花蕾，灭菌后加入适量b5液体培养基(ph＝6.0)，研磨、过滤、离心后取沉淀，用nln-13(ph＝6.0)液体培养基将小孢子密度调至1×105ml-1，加入适量的活性炭(ac)分装到无菌玻璃培养皿中进行培养。经33℃热激培养1d后转入25℃暗培养，直至胚状体产生。将获得的胚状体转至含有0.15mm丁胱亚磺酰亚胺的b5固体培养基(琼脂浓度为1.0％，蔗糖浓度为2％，ph5.8)上，于三角瓶中继续培养直至成幼苗。7～9月份，采用气孔保卫细胞叶绿体计数法对再生植株群体组培苗进行倍性鉴定。9月下旬，将经鉴定为单倍体的再生植株植株根部浸泡在含2％二甲基亚砜浓度为0.3％的秋水仙素溶液中处理18h进行加倍，然后将经气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定为双单倍体的植株，以及经秋水仙素加倍处理的植株移入穴盘驯化，15天后定植到田间。其中对游离小孢子培养的胚植株再生阶段的培养体系做了优化改良：将获得的胚状体转至0.15mmbso(丁胱亚磺酰亚胺)的b5固体培养基(琼脂浓度为1.0％，蔗糖浓度为2％，ph5.8，不含激素)上，于三角瓶中继续培养1～2周长成幼苗。在结球期，选取性状优良的无蜡粉亮叶株系，移栽到大棚内待来年春季进行自交授粉，留种。从而获得无蜡粉亮叶育种纯合材料。
参考文献：
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