本发明属于农业技术领域，涉及棉花杂交种生产过程中的免去雄、免挂标记的制种方法。
背景技术：
棉花杂交种的生产和应用对于提高棉花产量、改进品质、增强抗性等发挥了重要作用。然而，目前棉花杂交种的生产方式主要采用人工去雄授粉的制种方法(占90％以上)。随着我国棉花主产区及周边地区的劳动力成本的逐年上升，杂交种生产成本逐年提高，导致许多从事杂交棉制种的种子企业难以为继，从而不利于杂交棉的进一步大规模推广利用。
人工去雄是棉花杂交种中最为繁琐的工序，需要大量的劳动力。为了实现不去雄简化制种，细胞核雄性不育两系法、细胞质雄性不育三系法和化学杀雄等技术都慢慢在棉花杂交制种中开始探索应用，然而两系法在制种过程中，需要多次鉴定拔除50％的可育株，环节繁琐，比较费工；三系法由于强恢复力的优良恢复系亲本资源的匮乏，杂交组合选配受到亲本数量的限制，强优势杂交种选育困难；化学杀雄技术也受杀雄剂和环境影响而表现出不同的敏感性，杀雄效果的稳定性仍有待提高。因此，遵从棉花自身的生长规律，对目前采用的常规人工去雄授粉技术进行改进，研发免去雄、免挂标记的简化杂交制种技术成为棉花制种行业亟待解决的问题。
发明专利申请201110041152.2公开了一种棉花杂交制种方法，该专利文献探索出一种避免人工去雄、简化杂交制种的柱头套管新方法，即人工授粉前套管，套管后于上午7-10时，准备好父本的花粉，然后取下套管授粉，授粉后再套上套管。该文献虽然省去了人工去雄步骤，但是它是在母本雄蕊散粉之后授粉，事先套管主要是隔离母本自交，但在去管授粉时，母本花的雄蕊已包裹雌蕊，并大量散粉，去管露出雌蕊非常容易自交，杂交种的纯度难以保证。同时该文献是人工授粉前寻找母本花套管并挂标记，授粉时，再找标记、去管授粉，再套管，再去标记，仍然是费工费时。
技术实现要素：
针对常规的人工去雄授粉技术费时、费工，现有套管方法杂交种纯度难保证的问题，本发明提供一种可以保证种子纯度的免去雄简化杂交制种方法。本发明基于棉花花药散粉后，花粉在冷藏(4-8℃)条件下，在24小时内仍具有80％生活力，以及雌蕊柱头在开花前5-6小时具有受精能力的研究结果，创造性地采取母本花花药散粉前4-5小时进行授粉(授粉前一天预先采集父本花粉)，并采用柱头套蜡管防止雨水或露水影响授粉效果和昆虫活动引起的串粉，成功地实现了免除操作繁琐的去雄手续和挂标记的工序，从而大大简化了棉花杂交制种程序，且确保了杂交种的纯度。
本发明的技术方案是：一种棉花免去雄简化杂交制种方法，其特征是，包括以下步骤：
1)采集父本花粉
人工授粉前一天早上7～8点，制种人员从父本株上摘下花朵晾晒，等花充分散粉后，收集花粉装入授粉瓶中，保存于4-8℃冰箱备用；
2)母本人工授粉
当天凌晨2-5点，制种人员逐株寻找即将于当天开放的母本花朵，剥开花瓣露出柱头后，进行人工授粉；人工授粉后取出蜡管套在柱头上，手捏蜡管顶端，使顶端封闭；
3)排查遗漏
早上6-7点，再次排查，对遗漏的待开放的母本花朵按照步骤2)进行人工授粉，7点以后，严禁剥花授粉，直接去除制种田母本所有待开放的花蕾。
优选的，所述步骤1)收集花粉装入授粉瓶前需要采用筛网筛粉，且授粉瓶中花粉或花药量为授粉瓶容积的1/2～2/3。
优选的，所述步骤2)的蜡管，长2-3cm，直径2.5-4.0mm。蜡管的材质为纸和石蜡(用纸卷成小管，浸入融化石蜡中，捞起晾干)，制作简单，价格便宜。
优选的，所述步骤2)的人工授粉为：授粉时一只手拿前一天已经收集花粉的授粉瓶，水平靠近已经剥开花瓣露出的柱头，另一只手用拇、食指捏住柱头，通过授粉瓶盖上的小孔将柱头插入授粉瓶中，然后将授粉瓶倒扣过来，使母本柱头埋没在授粉瓶内的花粉中，轻轻转动授粉瓶后从柱头上移开，完成授粉。
本发明与现有的棉花人工去雄技术相比，具有以下优势：
1)凌晨授粉避开了不利的条件
棉花常规人工去雄授粉杂交种制种往往由于露水的影响而不得不等待父本散粉，往往9点以后才能授粉，下午还要进行去雄。夏季白天经常高温，长时间在棉田中工作容易中暑。
本发明创新性的在凌晨进行授粉，是基于以下条件：①雌蕊柱头在开花前5-6小时具有受精能力的研究结果；②柱头套管，防止露水影响授粉效果；③父本花粉在冷藏(4-8℃)条件下，在24小时内仍具有80％生活力，因此可以提前进行父本花粉采集、晒粉和冷藏。
母本授粉的时间提前到母本开花散粉前4-5小时的凌晨进行。具有以下好处：①授粉时间提前到母本花粉散粉前完成，防止了母本自交；授粉后通过套管防止了串粉，因此提高了杂交种的纯度；②可以避开夏天极端高温环境，有效减少相关工作人员受到的高温危害。
2)制种纯度高
棉花常规人工去雄授粉杂交种制种过程中，即使是熟练的工人在去雄过程中也难免会有雄蕊遗漏，这样这些遗漏的雄蕊一旦散粉将对棉花杂交种纯度造成很大影响。该方法由于将授粉时间提前到母本花粉散粉前完成防止了母本自交，并且采用柱头套管，从而有效避免了昆虫活动而引起的串粉，以及雨水或露水影响授粉效果等问题，确保了制种纯度。
3)节省劳动力成本
棉花常规人工去雄授粉杂交种制种，需要在母本花开花前进行人工剥除雄蕊，并挂上标记作为授粉时寻找的标识。去雄不仅要求操作人员花费大量的时间，而且技术要熟练，否则造成雌蕊损伤而脱落。而该发明是在母本开花散粉前就完成授粉，这样就不需要进行去雄和挂标记的操作，从而简化程序，大大减少劳动力的投入，而且规避了对熟练去雄工人的依赖。因此极大地提高了制种效率和可操作性。
本发明对一个审定的杂交种中棉所109进行了两年制种试验，试验结果表明：该方法简单易行，便于操作，省工、省时，制种产量和常规人工去雄授粉产量相当且杂交种的纯度略有提高，因此本发明的制种方法实用性强，便于推广。
本发明相比发明专利申请201110041152.2的柱头套管法具有以下优势：
1)省时省工
文献是在人工授粉前寻找母本花套管并挂标记，授粉时，再找标记、去管授粉，再套管，再去标记，仍然是费工费时。本发明一次寻找，一次授粉，不需挂标记，真正做到省工省时。
2)种子纯度高
文献中人工授粉时需要去管露出雌蕊，此时母本雄蕊已散粉，这样非常容易自交，杂交种纯度难保证。本发明是在棉花雄蕊散粉之前就授粉，不存在自交现象，套管主要防止雨水或露水影响授粉效果和昆虫活动引起的串粉，纯度得到保证。
具体实施方式
以下实施例用于本发明说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：棉花免去雄辅助授粉简化杂交制种方法
1)采集父本花粉
人工授粉前一天早上7～8点，制种人员从父本株上摘下花朵，放在展开的塑料膜上晾晒，等花充分散粉后，用筛网筛粉，收集花粉装入授粉瓶中，花粉或花药量以授粉瓶容积的1/2～2/3为宜，收集后保存于4-8℃冰箱备用。
2)母本人工授粉
当天凌晨3点左右(±20分钟)，制种人员佩戴头戴式矿灯，在母本行逐株寻找将于当天开放的花朵(花蕾约2/3露出苞叶，花瓣呈现青白色，显眼易找)，剥开花瓣露出柱头后，进行人工授粉。授粉时一只手拿前一天已经收集花粉的授粉瓶，水平靠近已经剥开花瓣露出的柱头，另一只手用拇、食指捏住柱头，通过授粉瓶盖上的小孔将柱头插入授粉瓶中，然后将授粉瓶倒扣过来，使母本柱头埋没在授粉瓶内的花粉中，轻轻转动授粉瓶后从柱头上移开，完成授粉。然后取出蜡管(长2-3cm，直径3mm)套在柱头上，手捏蜡管顶端，使顶端封闭(防止串粉和雨淋)。
3)排查遗漏
早上6点以后，天已大亮，对母本材料再次排查，对遗漏的待开放的母本花朵按照上述程序进行人工授粉，到了7点以后，严禁剥花授粉，去除制种田母本所有待开放的花蕾。
试验例：人工去雄和免去雄制种比较
本发明于2016年和2017年在河南商丘梁园李庄分别安排了2亩和1.5亩的人工去雄和免去雄对比试验。中棉所109(赣审棉20180006)的父本(gkz中杂a49-668)和母本(l28a)按当地正常条件种植和管理。于盛花期利用两种制种方法同步进行杂交制种和收获，实验设计以及用工量和杂交种产量如表1所示。
杂交种收获后对杂交种进行纯度鉴定，鉴定方法如下：
1)dna提取
参照成熟的棉花ctab提取dna技术，将父本(gkz中杂a49-668)、母本(l28a)和杂交种(中棉所109，赣审棉20180006)材料的种子剥去外壳，每粒种子单独磨碎后转入2ml离心管；加入1000μldna提取液(0.05mtris-cl，0.01medta，2％sds，1％pvp，0.5％山梨醇，0.705mnacl，ph＝8.0，高压灭菌；使用前加入1％β-巯基乙醇)，漩涡混匀后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇离心管；水浴结束后，加入800μl苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀至不分层(动作轻缓，时间充分)，12000rpm离心10min。吸取上清液(约800μl)转移到另一灭菌的2ml离心管中，加入2μlrnase酶(10mg/ml)，混匀后37℃水浴30min；取出后加入1000μl的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀至不分层，12000rpm离心10min；用剪口枪头吸取上清液(约700μl)转移到另一灭菌的2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状dna成团析出；用剪口枪头吸取dna转移至盛有70％乙醇的2ml硅化离心管中，浸泡两次，每次十分钟，无水乙醇浸泡过夜；倒掉乙醇，倒置管壁晾干后(约30min)，加入200μlddh2o，室温溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/μl，-20℃保存备用。
2)分子标记鉴定
利用已经授权发明专利“辅助鉴别常规棉和杂交棉的方法及其专用试剂盒”(zl200910235514.4)，按照该专利中公布的程序进行基因型分析和鉴定，杂交种子纯度如表1所示。
表1.人工去雄授粉和免去雄杂交制种效果比较
从表1可以看出：采用本发明的免去雄杂交制种方法，可以显著减少劳动力投入(每日每亩用工量减少5小时)，且制种产量相当，制种纯度有一定提高(提高3-4％)。因此，利用本发明免去雄辅助授粉杂交制种的方法可以实现简化杂交制种的目的，且杂交种的种子纯度略有提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。