本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种薄荷与香茅发酵制备蚊虫驱避剂的方法。
背景技术：
蚊虫是传播病害的重要媒介、全球每年受蚊虫传播病害威胁的人数超过20亿，因此防护蚊虫叮咬意义重大。
薄荷为唇形科薄荷属多年生宿根性草本植物，茎直立，高30-60cm，下部数节具纤细的须根及水平匍匐根状茎，锐四菱形，具四槽，上部被倒向微柔毛，下部仅沿菱上被柔毛，多分枝。叶片长圆状披针形，长3-5cm，宽0.8-3cm，先端锐尖，侧脉约5-6对。轮伞花序腋生，轮廓球形，花冠淡紫色。花期7-9月，果期10月。主要产地为美国、西班牙、意大利、法国、英国、巴尔干半岛等，而中国大部分地方如云南、江苏、浙江、江西等都有出产。
香茅为禾本科香茅属植物，多年生草本，全株具有柠檬的香味，株高100-200公分，茎短藏於地下，节轮状，叶鞘抱茎无毛，线状叶从靠近根处长出，叶长60-150公分，宽约1公分左右，叶片簇生，两面背粗糙，被呈白色，秋冬季开花结果，花不醒，圆锥花序疏散，为多数总状花序组成，颖果。原产于热带亚洲如印度、斯里兰卡，现在广东、海南、台湾栽培，广泛种植于热带地区。可用于治疗风湿效、偏头痛。具有抗感染，改善消化，除臭、驱虫功能，能收敛肌肤、调理油腻不洁皮肤、赋予清新感，恢复身心平衡。
作为植物性杀虫剂薄荷和香茅都有较好的驱蚊效果，但传统的植物性杀虫剂多用有机溶剂或煎煮提取，1)不利于节能也有较大的环境风险；2)影响活性物质的稳定性和遗失活性物质；3)增加成本使得开发应用困难较大，作用效果缓慢，因此给植物源杀虫剂的研发和生产带来了巨大的经济困难。
技术实现要素：
本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种薄荷与香茅发酵制备蚊虫驱避剂的方法；本发明采用将薄荷与香茅发酵的方法提取活性物质制备蚊虫驱避剂，操作简单，不含有机溶剂且不影响活性物质的稳定性；制备得到的蚊虫驱避剂有效活性成分含量高，可有效防止蚊叮虫咬，防蚊效力持久，使用安全环保。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种薄荷与香茅发酵制备蚊虫驱避剂的方法，包括以下步骤：
(1)分别选取新鲜薄荷叶和香茅草，清洗干净后，加入水破碎打浆，取浆液备用；所述薄荷叶、香茅草及水的质量比为1-5：1-5：5-10；
(2)将地衣芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌接种到培养基中，在温度为28-32℃，搅拌转速为80-120rpm的条件下震荡培养12-24h，然后取培养液于6500-7000rpm的条件下离心，得到离心后的发酵菌菌液；
(3)将步骤(1)制得的浆液进行灭菌处理后，加入步骤(2)的发酵菌菌液，进行发酵培养，当发酵液的ph降低0.5时，结束发酵，然后在5-10℃的条件下冷藏保存3-5天；
(4)将步骤(3)冷藏后的发酵液，进行粗滤、灭菌、离心收集清夜，即得所述蚊虫驱避剂。
本发明通过采用地衣芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌作为作为促生菌发酵薄荷和香茅来提取有效活性成分，不仅有利于生物活性物质的提取，且由于发酵过程中无需采用有机溶剂和长时间的高温处理过程，不易造成有效成分活性物质的失活，有利于保证薄荷和香茅中具有驱蚊功效的成分活性。采用的地衣芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌作为促生菌本身还有较好的杀虫防病和促生作用，有利于增强驱蚊的效果，且发酵过程中无需添加有机溶剂等，减少了对环境的危害；采用新鲜的薄荷叶和香茅草，其有效成分含量较高；而薄荷叶、香茅草及水采用此范围质量比打成浆液，可提高原料的利用率，保证有效活性成分的含量。
较佳地，在步骤(1)，所述薄荷叶及香茅草破碎至30-60目。
较佳地，在步骤(2)，所述培养基由以下重量百分比的原料制成：蔗糖1.5％、蛋白胨1.2％、氯化钠0.8％、氨基酸0.01％、水余量；所述培养基在121℃高压下灭菌15min，并调整ph至7.0。采用此培养基培养地衣芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，可提供较好的生长环境，有效提高发酵菌的活性，且保持体系内发酵菌的有效含量。
较佳地，在步骤(2)，所述发酵菌菌落的浓度为110-115cfu/ml。
较佳地，在步骤(3)，所述浆液与发酵菌菌液的质量比为80-100：1-5。
较佳地，在步骤(3)，所述灭菌处理为使浆液在90-100℃的条件下进行灭菌处理10-30min。发酵前进行灭菌处理可避免其它共生微生物的竞争生长，保证接种的地衣芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌的生长，进而能够提高有效活性成分的提取。
较佳地，在所述灭菌处理后，还包括往浆液中加入纤维素酶，所述纤维素酶的用量为浆液总质量的0.5-1.0％。采用纤维素酶酶解能够促进薄荷和香茅中纤维组织的降解，从而能够使发酵菌更充分的利用它们作为营养物质，从而也能够提高有效成分的释放和提取。
较佳地，在步骤(3)，所述发酵培养的温度为28-35℃。
较佳地，在步骤(4)，所述离心的转速为3500-4000rpm，离心时间为10-15min。
薄荷主要含薄荷脑(又称薄荷醇)、薄荷酮等挥发油，其中薄荷脑占62％，薄荷酮占15％，异薄荷酮占6％，还含有其他挥发油，如薄荷烯酮、柠檬烯、桂叶烯、薄荷烷、薄荷酯类、儿茶萘酚酸、蓝香油烃等，薄荷含有的挥发油活性成分易发散，进而将蚊虫驱散；中医认为薄荷性凉味辛，有宣散风热、清头目、透疹之功，具有兴奋大脑，促进血液循环、发汗、消炎镇痛、止痒解毒和疏散风热的作用。
香茅具有柠檬香味，且在自然条件下散发驱蚊物质香茅醛，达到驱蚊效果，其气味芳香，具有生态驱蚊、净化空气、提神醒脑、抗菌消毒等功效。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明利用发酵工程技术，通过选择合适的菌种及发酵条件，从薄荷和香茅中提取活性物质，一方面，可最大程度保留薄荷及香茅的活性成分，且相对于传统的水提法，避免了有机溶剂的引入，安全环保；另一方面，不需通过高温萃取等过程，避免薄荷中挥发油等活性物质遗失，影响活性物质的稳定性，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。
(2)通过本发明的发酵方法，薄荷中薄荷脑、薄荷酮等挥发油的提取率达到75％以上，香茅中香茅醛等活性成分总提取率为70％以上，从而制得的蚊虫驱避剂有效活性成分含量高，可有效防止蚊虫叮咬，防蚊效力高，持续时间长，使用安全环保。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
实施例1
一种薄荷与香茅发酵制备蚊虫驱避剂的方法，由以下步骤组成：
(1)分别选取新鲜薄荷叶和香茅草，清洗干净后，加入水破碎打浆，取浆液备用；薄荷叶及香茅草破碎至45目，所述薄荷叶、香茅草及水的质量比为3：2：8；
(2)将地衣芽孢杆菌接种到培养基中，在温度为30℃，搅拌转速为100rpm的条件下震荡培养20h，然后取培养液于6800rpm的条件下离心，得到离心后的发酵菌菌液；培养基由以下重量百分比的原料制成：蔗糖1.5％、蛋白胨1.2％、氯化钠0.8％、氨基酸0.01％、水余量；所述培养基在121℃高压下灭菌15min，并调整ph至7.0；发酵菌落的浓度为110cfu/ml；
(3)将步骤(1)制得的浆液进行灭菌处理后，加入步骤(2)的发酵菌菌液，浆液与发酵菌菌液的质量比为90：3，然后进行发酵培养，发酵培养的温度为30℃；当发酵液的ph降低0.5时，结束发酵，然后在8℃的条件下冷藏保存4天；灭菌处理为使浆液在95℃的条件下进行灭菌处理20min；
(4)将步骤(3)冷藏后的发酵液，进行粗滤、灭菌、离心收集清夜，即得所述蚊虫驱避剂；离心的转速为3800rpm，离心时间为12min。
将本实施例得到的蚊虫驱避剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明蚊虫驱避剂中含有有效活性成分挥发油，具体含有薄荷醇、薄荷酮、异薄荷酮、柠檬烯、桂叶烯、香茅醛等活性成分，其中，薄荷中薄荷脑、薄荷酮等挥发油的提取率达到78.5％，香茅中香茅醛等活性成分总提取率为73.8％，从而使本蚊虫驱避剂中活性成分较高，具有很好的防蚊虫效果。
实施例2
一种薄荷与香茅发酵制备蚊虫驱避剂的方法，由以下步骤组成：
(1)分别选取新鲜薄荷叶和香茅草，清洗干净后，加入水破碎打浆，取浆液备用；薄荷叶及香茅草破碎至30目，所述薄荷叶、香茅草及水的质量比为5：1：5；
(2)将地衣芽孢杆菌接种到培养基中，在温度为28℃，搅拌转速为80rpm的条件下震荡培养12h，然后取培养液于6500rpm的条件下离心，得到离心后的发酵菌菌液；培养基由以下重量百分比的原料制成：蔗糖1.5％、蛋白胨1.2％、氯化钠0.8％、氨基酸0.01％、水余量；所述培养基在121℃高压下灭菌15min，并调整ph至7.0；发酵菌落的浓度为115cfu/ml；
(3)将步骤(1)制得的浆液进行灭菌处理后，加入步骤(2)的发酵菌菌液，浆液与发酵菌菌液的质量比为80：1，然后进行发酵培养，发酵培养的温度为28℃；当发酵液的ph降低0.5时，结束发酵，然后在5℃的条件下冷藏保存3天；灭菌处理为使浆液在90℃的条件下进行灭菌处理30min；
(4)将步骤(3)冷藏后的发酵液，进行粗滤、灭菌、离心收集清夜，即得所述蚊虫驱避剂；离心的转速为3500rpm，离心时间为15min。
将本实施例得到的蚊虫驱避剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明蚊虫驱避剂中含有有效活性成分挥发油，具体含有薄荷醇、薄荷酮、异薄荷酮、柠檬烯、桂叶烯、香茅醛等活性成分，其中，薄荷中薄荷脑、薄荷酮等挥发油的提取率达到76.2％，香茅中香茅醛等活性成分总提取率为72.5％，从而使本蚊虫驱避剂中活性成分较高，具有很好的防蚊虫效果。
实施例3
一种薄荷与香茅发酵制备蚊虫驱避剂的方法，由以下步骤组成：
(1)分别选取新鲜薄荷叶和香茅草，清洗干净后，加入水破碎打浆，取浆液备用；薄荷叶及香茅草破碎至60目，所述薄荷叶、香茅草及水的质量比为1：5：10；
(2)将地衣芽孢杆菌接种到培养基中，在温度为32℃，搅拌转速为120rpm的条件下震荡培养24h，然后取培养液于7000rpm的条件下离心，得到离心后的发酵菌菌液；培养基由以下重量百分比的原料制成：蔗糖1.5％、蛋白胨1.2％、氯化钠0.8％、氨基酸0.01％、水余量；所述培养基在121℃高压下灭菌15min，并调整ph至7.0；发酵菌落的浓度为115cfu/ml；
(3)将步骤(1)制得的浆液进行灭菌处理后，加入步骤(2)的发酵菌菌液，浆液与发酵菌菌液的质量比为100：5，然后进行发酵培养，发酵培养的温度为35℃；当发酵液的ph降低0.5时，结束发酵，然后在10℃的条件下冷藏保存5天；灭菌处理为使浆液在100℃的条件下进行灭菌处理10min；
(4)将步骤(3)冷藏后的发酵液，进行粗滤、灭菌、离心收集清夜，即得所述蚊虫驱避剂；离心的转速为4000rpm，离心时间为10min。
将本实施例得到的蚊虫驱避剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明蚊虫驱避剂中含有有效活性成分挥发油，具体含有薄荷醇、薄荷酮、异薄荷酮、柠檬烯、桂叶烯、香茅醛等活性成分，其中，薄荷中薄荷脑、薄荷酮等挥发油的提取率达到75.7％，香茅中香茅醛等活性成分总提取率为74.2％，从而使本蚊虫驱避剂中活性成分较高，具有很好的防蚊虫效果。
实施例4
本实施例与实施例1的方法不同之处在于：实施例4在步骤(3)进行灭菌处理后，还包括往浆液中加入纤维素酶，所述纤维素酶的用量为浆液总质量的0.5％，然后再加入步骤(2)的发酵菌菌液，进行发酵培养；其余步骤和方法与实施例1完全一致。
将本实施例得到的蚊虫驱避剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明蚊虫驱避剂中含有有效活性成分挥发油，具体含有薄荷醇、薄荷酮、异薄荷酮、柠檬烯、桂叶烯、香茅醛等活性成分，其中，薄荷中薄荷脑、薄荷酮等挥发油的提取率达到80.1％，香茅中香茅醛等活性成分总提取率为76.8％，从而使本蚊虫驱避剂中活性成分较高，具有很好的防蚊虫效果。
实施例5
本实施例与实施例1的方法不同之处在于：实施例4在步骤(3)进行灭菌处理后，还包括往浆液中加入纤维素酶，所述纤维素酶的用量为浆液总质量的1.0％，然后再加入步骤(2)的发酵菌菌液，进行发酵培养；其余步骤和方法与实施例1完全一致。
将本实施例得到的蚊虫驱避剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明蚊虫驱避剂中含有有效活性成分挥发油，具体含有薄荷醇、薄荷酮、异薄荷酮、柠檬烯、桂叶烯、香茅醛等活性成分，其中，薄荷中薄荷脑、薄荷酮等挥发油的提取率达到79.6％，香茅中香茅醛等活性成分总提取率为77.9％，从而使本蚊虫驱避剂中活性成分较高，具有很好的防蚊虫效果。
使用方法：将蚊虫驱避剂用乙醇稀释1-3倍后，均匀涂抹或喷洒于人体或需驱避蚊虫的物体上。
驱蚊试验：
按照gb/t17322.10-1998进行。受试者为50人，分为五组，每组10人，分别对本发明实施例1-5的蚊虫驱避剂(分别稀释1倍)进行测试。每人一手为空白对照，另一手按1.5mg/cm2的剂量均匀涂抹5cm×5cm手背区域，暴露其中4cm×4cm部位，其余部分严密遮蔽。涂抹产品2小时，开始进行测试。测试结果参见表1。
表1
由表1数据可知，本发明实施例1-5的蚊虫驱避剂对白纹伊蚊驱避效果均符合a级，有效驱蚊时间达到6小时以上，其中实施例5的有效驱蚊时间最长，可达6.5小时，说明本发明的蚊虫驱避剂可有效防止蚊虫叮咬，防蚊效力高，持续时间长，使用安全环保。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。