本发明涉及一种诱导育珠方法，具体而言，涉及一种促进三角帆蚌珍珠囊发育和珍珠生长的方法及其应用。
背景技术：
稀土(rareearth)是一族有色金属元素的总称，其理化性质与ca2+相似。研究表明稀土元素在生物体内具有较强的生理活性，适宜浓度的稀土元素能激活许多酶系统，充当金属活化剂的作用，具有类激素和“超级钙”的生物学效应[1-5]。因此，稀土被广泛应用于农、畜牧业等领域的生产实践中[6]。
三角帆蚌(hyriopsiscumingii)俗称河蚌，属瓣鳃纲、珠蚌科、帆蚌属，是我国主要的淡水育珠蚌，也是我国特有的重要水产养殖品种[7]。我国是世界上第一淡水珍珠生产国，产量已占全球总产量的96％[8]，但劣珠所占比例高，产值仅占全球珍珠总产值的10％。产量与产值的强烈反差，严重影响了淡水珍珠养殖的经济效益，不利于珍珠养殖业的可持续发展。因此，如何通过改进珍珠养殖技术提高珍珠品质是当前生产实践中亟待解决的问题之一。
已有研究表明，在三角帆蚌养殖水体中添加适量的稀土元素不仅能够促进珍珠的生长[9-11]，而且能够改善珍珠表面光泽并提高珍珠品质[12]，其作用的效应可能与稀土促进育珠蚌珍珠囊组织的钙代谢活动有关[3]。但是，目前国内外还未见稀土元素对育珠蚌珍珠囊发育的报道，稀土元素促进珍珠囊发育和珍珠生长及品质提升的确切作用机理仍不清楚。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明以淡水育珠蚌三角帆蚌为实验对象，通过在三角帆蚌植片手术过程中对组织小片的稀土铈处理，研究不同浓度cecl3处理后三角帆蚌珍珠囊在发育不同阶段中形态结构特征的变化以及珍珠表面结构特征、沉积量及圆度的差异，分析稀土铈处理对珍珠囊发育的影响；明确珍珠植片手术操作中人为添加稀土元素促进珍珠生长，提高珍珠品质的浓度范围，为稀土在珍珠养殖中的安全合理应用提供科学依据和实践指导。
本发明涉及一种促进三角帆蚌珍珠囊发育和珍珠生长的方法，包括：
用含有稀土元素铈的溶液浸泡供片蚌组织小片后对育珠蚌进行植片手术，术后对所述育珠蚌进行培养；
所述育珠蚌和所述供片蚌均为三角帆蚌。
如上所述的方法在三角帆蚌所培育珍珠生长前期促进珍珠质的沉积并提高珍珠的圆度中的应用。
稀土元素在贝类等生物体内具“超级钙”的生物学效应。已有的研究表明养殖水体中添加适宜浓度的稀土元素，可提高三角帆蚌体内的钙代谢水平，显著加快育珠蚌珍珠囊形成，并促进珍珠生长。然而，稀土元素促进珍珠囊发育和珍珠生长及品质提升的确切作用机理仍不清楚。本发明通过在三角帆蚌植片过程中滴加不同浓度的cecl3，研究不同处理植片后不同阶段珍珠囊的形态结构特征变化和珍珠表面结构特征、沉积量及圆度差异，探究稀土铈处理对珍珠囊发育影响的作用机制。结果表明：cecl3溶液适宜浓度范围为10-3mol/l左右，且稀土铈处理可以在珍珠囊发育早期(6-12天)促进无颗粒细胞进入组织小片中央间隙，加快组织小片结缔组织与育珠蚌结缔组织的融合，加快组织小片表皮细胞从扁平状向高柱状再恢复扁平状的生长转变，从而促进珍珠囊的快速形成。研究结果同时表明，适宜浓度的稀土铈处理能够在珍珠生长前期(2个月)促进珍珠质的沉积并提高珍珠的圆度；然而，这种效应在珍珠生长至4个月时并不明显，表明稀土铈处理对珍珠的生长具有时效性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中植片手术后6天的三角帆蚌珍珠囊组织形态学显微观察图；
a：10％g处理6天(10×4)；a：10％g处理6天(10×40)；b：10-2mol/lcecl3处理6天(10×4)；b：10-2mol/lcecl3处理6天(10×40)；c：10-3mol/lcecl3处理6天(10×4)；c：10-3mol/lcecl3处理6天(10×40)；d：10-4mol/lcecl3处理6天(10×4)；d：10-4mol/lcecl3处理6天(10×40)；e：10-5mol/lcecl3处理6天(10×4)；e：10-5mol/lcecl3处理6天(10×40)；注：箭头所指为珍珠囊外表皮细胞，尾端带圆点的箭头所指为无颗粒细胞；
图2为本发明一个实施例中植片手术后12天的三角帆蚌珍珠囊组织形态学显微观察图；
a：10％g处理12天(10×4)；a：10％g处理12天(10×40)；b：10-2mol/lcecl3处理12天(10×4)；b：10-2mol/lcecl3处理12天(10×40)；c：10-3mol/lcecl3处理12天(10×4)；c：10-3mol/lcecl3处理12天(10×40)；d：10-4mol/lcecl3处理12天(10×4)；d：10-4mol/lcecl3处理12天(10×40)；e：10-5mol/lcecl3处理12天(10×4)；e：10-5mol/lcecl3处理12天(10×40)；注：箭头所指为无颗粒细胞；
图3为本发明一个实施例中不同溶液处理12d后的珍珠质小片在扫描电子显微镜观察图；
a：10％葡萄糖溶液对照处理组(5000×)；b：10-2mol/lcecl3处理(5000×)；c：10-3mol/lcecl3处理(5000×)；
d：10-4mol/lcecl3处理(5000×)；e：10-5mol/lcecl3处理(5000×)。
具体实施方式
本发明涉及一种促进三角帆蚌珍珠囊发育和珍珠生长的方法，包括：
用含有稀土元素铈的溶液浸泡供片蚌组织小片后对育珠蚌进行植片手术，术后对所述育珠蚌进行培养；
所述育珠蚌和所述供片蚌均为三角帆蚌。
优选的，如上所述的促进三角帆蚌珍珠囊发育和珍珠生长的方法，所述含有稀土元素铈的溶液中ce3+的含量为10-4～10-2mol/l；更优选为0.5μm～1.5μm；也可以选择0.7μm～1.3μm，或0.9μm～1.1μm，最优选为1μm。
优选的，如上所述的促进三角帆蚌珍珠囊发育和珍珠生长的方法，所述含有稀土元素铈的溶液为含有cecl3的溶液。
优选的，如上所述的促进三角帆蚌珍珠囊发育和珍珠生长的方法，所述含有稀土元素铈的溶液所用溶剂为葡萄糖溶液，更优选为5w/v％～15w/v％的葡萄糖溶液。
优选的，如上所述的促进三角帆蚌珍珠囊发育和珍珠生长的方法，所述浸泡的时间为3min～10min；更优选为5min～8min。
优选的，如上所述的促进三角帆蚌珍珠囊发育和珍珠生长的方法，所述培养具体为术后的育珠蚌移至大棚放于吊网中培育6h～24h天，水温28±2℃，ph6.8～8.0。
优选的，如上所述的促进三角帆蚌珍珠囊发育和珍珠生长的方法，所述供片蚌及育珠蚌均为1龄蚌，体长8cm～10cm。
如上所述的方法在三角帆蚌所培育珍珠生长前期促进珍珠质的沉积并提高珍珠的圆度中的应用。
优选的，如上所述的应用，所述珍珠生产前期具体为在珍珠生长的第0～3个月，更优选为0～2个月。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
1.材料与方法
1.1.实验材料
供片蚌和育珠蚌为1龄，体健无病，体长为8-10cm。
1.2.植片手术操作及育珠蚌养殖
珍珠植片实验于2017年4月23-24日在浙江某三角帆蚌省级良种场进行。三角帆蚌的植片手术，方法参照张根芳[13]。全部植片由单个熟练操作工完成。手术后的三角帆蚌经流动清水养殖半天后移至大棚养殖中，放于吊网中培育，水温28±2℃，ph6.8–8.0。
1.3.不同稀土铈浓度下的植片实验
植片方法同1.2，5个处理组分别用含有cecl3浓度为0、10-2、10-3、10-4、10-5mol/l的10％葡萄糖溶液滴片浸泡5分钟后进行植片。6天后，5个处理组每组随机选择2只三角帆蚌取用珍珠囊，用多聚甲醛溶液固定，用于组织化学观察。
1.4.组织化学分析
在植片手术后第6、12天分别从5个处理组中，各取出2只三角帆蚌的珍珠囊，同步取用2017年常规植片第6、12天蚌的珍珠囊，使用多聚甲醛溶液固定；将组织样品制作组织装片，进行包埋、切片、脱蜡和he染色，方法参照尹立鹏[14]，用尼康80i荧光显微镜进行珍珠囊组织结构观察。
1.5.珍珠质沉积量及其圆度的测定
在植片手术后第12天，2、4个月，分别从5个处理组随机选择4、11、24只三角帆蚌，取出珍珠，在5％naocl溶液中浸泡10min，用蒸馏水冲洗干净，烘干后测定沉积量。其中2、4个月的珍珠沉积量用平均单粒珍珠质量(mg)表示，圆度用长轴直径/短轴直径表示。
1.6.sem晶体结构分析
将珍珠小片从已发育12天的珍珠囊中取出，用无水乙醇、75％酒精进行超声清洗，随后用na2edta溶液处理8秒后立即取出，用去离子水冲洗，空气晾干。珍珠表面的晶体结构采用日本电子(jeol)jsm-6360lv型扫描电子显微镜进行分析。
1.7.数据处理与分析
实验结果用spss24.0统计软件进行差异显著性分析，数据以平均数±标准偏差表示，采用单因素方差分析法(anova)，进行邓肯检验(p＜0.05)。
2.结果与讨论
2.1.稀土铈处理对植片手术后6天的三角帆蚌珍珠囊形成的影响
从图1可知，植片手术后6天，葡萄糖对照组组织小片外表皮细胞无序排列且扁平，cecl3溶液各处理组的组织小片外表皮细胞开始呈柱状且紧密排列。同时，五个实验组育珠蚌中无颗粒细胞均进入组织小片中央间隙。与对照组相比，稀土铈各处理组的组织小片中央间隙中无颗粒细胞更为密集，并且随cecl3处理浓度增加，组织小片中央间隙更大，且无颗粒细胞更多。研究表明，在珍珠囊的形成过程中，无颗粒细胞具有非常重要的作用，与修补伤口、诱导植入的外套膜表皮细胞的迁移、非自身物质的识别排斥等免疫反应都有着密切关系[18,19]。最近的研究表明，无颗粒细胞等血细胞能在胞内形成caco3晶体分泌至贝壳损伤部位参与贝壳的矿化过程[20-22]。因此，本研究中植片手术后6天，与对照组相比，稀土铈促进育珠蚌组织小片中央间隙内无颗粒细胞等血细胞的聚集从而加快珍珠囊发育和快速形成，并且发育程度与稀土铈的浓度密切相关。
2.2.稀土铈处理对植片手术后12天的三角帆蚌珍珠质沉积量、珍珠圆度及珍珠质表面微结构的影响
从图2可知，植片手术后12天，各实验组中珍珠囊腔部分展开，组织小片结缔组织与育珠蚌结缔组织融合较明显，出现珍珠质包裹无颗粒细胞的现象，且无颗粒细胞逐步凋亡，与植片手术后6天相比，无颗粒细胞明显减少。10-3、10-4mol/lcecl3处理组珍珠囊中无颗粒细胞相较其他处理组较少，但10-2mol/lcecl3处理组仍存在较多无颗粒细胞，推测可能是因为高浓度cecl3处理对珍珠囊发育存在一定的抑制作用。这与杨晓斌等[23]所报道的ce3+对三角帆蚌产生“低促高抑”的影响的观点相符。
表1稀土铈对三角帆蚌12天，2、4个月珍珠质沉积量及圆度的影响
注：圆度用珍珠长轴直径/短轴直径表示，值越接近1圆度越好。
从表1中可知，植片手术后12天，与对照组相比，用10-2、10-3、10-4、10-5mol/lcecl3溶液处理的蚌珍珠质沉积量呈先增加后减少的趋势，其中10-3mol/lcecl3溶液处理组三角帆蚌单粒珍珠质量高于其余各组水平，但差异并不显著。
由图3可知，对照组的珍珠层晶体大部分形态呈不定型acc相，部分晶体形态呈球状多聚集态，为球文石。10-3和10-4mol/lcecl3处理组晶体形态以六边形为主，其间存在间隙。10-2mol/lcecl3处理组除规则六边形晶体外，还存在一部分有机质(图3-b箭头所指)。10-5mol/lcecl3处理组晶体形态接近六边形，相较对照组晶体形态较为规整，且晶体间存在较大空隙。
因此，手术后12天，与对照组相比，稀土铈促进了三角帆蚌珍珠囊发育，促进其珍珠质沉积且在珍珠caco3晶体的早期生长中发挥了一定作用。这与张元培[9]报道的铈对三角帆蚌珍珠囊发育的影响稀土对珍珠质分泌具有显著的作用相符。
2.3.稀土铈处理对植片手术后2、4个月的三角帆蚌珍珠质沉积量及圆度的影响
由表1可知，手术后2个月，与对照组相比，10-3mol/lcecl3浓度处理组的单粒珍珠质量高于其余各组水平，但差异并不显著。手术后2个月，10-2、10-3mol/lcecl3浓度处理组的珍珠圆度显著优于对照组和10-5mol/lcecl3浓度处理组(p＜0.05)；手术4个月，珍珠圆度除10-4mol/lcecl3浓度处理组较高外其余各实验组无显著差异。
由此可知，稀土铈对三角帆蚌早期珍珠囊发育及珍珠生长具促进作用，但持续时间较短，其对珍珠生长和圆度提高的长期效应并不显著。2.4.最佳浓度下稀土铈植片时滴片和手术后泼洒两种处理方式下对珍生长性状的影响
在确定了稀土铈的最佳处理浓度后，申请人检测了本申请所采用的滴片处理法和泼洒处理的区别。稀土铈植片手术后育珠蚌养殖水体泼洒处理方式为：将与滴片处理同批手术的育珠蚌放养在16m3大小的小池中，均匀泼洒氯化铈母液至水体浓度为3.6×10-6mol/l并进行育珠蚌培育。
表2最佳浓度下稀土铈植片时滴片和手术后泼洒两种处理方式下珍珠培育2个月时的生长性状
注：1、滴片处理最佳稀土氯化铈浓度为10-3mol/l，育珠蚌养殖水体中泼洒稀土氯化铈浓度为3.6×10-6mol/l。
2、圆度用珍珠长轴直径/短轴直径表示，值越接近1圆度越好。
由上表可知，滴片法与泼洒处理法相比，所得到的珍珠更大，且圆度更佳。
3.结论
本发明研究结果表明cecl3溶液适宜浓度范围为10-3mol/l左右，且稀土铈处理可以在珍珠囊发育早期(6-12天)促进无颗粒细胞进入组织小片中央间隙，加快组织小片结缔组织与育珠蚌结缔组织融合，加快组织小片表皮细胞从扁平状向高柱状再恢复扁平状的生长转变，从而促进珍珠囊的快速形成。研究结果同时表明，适宜浓度的稀土铈处理能够在珍珠生长前期(2个月)促进珍珠质的沉积并提高珍珠的圆度；然而，在这种效应在珍珠生长至4个月时并不明显，表明稀土铈处理对珍珠的生长具有时效性。本发明结果将为稀土铈在淡水珍珠养殖中的应用提供理论依据，本发明结果将为稀土铈在淡水珍珠手术植片中的应用提供理论依据，同时也可降低在养殖水体中泼洒稀土元素带来的环境生态风险。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
参考文献：
[1]邱关明，李幼荣，陈石燕，周兰香，李伟，张明.稀土对生物机体剂量效应机理的研究进展[j].稀土,2003,(01):49-56
[2]邱关明，李伟，李喜坤，周威，杨春生.biologicalintelligenceofrareearthelementsinanimalcells[j].journalofrareearths,2005,(s1):554-573
[3]施维林，陈瑛.铈对三角帆蚌钙代谢影响的研究[j].中国稀土学报,2013,(3):344-352
[4]郑大恒，曾文涛，韩继卫，罗文，弭忠祥，杨受保.稀土元素镧对三角帆蚌(hyriopsiscumingii)早期珍珠色泽的影响[j].海洋与湖沼,2013,(3):677-683
[5]郝鲁宁，余叔文.大麦根细胞质膜ca2+-atp酶和ca2+转运系统的特性[j].植物生理学报,1993,(02):172-180
[6]秦俊法，陈祥友，李增禧.稀土的生物学效应[j].广东微量元素科学,2002,(03):1-16
[7]白志毅，汪桂玲，刘晓军，李家乐.中国淡水珍珠种业现状与发展趋势[j].上海海洋大学学报,2014,23(06):874-881
[8]张根芳，方爱萍.21世纪中国淡水珍珠产业的发展态势[j].金华职业技术学院学报,2003,(04):24-29
[9]张元培，韩德举.re对三角帆蚌珍珠质促泌作用适宜剂量的研究[j].浙江水产学院学报,1995,14(4):238-242
[10]张元培，陆春明.稀土促长珍珠的应用方法[j].淡水渔业,1995(6):39-40
[11]刘海中，孙天福.稀土元素对提高珍珠产量初试[j].城乡致富,1990(4):27-28
[12]施维林.稀土元素铈对珍珠微形貌的影响[j].甘肃农业大学学报,2010,8(4):46-50
[13]张根芳，方爱萍.淡水育珠手术操作系统化消毒技术[j].经济动物学报,2003,(01):44-47
[14]尹立鹏.两种规格马氏珠母贝育珠期的生长、消化酶活力及珍珠囊发育的比较[d].广东海洋大学,2011
[15]焦钰，师尚丽，杜晓东，逯云召，王庆恒.马氏珠母贝珍珠囊发育的组织和组织化学研究[j].广东海洋大学学报,2010,30(4):7-10
[16]石安静，张矛，吴中文，彭学芳.三角帆蚌珍珠囊形成的研究[j].水产学报,1985,(03):247-253
[17]徐在宽，徐大中，武擎.温度对三角帆蚌生理影响的研究[j].水产科学,1988,(03):9-11
[18]和田浩爾.淡水産二枚貝の同種外套膜移植および異種外套膜移植[j].貝類学雑誌venus:thejapanesejournalofmalacology,1989,48:174-191
[19]suzukit,yoshinakar,mizutas,sfunakoshi,kwada.extracellularmatrixformationbyamebocytesduringepithelialregenerationinthepearloysterpinctadafucata[j].cell&tissueresearch,1991,266(1):75-82
[20]kishorep,southgatepc.adetaileddescriptionofpearl‐sacdevelopmentintheblack‐lippearloyster,pinctadamargaritifera(linnaeus1758)[j].aquacultureresearch,2016,47(7):2215-2226
[21]praneshk,southgatepc.developmentandfunctionofpearl-sacsgrownfromregeneratedmantlegrafttissueintheblack-lippearloyster,pinctadamargaritifera(linnaeus,1758)[j].fish&shellfishimmunology,2015,45(2):567-73
[22]nathaliecl,carolinem,deniss,angéliquef,peval,cedrikl.ahistologicalexaminationofgraftingsuccessinpearloyster,pinctadamargaritiferainfrenchpolynesia[j].2010,23(1):131-140
[23]杨晓斌，吴波.铈对三角帆蚌肝脏抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响[j].水利渔业,2008,28(3)。