一种濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法与流程

本发明属于植物培养技术领域，具体涉及一种濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法。

背景技术：

矮紫堇是罂粟科植物矮紫堇(为干燥全草，表面棕红色，棕黄色或暗褐红色，茎短，蒴果长圆形)和扁柄黄堇(皱缩呈团状，外表黄棕色至红棕色，叶片破碎萎缩，花黄色细弱，苞片倒长卵形)的干燥全草，具有清热消炎的功效。可以用于治疗高山多血症、溃疡疼痛、脉管炎、肠炎。

矮紫堇主要分布于我国西藏海拔4200～5200m的区域。目前除西藏境内近百个藏医医疗机构医院制剂产品外，具有国药准字号的藏药产品中就有智托洁白丸、十三味青兰散、二十五味鬼臼、十味龙胆花颗粒等40余品种要用到矮紫堇。同时仅在西藏自治区境内，就有近10家藏药企业生产上述藏药产品，年产量可达千吨，矮紫堇的年需求量可达10吨左右。但是，由于以全草入药，长期掠夺式采挖野生药材，已经导致原生环境遭到破坏，矮紫堇野生资源已经列入一级濒危，处于供不应求的状态。

现有方法中矮紫堇的人工繁育技术仍然是空白。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种育苗速度快、遗传性好、繁殖周期短的濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法。本发明所述组织培养方法填补矮紫堇组织培养技术空白，不受季节限制，可周年生产种苗，实现人工繁育。本发明组织培养技术利用优质健壮矮紫堇的顶芽组织灭菌获得的无菌组织通过分裂分化而获得完形植株，成本低，繁殖快，能适应高原地区温差大、气温低、紫外线强的独特环境，并且育苗速度快，遗传性好，可周年生产种苗。

本发明所采用的技术方案为：

一种濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法，步骤包括：

(1)选健壮植株芽体，先用乙醇进行快速涮洗，再用hgcl2溶液进行消毒；

(2)将步骤(1)处理后的芽体采用无菌水进行冲洗，再将芽体表面水吸干，得到无菌外植体，待用；

(3)在无菌条件下，将步骤(2)所述无菌外植体接种到培养基上，先进行暗培养，再转接到丛芽培养基上，光照条件下培养诱导丛芽，形成丛芽；

(4)将所述丛芽转入生根培养基中，在光照条件下，得到生根试管苗；

(5)将所述生根试管苗经练苗移栽到基质中，培养成植株后，定植于野外，直至收获。

步骤(1)中，所述乙醇为体积浓度为60～80％。

步骤(1)中，所述hgcl2溶液的浓度为0.05～0.2％，采用所述hgcl2溶液进行消毒的时间为1-3min。

所述hgcl2溶液的浓度为0.1％。

通过先采用浓度为60～80％的乙醇进行快速涮洗，再用0.05～0.2％的升汞(hgcl2)消毒1-3min，更好地解决了外植体外灭菌难以控制的问题，降低污染率、褐变率，且不影响外植体的自然生长。

步骤(2)中，采用无菌水对所述芽体进行冲洗3-5遍。

步骤(3)中，所述培养基为ms培养基，所述丛芽培养基为ms+6-ba1mg/l+naa0.01mg/l培养基。

步骤(3)中，进行所述暗培养的温度为15～20℃，进行所述暗培养的时间为7～10天；

进行所述培养诱导丛芽时，所述培养诱导丛芽的温度为15～25℃，每天所述光照的时间为18-24h。

步骤(4)中，所述生根培养基为1/2ms+6-ba0.2mg/l+naa0.5～0.7mg/l或者1/2ms+6-ba0.2mg/l+iaa0.5～0.7mg/l。

步骤(4)中，所述培养生根的温度为15～25℃，所述光照为1500～2000lx强度光+自然光，每天所述光照的时间为10～12h。

步骤(5)中，所述基质的组成为沙壤土和岩石块按照质量比8:1～12:1组成的混合物；

培养5-6个月后，定植于野外，35-36个月后收获。

本发明的有益效果为：

本发明所述的濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法，通过将选好的植株芽体先后采用乙醇和hgcl2溶液进行消毒，再采用无菌水冲洗，得到无菌外植体在无菌条件下依次进行接种、培养诱导丛芽、生根培养、练苗移栽和定植，直至收获得到矮紫堇药材。本发明所述组织培养方法填补矮紫堇组织培养技术空白，不受季节限制，可周年生产种苗，实现人工繁育。本发明所述组织培养方法利用优质健壮矮紫堇的顶芽组织(植株芽体)灭菌获得的无菌组织(无菌外植体)通过分裂分化而获得完形植株，成本低，繁殖快，能够适应高原地区温差大、气温低、紫外线强的独特环境，并且育苗速度快，遗传性好，可周年生产种苗。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法，步骤包括：

(1)选健壮植株芽体，先用体积浓度为60％的乙醇进行快速涮洗，再用浓度为0.05％hgcl2溶液进行消毒1min；

(2)将步骤(1)处理后的芽体采用无菌水快速冲洗3遍，再将芽体表面水吸干，得到无菌外植体，待用；

(3)在无菌条件下，将步骤(2)所述无菌外植体接种到ms培养基上，在15℃暗培养10天后，转接到ms+6-ba1mg/l+naa0.01mg/l培养基上，在15℃、光照下培养诱导丛芽30天，以形成丛芽；每天所述光照的时间为18h；

(4)将所述丛芽转入1/2ms+6-ba0.2mg/l+naa0.5mg/l中，在15℃、1500lx强度光+自然光条件下进行培养生根10天，得到生根试管苗；每天所述光照的时间为10h；

(5)将所述生根试管苗经练苗移栽到基质中，所述基质的组成为：沙壤土和岩石块按照质量比8:1组成的混合物，培养5个月形成植株后，定植于野外，35个月收获。

实施例2

本实施例提供一种濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法，步骤包括：

(1)选健壮植株芽体，先用体积浓度为80％的乙醇进行快速涮洗，再用浓度为0.2％hgcl2溶液进行消毒3min；

(2)将步骤(1)处理后的芽体采用无菌水快速冲洗5遍，再将芽体表面水吸干，得到无菌外植体，待用；

(3)在无菌条件下，将步骤(2)所述无菌外植体接种到ms培养基上，在20℃暗培养7天后，转接到ms+6-ba1mg/l+naa0.01mg/l培养基上，在25℃、光照下培养诱导丛芽35天，以形成丛芽；每天所述光照的时间为24h；

(4)将所述丛芽转入1/2ms+6-ba0.2mg/l+naa0.7mg/l中，在25℃、2000lx强度光+自然光条件下进行培养生根15天，得到生根试管苗；每天所述光照的时间为12h；

(5)将所述生根试管苗经练苗移栽到基质中，所述基质的组成为：沙壤土和岩石块按照质量比12:1组成的混合物，培养6个月形成植株后，定植于野外，36个月收获。

实施例3

本实施例提供一种濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法，步骤包括：

(1)选健壮植株芽体，先用体积浓度为70％的乙醇进行快速涮洗，再用浓度为0.1％hgcl2溶液进行消毒2min；

(2)将步骤(1)处理后的芽体采用无菌水快速冲洗4遍，再将芽体表面水吸干，得到无菌外植体，待用；

(3)在无菌条件下，将步骤(2)所述无菌外植体接种到ms培养基上，在18℃暗培养8天后，转接到ms+6-ba1mg/l+naa0.01mg/l培养基上，在22℃、光照下培养诱导丛芽32天，以形成丛芽；每天所述光照的时间为21h；

(4)将所述丛芽转入1/2ms+6-ba0.2mg/l+iaa0.5mg/l中，在22℃、1800lx强度光+自然光条件下进行培养生根12天，得到生根试管苗；每天所述光照的时间为11h；

(5)将所述生根试管苗经练苗移栽到基质中，所述基质的组成为沙壤土和岩石块按照质量比10:1组成的混合物，培养6个月形成植株后，定植于野外，36个月收获。

实施例4

本实施例提供一种濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法，步骤包括：

(1)选健壮植株芽体，先用体积浓度为70％的乙醇进行快速涮洗，再用浓度为0.1％hgcl2溶液进行消毒2min；

(2)将步骤(1)处理后的芽体采用无菌水快速冲洗4遍，再将芽体表面水吸干，得到无菌外植体，待用；

(3)在无菌条件下，将步骤(2)所述无菌外植体接种到ms培养基上，在18℃暗培养8天至芽体发芽后，转接到ms+6-ba1mg/l+naa0.01mg/l培养基上，在20℃、光照下培养诱导丛芽33天，以形成丛芽；每天所述光照的时间为21h；

(4)将所述丛芽转入1/2ms+6-ba0.2mg/l+iaa0.7mg/l中，在20℃、1800lx强度光+自然光条件下进行培养生根13天，得到生根试管苗；每天所述光照的时间为11h；

(5)将所述生根试管苗经练苗移栽到基质中，所述基质的组成为沙壤土和岩石块按照质量比10:1组成的混合物，培养6个月形成植株后，定植于野外，36个月收获。

实施例5

本实施例提供一种濒危藏药材矮紫堇的组织培养方法，步骤包括：

(1)选健壮植株芽体，先用体积浓度为70％的乙醇进行快速涮洗，再用浓度为0.15％hgcl2溶液进行消毒2min；

(2)将步骤(1)处理后的芽体采用无菌水快速冲洗4遍，再将芽体表面水吸干，得到无菌外植体，待用；

(3)在无菌条件下，将步骤(2)所述无菌外植体接种到ms培养基上，在18℃暗培养8天至芽体发芽后，转接到ms+6-ba1mg/l+naa0.01mg/l培养基上，在20℃、光照下培养诱导丛芽34天，以形成丛芽；每天所述光照的时间为21h；

(4)将所述丛芽转入1/2ms+6-ba0.2mg/l+naa0.6mg/l中，在20℃、1800lx强度光+自然光条件下进行培养生根14天，得到生根试管苗；每天所述光照的时间为11h；

(5)将所述生根试管苗经练苗移栽到基质中，所述基质的组成为沙壤土和岩石块按照质量比10:1组成的混合物，培养6个月形成植株后，定植于野外，36个月收获。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。