本发明涉及作物的栽培技术，尤其涉及紫果西番莲顶梢的组培育苗方法。
背景技术：
西番莲(学名:passifloracaeruleal.)，为多年生常绿攀缘木质藤本植物，是一种芳香可口的水果，有"果汁之王"的美誉。其果实内含有丰富的钙、铁、磷等微量元素及17种氨基酸等物质，除食用外，还具有良好的保健和药用功效。据测定，西番莲果实含有超过135种以上的芳香物质，最适于加工成果汁。但种植西番莲病害较严重，主要有根腐病、疫霉病、炭疽病和花叶病等，特别是在多年生果园中，病害越发严重，造成落果和残次果增多，对果园产量和品质产生严重影响。研究表明，西番莲病害主要与幼苗自身携带的百香果花叶病毒cmv和木质化病毒pwv有关，最佳解决途径是采取组培的方式培育脱毒幼苗。
西番莲组培育苗有较多报道。国外以叶为外植体主要开展了西番莲、木栓西番莲、臭味西番莲、黄果西番莲等种类的组织培养，多数以ms为基本培养基。研究表明：在相同激素配方下，不同种类的诱导分化情况不同，例如用1mg.l-1细胞分裂素6-ba与1mg.l-1生长素naa组合后,西番莲、木栓西番莲在试管内可形成芽及梢，而臭味西番莲却只长根,黄果西番莲仅有愈伤组织产生。程治英等（1986）对紫果西番莲叶片、茎段也采用ms培养基开展组织培养，研究表明：丛生芽分化仅在2～4mg.l-16-ba与0.4mg.l-1iaa组合中见到，分化率仅有5～20%；6-ba浓度降到0.5mg.l-1以下后，有利于芽丛长高形成无根苗；根诱导最佳培养基为1/8ms，添加浓度均为0.2mg.l-1iaa和naa，生根率为67.0%。韦经杰等（cn1o579464oa）公开了一种黄金百香果茎段的组培育苗方法，认为在ms培养基中添加0.05～0.35mg.l-1iaa、12～22mg.l-1亮氨酸和1.5～3.5g.l-1甘油后，有利于丛生芽诱导培养；在ms培养基中添加0.2～0.55mg.l-1iaa、0.5～3.0mg.l-1naa、15～50mg.l-1亮氨酸和2.5～5.0g.l-1甘油后，有利于丛生芽继代增殖培养；在ms培养基中添加1.2～4.5mg.l-1iaa、1.5～4.0mg.l-1naa、35～80mg.l-1亮氨酸和8～12g.l-1甘油，有利于无根苗炼苗培养。用重量比2∶1.5∶3的蘑菇菌包、有机肥和风干塘泥为基质，用壮苗后的无根苗瓶外生根。robles(1978)对贡呆西番莲和密柔毛西番莲的腋芽进行试管培养,结果表明，nitsch、blaydes和ms培养基均能诱导腋芽分化愈伤组织，加入2mg.l-1kt效果最好。张玉薇（cn106106175a）
认为在ms培养基中添加0.25～0.3mg.l-1naa和0.35～0.5mg.l-16-ba后，有利于腋芽分化不定芽，在1/2ms培养基中添加0.25～0.3mg.l-1naa和0.35～0.5mg.l-1赤霉素后，有利于无根苗生根；最后在ms培养基中添加0.25～0.3mg.l-1naa有利于生根苗壮苗培养。此外还有利用种子、花药开展组培育苗的研究报道。
针对百香果种苗脱毒的研究也有较多报道。周绪林（cn1o6258965a）公开了一种百香果脱毒苗的培育方法，主要脱毒方式是采用茎尖热水消毒后预培养诱导不定芽，再将得到的组培苗在40℃～45℃下进行热处理3～6d后,剥取新生腋芽0.2cm长的茎尖培育脱毒苗；同时在培养基中添加不同比例的多种抗菌剂。韦中定（cn1o625897oa）公开了一种包含种子热处理、种子消毒处理、砧木培养、茎尖消毒处理、茎尖热处理、接穗繁殖、茎尖嫁接、生根培养、检测等技术环节的百香果脱毒苗培育方法。中国专利申请公布号cn105284314a、cn105706935a等专利均公开了百香果脱毒苗的培育方法，cn105519418a还公开了一种西番莲组培苗的移栽方法。已有西番莲种苗脱毒方法均存在操作程序比较复杂，外植体均来源于可能携带病毒、病菌的成熟器官或组织，单一茎尖热处理脱毒效果不稳定等问题。西番莲刚萌发的顶梢属于分化能力较强的幼嫩组织，几乎未带病毒、病菌，因消毒处理后容易褐变，目前采用西番莲幼嫩顶梢做外植体，采用细胞分裂素tdz（噻苯隆）与生长素naa组合诱导腋芽分化、愈伤组织分化和丛生芽分化的组培育苗方法未见报道。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种能显著降低紫果西番莲幼嫩顶梢褐变率、污染率，提高紫果西番莲顶梢初诱导成活率、丛生芽分化率、移栽成活率等的组培育苗方法，为紫果西番莲良种工厂化育苗利用提供参考依据。
发明人提供的紫果西番莲顶梢的组培育苗方法，包含以下步骤：
（1）外植体消毒：采集刚萌发3～5d的紫果西番莲未展叶幼嫩顶梢做外植体；冲洗干净后，用4500mg.l-1维生素c+1000mg.l-1柠檬酸蒸馏水溶液浸泡45min，然后用2500mg.l-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡30min，用蒸馏水冲洗3～5次，再用1000mg.l-1氯化汞水溶液常规消毒6min，蒸馏水冲洗5次；
（2）基本培养基的确定：植物细胞组织培养各阶段的基本培养基均为：1/2ms+12g.l-1琼脂+30g.l-1蔗糖，ph值5.5；各阶段培养条件为：温度24℃～26℃，光照强度为1500～2000lux，光照时间为12～14h/d；
（3）腋芽初诱导培养：将消毒后的外植体按生长极性竖立接种，诱导腋芽萌发新叶；培养20d后，萌发2～3片新叶；培养基配方：基本培养基+1.2g.l-1ac+1.2g.l-1pvp+0.5mg.l-1tdz+0.05mg.l-1naa；
（4）愈伤组织培养：将初诱导培养产生的叶片剪成面积1cm2小块后接种，诱导愈伤组织分化；培养35d后，产生直径1.6cm的绿色疏松愈伤组织；培养基配方：基本培养基+1.2g.l-1ac+1.2g.l-1pvp+1.2mg.l-1tdz+0.1mg.l-1naa；
（5）继代增殖培养：用镊子轻轻将愈伤组织分成直径0.5cm的小块后接种，诱导丛生芽分化；培养40d后，愈伤组织分化出5-7个丛生芽。培养基配方：基本培养基+1.2g.l-1ac+1.2g.l-1pvp+1.5mg.l-1tdz+0.03mg.l-1naa。
（6）生根诱导培养：将继代增殖形成的丛生芽剪切单芽后接种于的生根培养基上，诱导生根;培养35d后，90%产生根系，每株5～10根，根长0.5～3.0cm;培养基配方：基本培养基+0.1mg.l-16-ba+1.2mg.l-1iba。
（7）瓶苗移栽：将生根培养35天，苗高8cm以上瓶苗揭开瓶盖，每瓶加入20ml蒸馏水，在温度24～26℃的培养室炼苗培养10d；准备基质后进行幼苗移栽；同时进行苗床遮阴，移栽1个月后检查，成活率95%以上。
上述方法的第（7）步中，所述炼苗方法是：将生根培养35天，苗高8cm以上瓶苗揭开瓶盖，每瓶加入20ml蒸馏水，在温度24℃～26℃的培养室炼苗培养10d；所述准备基质是将珍珠岩与砂质黄壤按照体积比1∶2.5混合，装入5cm×5cm的营养袋中，用3500mg.l-1的多菌灵水溶液消毒即得；所述幼苗移栽是将炼苗后的瓶苗取出，用水清洗净根系，置于有少量水分的磁盘中，将幼苗植入已消毒装袋的基质中，每袋1株；所述苗床遮阴是将植苗营养袋挨个放入宽度1m，深度0.3cm的泥底苗床中，然后浇透水；在苗床上搭0.6m高小拱棚，上覆白色地膜和遮阴率40%遮阳网。
发明人指出：方法的第（4）、（5）、（6）步中，所述培养基中添加1.2g.l-1ac和1.2g.l-1pvp，是用来吸附西番莲组培过程中分泌的有害物质和抑制酚类褐变物质的产生。
本发明的创新点：本发明提供的紫果西番莲顶梢组培育苗方法，首先通过采用抗氧化剂vc和柠檬酸蒸馏水溶液浸泡，显著提高幼嫩外植体的抗氧化、抗褐变的能力；然后采用高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡杀菌，不用75%乙醇消毒，显著提高外植体活力；最后通过在初诱导、愈伤组织诱导和继代增殖培养三个阶段的培养基中均添加1.2g.l-1ac和1.2g.l-1pvp来吸附西番莲组培过程中分泌的有害物质和抑制酚类等褐变物质的产生。采用本发明的杀菌、抗褐化处理方法后，可将初诱导污染率、褐化率控制在10%以下，增殖系数5.0以上。原有技术是采用紫果西番莲幼嫩顶梢做外植体，而采用细胞分裂素tdz与生长素naa组合的紫果西番莲组培育苗方法是本发明的创新。
具体实施方式
实施例1：2016年4月的试验
（1）外植体消毒：采集刚萌发3d的紫果西番莲春梢50条，自来水冲洗后，蒸馏水冲洗3遍，剪取长3～4cm的顶部嫩梢做外植体；用4500
mg.l-1vc+1000mg.l-1柠檬酸蒸馏水溶液浸泡45min，蒸馏水冲洗5遍。在超净工作台上，用2500mg.l-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡30min，蒸馏水冲洗3遍；将外植体剪成长2.0cm顶梢，再用1000mg.l-1氯化汞水溶液消毒6min，蒸馏水冲洗5遍；
（2）腋芽初诱导培养：将消毒后的外植体按生长极性竖立接种，培养基配方：基本培养基+1.2g.l-1ac+1.2g.l-1pvp+0.5mg.l-1tdz+0.05mg.l-1naa;共接种50个，培养10d后，4个褐变死亡，褐化率8.0%；其余20d后展出2～3片新叶，初诱导成活率92.0%;
（3）愈伤组织诱导培养：待腋芽新叶面积达2.0cm2后将新叶1分为二，剪成面积1.0cm2小块后接种，培养基配方：基本培养基+1.2g.l-1ac+1.2g.l-1pvp+1.2mg.l-1tdz+0.1mg.l-1naa。共接种80片，培养35d后，73个产生直径1.6cm的绿色疏松愈伤组织；7个褐变死亡；愈伤组织诱导分化率91.3%;
（4）继代增殖培养：用镊子轻轻将愈伤组织分成直径0.5cm的小块后接种，培养基配方：基本培养基+1.2g.l-1ac+1.2g.l-1pvp+1.5mg.l-1tdz+0.03mg.l-1naa。共接种200个，培养40d后，184个愈伤组织分化出丛生芽5～7个，增殖系数5.1;
（5）生根诱导培养：继代增殖培养50d后，丛生芽平均长度达1.5cm以上，将丛生芽剪切成单芽后接种，培养基配方：基本培养基+0.1mg.l-16-ba+1.2mg.l-1iba;共接种800个，培养35d后，723个萌发根系，每株5～10根，生根率90.4%;
（6）各阶段的基本培养基均为：1/2ms+12g.l-1琼脂+30g.l-1蔗糖，ph值5.5；各阶段培养条件为：温度24℃～26℃，光照为1500～2000lux，光照时间为12～14h/d。
（7）瓶苗移栽：将生根培养35d，苗高8cm以上瓶苗揭开瓶盖，每瓶加入20ml蒸馏水，在温度24～26℃的培养室炼苗培养10d；将体积比为1∶2.5的珍珠岩+砂质黄壤混合基质装入5cm×5cm的营养袋中，用3500mg.l-1的多菌灵水溶液消毒；将炼苗后的瓶苗取出，用水清洗净根系，置于有少量水分的磁盘中，将幼苗植入已消毒装袋的基质中，每袋1株；将植苗营养袋挨个放入宽度1m，深度0.3cm的泥底苗床中，然后浇透水；在苗床上搭0.6m高小拱棚，上覆白色地膜和遮阴率40%遮阳网;共移栽定植600株，移栽1个月后检查，572株成活，移栽成活率95.3%。
实施例22017年4月的试验
（1）外植体消毒：采集刚萌发5天的紫果西番莲春梢50条，自来水冲洗后，蒸馏水冲洗3遍，剪取长3～4cm的顶部嫩梢做外植体;用4500mg.l-1vc+1000mg.l-1柠檬酸蒸馏水溶液浸泡45min，蒸馏水冲洗5遍;在超净工作台上，用2500mg.l-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡30min，蒸馏水冲洗3遍;将外植体剪成长2.0cm顶梢，再用1000mg.l-1氯化汞水溶液消毒6min，蒸馏水冲洗5遍。
（2）腋芽初诱导培养：将消毒后的外植体按生长极性竖立接种，培养基配方：基本培养基+1.2g.l-1ac+1.2g.l-1pvp+0.5mg.l-1tdz+0.05mg.l-1naa。共接种50个，培养10d后，2个褐变死亡，褐化率4.0%；其余20d后展出2～3片新叶，初诱导成活率92.0%。
（3）愈伤组织诱导培养：待腋芽新叶面积达2.0cm2后将新叶1分为二，剪成面积1.0cm2小块后接种，培养基配方：基本培养基+1.2g.l-1ac+1.2g.l-1pvp+1.2mg.l-1tdz+0.1mg.l-1naa。共接种80片，培养35d后，75个产生直径1.6cm的绿色疏松愈伤组织；5个褐变死亡；愈伤组织诱导分化率93.8%。
（4）继代增殖培养：用镊子轻轻将愈伤组织分成直径0.5cm的小块后接种，培养基配方：基本培养基+1.2g.l-1ac+1.2g.l-1pvp+1.5mg.l-1tdz+0.03mg.l-1naa。共接种200个，培养40d后，189个愈伤组织分化出丛生芽5～7个，增殖系数5.3。
（5）生根诱导培养：继代增殖培养50d后，丛生芽平均长度达1.5cm以上，将丛生芽剪切成单芽后接种，培养基配方：基本培养基+0.1mg.l-16-ba+1.2mg.l-1iba。共接种800个，培养35d后，736个萌发根系，每株5～10根，生根率92.0%。
（6）植物细胞组织培养各阶段的基本培养基均为：1/2ms+12g.l-1琼脂+30g.l-1蔗糖，ph值5.5；各阶段培养条件为：温度24℃～26℃，光照为1500～2000lux，光照时间为12～14h/d。