本发明属于遗传育种领域，涉及一种不结球白菜四倍体育种方法。
背景技术：
多倍化是植物进化的趋势之一，化学诱变是多倍体人工诱导普遍采用的方法，秋水仙素是目前最有效的诱变剂，具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用[1]，在遗传上很少发生其他不利的变异[2]。在秋水仙素诱导不结球白菜加倍的研究中，刘惠吉[3]首次用0.4％秋水仙素对不结球白菜生长点处理，成功获得四倍体植株。张振超等[4]和徐丽娟等[5]报道用0.2％的秋水仙素处理不结球白菜生长点4次效果最好，四倍体诱变率分别为为8.42％、7.64％。户秋稳等[6]用2.0g·l-1秋水仙素处理‘五月慢’二倍体茎尖生长点6次，获得四倍体诱变率为5.90％。
甲基胺草磷(apm)是一种直接干扰植物微管合成的特异性药物，通过提高ca2+在细胞质中的浓度阻止微管聚合，导致染色体分裂多极化和延迟，在较低浓度时，对微管蛋白的解聚能力更强，加倍频率更高，对植物的毒害作用很小。但单独使用apm加倍效果远不如秋水仙素。
近年来研究者开始将秋水仙素、有机溶剂和除草剂类诱变剂进行混合处理，获得了一些效果。李秀兰和安东[7]用含有0.01％秋水仙素+5mg·l-1氨磺灵的培养基处理秋石斛种子原球茎8-10d，四倍体诱变率达90％以上。王凤宝等[8]用0.05％秋水仙素和2％二甲基亚砜混合水溶液处理豌豆种子48h，诱变率最高为9.5％。张良君等[9]用1％肥皂水+0.1％吐温80+80μmol·l-1apm对单倍体玉米滴心，加倍效果显著。而关于秋水仙素和apm混合诱变剂的研究未见报道，本研究用秋水仙素、吐温20和apm的混合液对不结球白菜‘冬赏味’进行四倍体诱导，以期获得高效低毒的四倍体诱变方法。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种不结球白菜四倍体育种方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种不结球白菜四倍体育种方法，包括采用组合诱变剂对二倍体不结球白菜子叶柄夹角40°-60°，第一片真叶未出时的生长点进行处理；处理后，光密度减少至150μmol·m-2·s-1，光照时数设为12h·d-1，昼温定为20℃，夜温15℃，相对湿度定为80％-90％；其中，所述的组合诱变剂主要由0.1-0.2％秋水仙素+40-60μmol·l-1甲基胺草磷组成；组合诱变剂处理次数为2-4次。
作为所述的不结球白菜四倍体育种方法的优选，组合诱变剂还含有20μl·l-1吐温20。
作为所述的不结球白菜四倍体育种方法的进一步优选，所述的组合诱变剂组成为0.1％秋水仙素+40μmol·l-1甲基胺草磷+20μl·l-1吐温20。
所述的不结球白菜四倍体育种方法的进一步优选，组合诱变剂处理次数为2次：上午7:30-8:30、下午3:30-4:30各1次。
作为所述的不结球白菜四倍体育种方法的优选，组合诱变剂处理前二倍体不结球白菜的种植条件为光密度200μmol·m-2·s-1，光照时数12h·d-1，昼温(22±2)℃，夜温(18±2)℃，相对湿度定为60％-65％，定时通风；组合诱变剂处理2天后，恢复处理前水平。
所述的二倍体不结球白菜优选‘冬赏味’。
有益效果：
秋水仙素因其化学性质稳定，变异率高，被广泛运用，但很多研究表明，用秋水仙素诱变的m0代，存在开花晚、生长期长、稔性低等缺陷，需要不断选育；又因分生组织细胞分裂的不同步性，易出现嵌合体；另外秋水仙素有剧毒，致癌性强，易造成植物幼苗畸形和死亡，试剂成本高，对人体健康和环境安全威胁大，必须严格操作和控制使用。apm作为诱变剂使用时，浓度很低，对植物的毒害作用很小，但加倍率较低。本发明研究表明(见表1)，将两者诱变剂混合使用，其效果比单独使用更佳，说明二者出现协同效应。可能是由于apm阻止微管聚合、秋水仙素使已形成的微管解聚，二者不同程度阻滞微管形成的双层效应引起的。以往关于不结球白菜四倍体活体诱变报道的诱变率大都低于10％，本发明用低浓度的秋水仙素和apm混合使用获得的四倍体诱变率高达12.6％，不仅提高了诱变率，同时也减少对环境的污染和植株的毒害作用。
本发明研究表明当apm和秋水仙素任一浓度不变时，另一个诱变剂不同浓度之间差异显著，不同次数之间差异不显著。在诱变剂中加入吐温20，扩大了液面的张力，增加药剂在生长点的时间；适当降低温度和光强，不仅减少诱变剂蒸发，也降低了其分解反应。
很多研究报道秋水仙素处理离体材料比活体诱变率高，但离体处理样本量小，获得的数据标准差大；需多次转移培养基，用时较长；又要特殊设备，成本高，受一定条件限制，除了一些高校和研究单位运用较多，一些规模较小的育种单位很难普及运用。用秋水仙素对植株活体处理，虽然加倍率较离体处理偏低，但操作简单方便，用时短，成本低，见效快。目前关于不结球白菜四倍体诱导的报道大都选择子叶期生长点进行处理，十字花科植物在子叶期从发芽到第一片真叶长要3-4天时间，茎尖分生组织最活跃的时期即处理最佳时间，未见报道。另外温度、相对湿度、光照等外界环境条件，对处理结果影响较大。本发明利用人工气候室育苗和管理，当子叶柄夹角40°-60°，第一片真叶未出时对生长点进行点滴处理，明确了育苗和处理后的生长环境和处理时期，为以后不结球白菜多倍体研究提供理论和实践基础。
附图说明
图1二、四倍体叶片解剖图
图2二、四倍体单株照片
图3四倍体小区
图4二倍体(左)、四倍体(右)花器官解剖图；
图5二倍体(左)、四倍体(右)角果
图6二倍体(右)、四倍体(左)种子
图7四倍体(上)、二倍体(下)花粉粒
图8四倍体(上)、二倍体(下)根尖染色体
图9四倍体(上)、二倍体(下)气孔
图10二倍体流式细胞仪dna含量图
图11嵌合体流式细胞仪dna含量图
图12四倍体流式细胞仪dna含量图
具体实施方式
实施例1
1.材料与方法
1.1材料
‘冬赏味’为二倍体不结球白菜(俗称小白菜)(2n＝2x＝20)，来自日本(株)武臧野种苗园。2015年10月10日将种子播种于装有叶菜类蔬菜基质(淮安柴米河农业科技发展有限公司)穴盘(50孔)中。放入人工气候室，光密度调为200μmol·m-2·s-1，光照时数设为12h·d-1，昼温定为(22±2)℃，夜温(18±2)℃，相对湿度定为60％-65％，定时通风[10]。1.2处理方法
在子叶柄夹角为40°-60°，第一片真叶未出时用微量注射器对生长点进行点滴处理，每天2次，上午7:30-8:30一次、下午3:30-4:30一次，每次20μl。药剂配方如下：0.05％、0.1％和0.2％秋水仙素分别与40μmol·l-1apm及60μmol·l-1apm组合，0.2％秋水仙素，40μmol·l-1apm，60μmol·l-1apm，共9个水平，每组溶液均加20μl·l-1吐温20。处理次数设2次和4次2个水平。以点滴蒸馏水为对照(ck)。
1.3苗期管理方法
处理后，光密度减少至150μmol·m-2·s-1，光照时数设为12h·d-1，昼温定为20℃，夜温15℃，相对湿度定为80％-90％。2天后，恢复处理前水平。在幼苗拉十字(两叶一心)时，浇营养液(hogland营养液)。待幼苗四叶一心时移入大棚。
1.4倍性鉴定方法
叶、花器官、角果、种子等形态学指标和气孔大小、气孔密度、保卫细胞内叶绿素含量、花粉粒形状、大小等解剖学指标参照韩业飞[11]方法。流式细胞仪dna含量分析参照张振超方法[4]，根尖染色体倍性鉴定参照郑金双[12]方法。
1.5营养品质测定方法
可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝g-250染色法比色法，可溶性糖含量蒽酮–硫酸比色法，硝态氮含量用水杨酸法比色法，有机酸含量用酸碱滴定法，vc含量和干物质含量百分比使用常规方法，叶绿素含量用叶绿素计spad-502plus测定。
1.6四倍体续育
经鉴定的m0代植株，2016年春4月上旬抽薹开花，单株人工授粉；5月下旬收获种子。2016年9月20日，播种m1代种子，进行株系间比较。
2结果与分析
2.1不同组合诱变剂诱导效果
见表1，不同浓度的秋水仙素和apm及其组合配方和不同处理次数均可产生四倍体，但加倍效果不同，随着秋水仙素浓度的增加，死亡率和变异率均增加，但四倍体诱导率并不成正相关。单独使用秋水仙素时，材料出现不同程度的毒害作用，四倍体诱导率最高达6.3％。单独使用apm时，死亡率为0，表明apm对植株毒害作用很小或无毒害作用，但变异率明显比单独使用秋水仙素时低，四倍体诱导率最高达3.4％。在apm和秋水仙素联合作用时，变异率提高，四倍体诱导率明显增加，在0.1％秋水仙素+40μmol·l-1apm处理2次时，四倍体诱变率最高达12.6％；处理4次时，四倍体诱变率为12.3％，两者之间差异不显著。在同浓度秋水仙素不同浓度apm处理时，随着apm浓度升高，四倍体变异率反而降低，不同浓度处理差异显著，不同次数处理差异不显著。同浓度apm不同浓度秋水仙素处理时，随着秋水仙素浓度升高，四倍体变异率先上升后下降，浓度之间差异显著，次数之间差异不显著。实验表明以0.1％秋水仙素+40μmol·l-1apm+20μl·l-1吐温20处理效果最佳。
表1不同诱变剂诱导结果
注：4*表示连续2天处理，共4次；
表中同列数据后不同小、大写字母表示差异显著(α＝0.05)、差异极显著(α＝0.01)水平，下表同。
2.2形态学和解剖学鉴定结果
四倍体植株表现巨大性(见表2)：四倍体株高，叶片宽度和厚度，下柄宽度和厚度，单株重，花瓣宽，角果宽分别比二倍体增加了15.05％，14.20％，21.33％，28.57％，20.81％，13.32％，59.62％，35.85％，差异极显著；开展度，柄长，总叶重，花瓣长，角果长，分别比二倍体增加了4.43％，6.57％，9.42％，7.04％，3.39％，差异显著；叶片数和单角果种子数分别比二倍体减少了9.09％和51.62％，差异极显著；叶长减少了5.03％，差异显著。
气孔密度比二倍体减少了26.50％，差异极显著；气孔长，叶绿体数，花粉粒长和宽分别比二倍体增加了46.45％，48.39％，26.03％，59.97％，差异极显著。
表2二、四倍体‘冬赏味’形态解剖学比较结果
2.3流式细胞仪dna含量和根尖染色体鉴定
用流式细胞仪对‘冬赏味’幼嫩叶片进行dna含量测定，结果如图10-12所示：纵坐标count值代表的是测定细胞数的相对值，横坐标fl3值代表的是荧光的通道值，峰值的位置可以反应出测试材料的倍性。二倍体的主峰值在近400的位置，800处峰值显示了其活跃的有丝分裂行为(图10)。四倍体的主峰值在800位置上，与二倍体主峰值成近似2倍关系(图12)。而嵌合体在400和800的位置均有峰值(图11)。
根尖分生组织有丝分裂中期染色体鉴定表明(见图8)：四倍体植株的染色体为数目为2n＝4x＝40条，对照二倍体染色体数目2n＝2x＝20。
2.4二、四倍体营养品质含量比较
对m1代植株进行营养含量测定，结果表明(见表3)：四倍体可溶性糖、可溶性蛋白、vc和干物质含量极显著高于二倍体，分别增加了26.19％、27.63％、18.06％、29.98％；有机酸含量极显著低于二倍体，减少了17.00％；硝态氮含量显著低于二倍体，减少了13.23％。可溶性蛋白和可溶性糖与植株的抗逆性有关，含量越高则四倍体的抗逆性也越强。
表3二、四倍体‘冬赏味’营养品质含量比较
2.5四倍体‘冬赏味’特征特性
四倍体‘冬赏味’属四月白类型，耐寒，晚抽薹，株型直立、束腰，株高25.17cm，开展度2.65cm；叶片近圆形，长16.06cm，宽15.36cm，叶色翠绿，叶柄扁平、绿白；单株重794.40g，叶片重与单株重比为0.11-1.13；可溶性蛋白含量27.63％，可溶性糖含量26.19％，维生素c含量18.06％。
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