本发明涉及林木遗传育种领域，具体涉及一种云杉属树种的人工授粉方法，以及该方法的应用。
背景技术：
云杉属(picea)树种树体高大，结实期晚(一般在种植20年以上)，雌球花位于树冠中上部外围，可授粉期较短。传统的授粉方法包括以下两种方式：(1)使用刀片在授粉袋上开口，然后用毛笔蘸取花粉，将花粉轻弹或者涂抹在云杉雌球花上。(2)将吸耳球的尖端切开，在切开的端部安装半截医用注射器，注射器内装有花粉。通过挤压吸耳球的球状部分，将花粉喷洒在雌球花上。但是，上述授粉方法不仅工作效率低，而且在高树上操作困难、危险，还容易造成花粉污染，影响杂交效果。尤其在大风天气，操作困难和花粉污染更加明显，影响杂交授粉进程。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种云杉属树种的人工授粉方法。
本发明的第二目的在于提供该方法在云杉属树种杂交育种中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种云杉属树种的人工授粉方法，包括以下步骤：
(1)在可授粉期前1～3天，在云杉属树种长有雌球花的枝条外侧套授粉袋；
(2)当授粉袋内的雌球花进入最佳授粉期时，将花粉装入注射器内，用注射器的针头在授粉袋上扎出授粉孔，将针头插入授粉孔，按压注射器将花粉喷射在授粉袋内；
(3)拔出注射器，封闭授粉孔，完成授粉；
在步骤(2)或步骤(3)中，采用精胺溶液对花粉或雌球花进行处理。
优选地，步骤(1)中，所述长有雌球花的枝条占据授粉袋内部1/2～2/3的长度。
优选地，步骤(1)中套授粉袋时，在袋口与枝条接触部位铺设棉花，然后扎紧授粉袋口。
优选地，所述授粉袋为纸质，在单侧授粉袋的中部设有可视窗口，在可视窗口表面覆盖透光膜。
优选地，所述授粉袋为40cm×20cm的牛皮纸质袋，在单侧授粉袋的中部设有40cm×8cm的可视窗口，在可视窗口表面覆盖塑料透光膜。
优选地，步骤(2)中，向花粉表面喷洒浓度为0.2～0.4mg/kg的精胺溶液，然后进行授粉。
优选地，在干燥后的花粉中加入2～5重量％的滑石粉。
优选地，所述注射器的规格为20ml以上，针头为10号。
优选地，步骤(3)中，在拔出注射器后，向雌花喷洒浓度为0.2～0.4mg/kg的精胺溶液，然后封闭授粉孔。
本发明还涉及所述方法在云杉属树种杂交育种中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的云杉属树种的人工授粉方法，主要包括在云杉属树种长有雌球花的枝条外侧套授粉袋，授粉时将花粉装入注射器，通过按压注射器将花粉喷射在授粉袋内。在优选的方案中，还可以向授粉完成的雌花喷洒精胺溶液，或者在授粉前向花粉表面喷洒精胺溶液，以提高饱子率。与传统方法相比，本发明提供的方法省工省时、节省花粉用量。不仅提高了工作效率，而且操作简单方便，降低不同花粉互用污染的危险，在大风天气也可以操作。本发明对于云杉属树种的杂交授粉和提高饱子率具有普遍意义。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明提供的云杉属树种的人工授粉方法，包括以下步骤：
步骤(1)：选择雌球花比较集中的枝条，对枝条可作适当修剪。在可授粉期前1～3天，在云杉属树种长有雌球花的枝条外侧套授粉袋。
进一步地，为了使授粉袋透气，不影响果实生长，优选授粉袋为纸质。为了在授粉过程中便于观察，在单侧授粉袋的中部设有可视窗口，更优选在可视窗口表面覆盖塑料透光膜。
在本发明的一个实施例中，授粉袋为40cm×20cm的牛皮纸质袋，在单侧授粉袋的中部设有40cm×8cm的可视窗口，在可视窗口表面覆盖一层塑料透光膜。该纸袋大小和可视窗口尺寸比较符合实际操作的需要。授粉袋过长，容易因风吹、与枝条碰撞等原因破碎，起不到保护雌球花的作用；授粉袋过短，
在本发明的一个实施例中，套授粉袋时，在袋口与枝条接触部位铺设棉花，然后扎紧授粉袋口。根据需要，在授粉袋上注明袋号、雌球花数量等信息，并且在授粉袋基部挂上标签，袋号和标签要一致。铺设棉花的作用为：其一是避免损伤枝条，影响养料和水分供应，进而影响球果发育；其二是避免授粉完成后，授粉袋内的花粉外漏；其三是防止外源花粉侵入，影响授粉结果。
在本发明的一个实施例中，套袋完成后，长有雌球花的枝条占据授粉袋内部1/2～2/3的长度。这是为了避免使枝条上的雌球花与授粉袋底部接触，影响授粉或损伤雌球花。
步骤(2)：当授粉袋内的雌球花进入最佳授粉期时，将花粉装入注射器内，用注射器的针头在授粉袋上扎出授粉孔，将针头插入授粉孔，按压注射器将花粉喷射在授粉袋内。
进一步地，花粉按照以下方法处理后使用：对于当年花粉，用细目筛筛除杂质，充分晾干后使用；对于陈年花粉，如果干净、干燥可以直接使用，如果存在杂质或者结块，需要研细、用细目筛筛除杂质后使用。
筛除花粉杂质的细目筛要专用，防止在不同花粉之间互用，造成花粉感染。不同花粉间使用细目筛时，就要清洗干净后才能使用，防止花粉污染。可以在细目筛上贴上标签，一个单株使用一个细目筛，或者将细目筛在筛完一个单株后清洗干净，晾干后再筛另一单株的花粉。
本申请中，将注射器作为授粉工具。可以使用规格为20ml以上的医用注射器，配备10号针头。注射器和针头的型号是经过选择的，这样尺寸的注射器比较容易操作，装入的花粉量适中，且花粉不易堵塞针头和注射孔。可以使用透明胶带或者双面胶，在注射器表面贴上花粉编号。
可以通过以下方式将花粉装入注射器内：1)用注射器吸入相应编号的花粉；2)拔出注射器活塞，从注射器针管底部装入相应编号的花粉。为防止花粉漏出，将花粉装入注射器后，需要在注射器针头上套上针帽或护套待用。为了使授粉过程中花粉容易飞散，可以在将花粉装入注射器前，向花粉中添加2～5重量％的滑石粉。滑石粉用量过多，相当于花粉被稀释，实际的授粉率降低；滑石粉用量过少，对增加粉飞散效果的改善不明显。
可以在准备花粉时，采用精胺溶液对花粉进行处理。具体可以将花粉平摊于干净的工作台上，向花粉表面呈雾状喷洒浓度为0.2～0.4mg/kg，优选0.3mg/kg的精胺溶液，充分搅拌均匀后，待花粉干燥，然后将花粉吸入或者装入注射器。
实际进行授粉时，操作人员拔出注射器护套，用注射器针头在授粉袋顶部扎一小孔，将针头伸入授粉袋内。向袋内轻推注射器活塞，花粉呈雾状从针孔喷出。根据授粉袋内的雌球花数量确定花粉注射量，一般情况轻推2～3下就足够了，以透过可视窗口看到袋内有花粉飘浮为宜。由于注射器针筒透明并具有刻度，一般每次的注射量是比较一致的，约为0.1～0.2ml。
注意杂交使用的花粉要干燥，否则针头容易堵塞，针头堵塞后更换针头或着清洗干净后再使用；注射器、针头、针帽(或护套)要专用，不同花粉间注射器和针头、针帽(或护套)不能互用，以免造成花粉污染，影响杂交。
步骤(3)：向授粉袋内注射花粉后，拔出注射器，并为注射器戴上针帽或护套，防止注射器内的花粉被污染。同时封闭授粉孔，可以将透明胶带贴在授粉孔上，以防止外部花粉从授粉孔进入授粉袋内。
在本发明的一个实施例中，授粉完成拔出注射器后，可以向雌花喷洒浓度为0.2～0.4mg/kg，优选0.3mg/kg的精胺溶液，然后封闭授粉孔。使用精胺溶液可以促进花粉萌发，提高饱子率。精胺溶液的浓度过小，对提高饱子率的改善不明显。精胺溶液的浓度过大，影响花粉在雌蕊表面的萌发，同样使饱子率下降。
授粉完成后1～3天，对雌球花进行观察。如果雌球花未闭合，可进行第2次补充授粉，授粉方法如前所述。
授粉完成后6～10天，优选7天左右将授粉袋除去。除去授粉袋的同时，将袋口基部的标签连同铺垫的棉花用细铁丝固定，防止标签被风吹掉，或者由于授粉枝条与其它枝条缠绕使标签脱落。将棉花和标签用细铁丝固定在一起是为了醒目，在后续的球果管理和采摘时容易找到。
本发明还提供了该方法在云杉属树种，主要是云杉杂交育种中的应用。云杉的具体种类包括欧洲云杉、青海云杉、川西云杉、天山云杉等。
实施例1：
本实施例选择欧洲云杉(piceaabies)嫁接无性系36、3、2号3个无性系作为母本(母树年龄18年)，其中每个无性系选择树势基本一致的3无性系分株，分别标记为(36-1、36-2、36-3)、(3-1、3-2、3-3)、和(2-1、2-2、2-3)。每个无性系分株在树冠外围选择套授粉袋30个(2015年4月21日套袋)，每个授粉袋内套3个雌球花，分成3个试验组。
2015年4月25日观察到雌球花进入最佳授粉期，按照预先设计，其中1至10号、11至20号、21号至30号分别采用以下方式授粉：
(1)1至10号授粉袋：使用医用注射器向授粉袋内注射青海云杉31号花粉，授粉后封住针孔。
(2)11至20号授粉袋：授粉30分钟前，在干净的工作台上铺上吸湿性较好的包装纸，将青海云杉31号花粉均匀地摊开在包装纸上，使用喷雾装置向摊开的花粉表面喷洒浓度为0.3mg/kg的精胺溶液，然后将包装纸折叠，充分混合均匀后摊开。花粉晾干后，用医用注射器吸入或者装入花粉，授粉时向授粉袋内注射花粉，然后拔出注射器并封住针孔。
(3)21至30号授粉袋：使用医用注射器向授粉袋内注射青海云杉31号花粉，然后使用改装的能够喷雾的针头，用注射器向授粉袋内呈雾状喷洒浓度为0.3mg/kg的精胺溶液，然后封住注射孔。
授粉第二日如观察雌球花开始从基部闭合，不必补充授粉，发现雌球花没有闭合，如前进行补充授粉。
授粉后7天，解除授粉袋，在授粉袋基部将标签绑好。
观察当种子成熟后，按照袋号采摘球果，统计每个球果收获种子粒数，使用x摄像法(或水选法)测定饱满种子粒数和空子数，计算饱子率，结果见表1。
表1在不同授粉条件下，欧洲云杉无性系与青海云杉杂交的饱子率
实施例2
本实施例以青海云杉(piceacrassifolia)无性系193、136、169等3个嫁接无性系为授粉母树(母树年龄30年)，欧洲云杉151号母树为父本，进行青海云杉与欧洲云杉杂交。每个无性系分别选择健康、无病虫危害、生长基本一致的3个无性系分株，每个无性系分株在树冠外围选择有雌球花的枝条，每个无性系分株套30个授粉袋，每个授粉袋内套3个雌球花(2015年4月22日套袋)。
2015年4月25日母树进入最佳授粉期后，按照预先设计，按照实施例1的三种授粉方式，采用欧洲云杉151号花粉进行授粉。等到种子成熟后，按照不同的无性系分株、不同授粉方式采集球果，按照单个球果调制种子，分别统计每个球果生产种子总数，并用x摄像法(水选法)测定饱满种子粒数和空子数，计算饱子率，结果见表2。
表2在不同授粉条件下，青海云杉嫁接无性系与欧洲云杉杂交的饱子率
实施例3
本实施例采用3个白云杉(piceaglauca)嫁接无性系作为母本，母树年龄16年，3个白云杉无性系分别为：白云杉(2-白1-3)、白云杉(2-白6-1)和白云杉(1-白4-3)，每个无性系选择健康、无病虫危害、树势生长旺盛的3个分生株，每个无性系分株套授粉袋30个(2015年4月16日套袋)。
2015年4月21日观察到雌球花进入最佳授粉期，按照预先设计，使用天山云杉(p.schrenkianafisch.etmey.)09号花粉为父本，进行白云杉和天山云杉杂交。采用与实施例1相同的授粉方式，其中1至10号按照实施例1的方式(1)进行授粉，11至20号授粉袋按照实施例1的方式(2)进行授粉，21至30号按照实施例1的方式(3)进行授粉。
授粉第二天，如观察雌球花从基部开始闭合，不必补充授粉，否则进行补充授粉，补充授粉方法与前述授粉方法相同。
授粉7天后解除授粉袋，在基部绑好标签和标记。
观察到球果成熟后，按照杂交组合和不同授粉方式采集球果，按照单个球果调制种子，用x摄像法或水选法测定每个球果饱满种子粒数和空子粒数，计算不同杂交组合饱子率，结果见表3。
表3在不同授粉条件下，白云杉不同无性系与天山云杉杂交的饱子率
从上述实施例可以看出，使用医用注射器可以提高云杉杂交授粉的工作效率，克服大风天在大树上无法操作的困难，避免错过最佳授粉期。可以采用经过改装的能够喷雾的医用针头，在授粉完成前或完成后向授粉袋内喷洒浓度为0.3mg/kg的精胺溶液，能促进花粉有效萌发，提高杂交球果种子数，并将饱子率提高20％左右。这一方法不仅适用于云杉杂交，而且可以在在云杉种子园管理中推广使用，大幅提高云杉种子产量和品质。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。