本发明涉及一种茎尖长期保存方法，具体是一种金银忍冬茎尖超低温保存方法。
背景技术：
金银忍冬，别名金银木，属忍冬科忍冬属，是我国良好的观赏灌木之一。树皮常具有不规则纵列，颜色呈灰白色至灰褐色。金银忍冬花腋生，每2朵小花生于一枚总花柄上，单花为唇形花冠，花朵开放时期为白色，开放后逐渐变为淡黄色，层层开花，金银相映。果实为红色浆果，常簇生于长枝上，秋天观赏，红果累累。金银忍冬花朵清雅芳香，是优良的蜜源树种；金银忍冬适应环境能力强，喜光、耐半荫，耐寒且耐旱，管理简单；金银忍冬的果、叶和花中含有丰富的脂肪、类胡萝卜素和维生素c；金银忍冬果实多糖含量高且果的多糖是一种天然抗氧化剂，在医疗、食品及化妆品产业均有开发利用价值；金银忍冬全株都有药用价值,可以增强免疫力，具有清热解毒的功效，其中叶的浸汁可杀棉蚜虫等,花则可作金银花用。因此，金银忍冬在观赏、工商业及药用方面具有较高的应用价值。由于金银忍冬茎尖的超低温保存可以维持金银忍冬的遗传稳定性，为了避免由于外界气候的变化以及人类的过度开发而导致的金银忍冬种质资源的灭绝，所以可用茎尖进行超低温保存，从而保持其优良特性。
超低温保存是指通过一定的保存处理，使保存材料可以实现在－196℃液氮低温中安全长期保存，取出时并采取一定的解冻方法令其恢复常温并使材料可以正常恢复生长的一整套生物技术。在这一变化过程中，保存材料细胞内的化学成分没有发生实质性的变化，仅在物理结构方面发生变化，且这种变化是可逆的，因此不会有效损伤到细胞的生物学活性，所以在植物材料解冻后仍然能够保持普通细胞的正常活性及遗传稳定性，从而有效、安全地长期保存植物种质资源。由于茎尖的分生组织细胞的分化程度较小，在超低温保存后的再生过程中遗传物质相对于其他材料稳定，大部分可直接形成完整的小植株，可大大降低植物变异的可能性，特别是针对一些通过营养繁殖的植物种类和一些易产生变异的植物类型，茎尖更是最理想的超低温保存材料。
用茎尖进行超低温保存，其优点是：遗传稳定性强、可保持其优良特性、操作方便、可行性强，利于种质资源的保存。
目前，金银忍冬茎尖超低温保存还尚未见报道。所以研发一种适合于金银忍冬茎尖超低温保存的方法是非常有必要的。
技术实现要素：
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
本发明涉及一种金银忍冬茎尖超低温保存的方法，依次包括：金银忍冬茎尖的剥离和预培养、装载、脱水、液氮保存、解冻以及恢复培养的方法。
优选地，所述的剥离和预培养是指：将剥离后的茎尖放入预培养液中处理，预培养液中蔗糖最适浓度为0.3mol/l的ms溶液，于4℃条件下预培养3d。
优选地，所述的装载具体是指：将预培养后的离体茎尖转接于ls装载液中，于室温25℃下装载10～50min；所述的装载液的组成为：2m甘油+0.4mol/l蔗糖+ms的溶液。
优选地，所述的脱水具体是指：将装载后的茎尖放入pvs2保护液于0℃条件下脱水20～100min；所述的pvs2保护液的组成为：30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/l蔗糖+ms的溶液。
优选地，所述的液氮保存是指：将pvs2保护液处理后的茎尖更换新鲜的pvs2保护液，然后迅速投入液氮中，保存24h。
优选地，所述的解冻是指：将液氮保存后的冷冻管取出进行化冻，所述的化冻方式为：用40℃水浴解冻茎尖70s。
优选地，所述的恢复培养具体是指：将用卸载液洗涤20min后的茎尖接种在恢复培养基上进行恢复培养；所述的卸载液组分为：1.2mol/l蔗糖+ms的溶液；所述的恢复培养基为：ms+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l+ga31.0mg/l；所述的恢复培养条件为：先在25℃培养箱中暗培养14d，然后转入正常光下进行培养。
与现有技术相比，本发明存在以下有益结果：
本发明的一种金银忍冬茎尖超低温保存的方法,是一种稳定性高、安全有效、简便易行的优良种质资源保存方法，保存后茎尖成活率可高达73％；本发明以金银忍冬无菌苗茎段茎尖为超低温保存材料，具有独特的优越性，由于茎尖分生组织细胞的分化程度小，在超低温保存后的再生过程中遗传物质相对于其他材料稳定，大部分可直接形成完整的小植株，大大降低植物变异的可能性，因此是最理想的超低温保存材料。
附图说明
图1为本发明实施例2中预培养液的蔗糖浓度对金银忍冬超低温保存后茎尖成活率的影响
图2为本发明实施例2中预培养时间对金银忍冬超低温保存后茎尖成活率的影响
图3为本发明实施例3中装载液处理时间对金银忍冬超低温保存后茎尖成活率的影响
图4为本发明实施例4中pvs2保护液处理时间对金银忍冬超低温保存后茎尖成活率的影响
图5为本发明实施例5中不同解冻方式对金银忍冬超低温保存后茎尖成活率的影响
图6为本发明实施例6中恢复培养基对金银忍冬超低温保存后茎尖成活率的影响
图7为本发明中金银忍冬茎尖超低温保存体系流程图；1通过茎段获得无菌苗；2超低温保存后转入恢复培养基的金银忍冬茎尖；3暗培养两周后金银忍冬的茎尖；4超低温保存后培养一个月左右的茎尖；5-7超低温保存后金银忍冬茎尖形成的小苗；8-9超低温保存后金银忍冬的茎尖的再生苗的生根；10-12超低温保存后金银忍冬再生苗的移栽
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
实施例1
一种金银忍冬茎尖超低温保存的方法，具体操作如下：
1)在无菌条件下，从含茎尖的金银忍冬无菌茎段上剥取茎尖长度为2～3mm的含2个叶原基的离体茎尖；
2)将剥离后的茎尖放入预培养液中进行处理，预培养液中蔗糖最适浓度为0.3mol/l的ms溶液，于4℃条件下预培养3d；
3)将预培养后的离体茎尖放于ls装载液中，于室温25℃下装载10～50min；所述的装载液的组成为：2m甘油+0.4mol/l蔗糖+ms的溶液；
4)将装载后的茎尖放至pvs2保护液于0℃条件下脱水20～100min；所述的pvs2保护液的组成为：30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/l蔗糖+ms的溶液；
5)将pvs2保护液处理后的茎尖更换新鲜的pvs2保护液，然后迅速投入液氮中，保存24h；
6)将液氮保存后的冷冻管取出进行化冻，所述的化冻方式为：用40℃水浴解冻茎尖70s；
7)所述的恢复培养具体是指将用卸载液洗涤20min后的茎尖接种在恢复培养基上进行恢复培养；所述的卸载液组分为：1.2mol/l蔗糖+ms的溶液；所述的恢复培养基为：ms+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l+ga31.0mg/l；所述的恢复培养条件为：先在25℃培养箱中暗培养14d，然后转入正常光下进行培养。
实施例2
测试预培养基中蔗糖浓度和预培养时间对金银忍冬茎尖超低温保存的影响：仅改变预培养基中的蔗糖浓度和预培养时间，首先将剥取的茎尖分别放入装有不同浓度(0.1～0.6mol/l)蔗糖的ms溶液中进行预培养；预培养温度条件为4℃，培养时间为0～5d；然后统计茎尖成活率。研究结果表明(如图1图2所示)将剥离的茎尖放入不同蔗糖浓度的预培养液中进行不同时间的预培养后，茎尖的成活率表现出不同，当蔗糖浓度为0.3mol/l，于4℃条件下预培养3d时，茎尖成活率最高可达60％。由此可知预培养是影响金银忍冬茎尖超低温保存成活率的关键因素，最佳的预培养蔗糖浓度为0.3mol/l，预培养时间为3d。
实施例3
测试ls装载液处理时间对超低温保存后茎尖成活率的影响：在无菌的超净工作台中，将经过预培养的茎尖放入ls装载液中，于室温25℃条件下装载处理不同的时间(0、10、20、30、40、50min)。从研究结果可看出(如图3所示)，经过装载液处理和不经过处理的对照组之间存在显著差异，不经装载液处理的茎尖成活率非常低，茎尖成活率仅为3.3％；当随着装载时间的增加，茎尖的成活率呈先升高后下降的趋势，在ls装载40min时达到最高为63.67％，并与其他装载时间下的茎尖的成活率具有显著差异性，当ls装载时间为50min时，此时的茎尖成活率下降了17％，此时说明装载时间过长，对茎尖细胞造成了伤害，使用适合的装载时间可以降低细胞组织内的水分，从而使超低温保存后的茎尖成活率得到明显提高。故ls装载40min为最优选择。
实施例4
测试了pvs2保护液处理时间对超低温保存后茎尖成活率的影响：茎尖经ls装载液处理完毕后，将茎尖放至无菌滤纸上停留5秒，去除装载液的残余液体，然后迅速将茎尖放至装有pvs2保护液的冷冻管中于0℃环境下脱水一定时间(0min、20min、40min、60min、80min和100min)，然后测定茎尖的成活率；研究结果表明(如图4所示)当茎尖不经过pvs2脱水处理这一步骤直接投入液氮冷冻时，茎尖的成活率为0，说明金银忍冬的茎尖必须经过pvs2脱水处理，当处理时间为20min时，茎尖的成活率从0提高至36.7％，当pvs2处理时间为40min时，此时茎尖的成活率达到最高即66.67％，但与40min处理下的茎尖的成活率没有显著的差异性。当pvs2处理时间继续增加时，茎尖的成活率较低，说明长时间的处理已经对茎尖细胞造成了伤害。虽然对茎尖处理40min和处理60min没有显著的差异性但为了避免二甲基亚砜对细胞的伤害，故选择pvs2处理茎尖40min。
实施例5
测试了不同解冻方式对金银忍冬茎尖成活率的影响：将装有经过脱水后更换保护液的茎尖的冷冻管从液氮中捞出后迅速进行解冻，包括投入40℃水浴锅中化冻70s、自来水解冻4min和在室温解冻20min三种方式；研究结果表明(如图5所示)茎尖的解冻方式不同，其成活率有较大差异，当使用40℃水浴解冻茎尖70s时，此时的成活率最高，为66.67％，并与其他解冻方式下的茎尖具有显著的差异性。当对茎尖采用自来水解冻4min时，茎尖的成活率并不高，为26.67％；当对茎尖采用25℃室温解冻时，恢复培养后的茎尖成活率为0，故对冷冻后的茎尖采用40℃水浴快速解冻70s，可以有效保证恢复培养后的茎尖能够正常生长。
实施例6
测试了恢复培养基对超低温保存后茎尖成活率的影响：将解冻后的茎尖放至无菌滤纸上停留5秒，以去除pvs2保护液的残余液体，随后分别用新鲜的卸载液洗涤茎尖两次，每次10min。再将茎尖放至无菌滤纸上进行去除残余的卸载液，接着将茎尖迅速转入恢复培养基中。其中卸载液组分为：1.2mol/l蔗糖+ms的溶液；恢复培养的条件为：黑暗环境下培养2周，再移至正常光下进行培养，温度为25℃；根据已有的关于忍冬科、忍冬属和金银忍冬植物的组织培养中的培养基配方将恢复培养基设置为：1号ms；2号ms+6ba0.5mg/l+naa0.1mg/l；3号ms+6ba2.0mg/l；4号ms+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l+ga31.0mg/l；5号ms+kt0.5mg/l+naa0.2mg/l；研究结果表明(如图6所示)，茎尖在1号ms基本培养基上的成活率明显低于其他添加激素的培养基。茎尖的成活率在采用4号培养基后达到最大值为73.3％，其中较1号茎尖的成活率提高了67％，较2号提高了43.3％，由此可知激素kt和ga3共同效果较6-ba相对较好，虽然茎尖经5号培养后，其成活率为66.7％，与4号并无显著差异，但择优选择，故本试验的金银忍冬茎尖宜采用4号培养基，可以使茎尖可以经超低温冷冻后获得较好的恢复效果。随后再利用金银忍冬茎尖组织培养体系将其直接培养成苗。其中增殖培养基：ms+kt0.5mg/l+naa0.04mg/l；生根培养基：1/2ms+iba0.8mg/l。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。