本发明涉及消毒技术领域，具体涉及一种由亚氯酸盐与过氧化氢抗氧剂组成的杀孢子剂及其制备方法与应用。
背景技术：
消毒剂(disinfectant)是指用于杀灭传播媒介上病原微生物，使之达到无害化要求的化学制剂。杀孢子剂(sporicide)则是能把芽孢、孢子杀灭的消毒剂。目前常用的杀孢子剂按类别分主要为过氧化物杀孢子剂(如过氧化氢和过氧乙酸等)，活性氯杀孢子剂(如次氯酸/钠和二氧化氯等)，以及醛类物质杀孢子剂(如甲醛、戊二醛和邻苯二甲醛等)，用于空间消毒灭菌时常用雾化或汽化的方法。
采用雾化或汽化的方法使用单一组分的过氧化物杀孢子剂进行空间消毒灭菌时因需使用较高浓度(如过氧化氢的使用浓度需要大于30％)、腐蚀性比较严重，在低温和高湿度条件下消毒灭菌效果也不理想，特别是对某些病毒的杀灭能力不理想，因而限制了其使用范围。
采用雾化或汽化的方法使用复合过氧化物杀孢子剂(如过氧化氢和过氧乙酸复合物)进行空间消毒灭菌时，虽然可以降低过氧化物的使用浓度，减轻腐蚀性，但仍然没有解决在低温和高湿度条件下消毒灭菌效果不理想的问题。
醛类物质杀孢子剂用于空间消毒灭菌时，虽然其消毒灭菌效果受温度和湿度的影响不大，但因其毒性较大，在许多国家已经禁止在很多领域特别是药品食品制造领域使用。
常用的活性氯杀孢子剂(如次氯酸/盐和二氧化氯等)用于空间消毒灭菌时，在低温和高湿度条件下均具有较好的消毒灭菌效果，杀灭病毒的活性也较一般的过氧化物高，但因非常不稳定，使用极不方便。
二氧化氯(ClO2)是目前公认的一种优良的消毒剂，它可以杀灭一切微生物，包括细菌繁殖体、细菌芽孢、真菌、分枝杆菌和病毒等。ClO2易溶于水，在水中几乎100％以分子状态存在，所以极易穿透细胞膜，渗入细菌细胞内，将其核酸(DNA或RNA)氧化，从而阻止细菌的合成代谢，并使细菌消亡。因此ClO2具有适用面广、使用剂量低、反应快、效果好、持续时间长，无毒、对环境不产生有害影响等优点。但二氧化氯无论在气态还是在溶液中都极不稳定，特别是遇光和热或遇有机物等，均能促进其发生分解(气态ClO2在日光下的半衰期仅约1小时)，在50℃时就会引起爆炸式分解产生氧气(O2)和有毒的氯气(Cl2)，所以气态二氧化氯在实际应用中的安全性还并未完全得到保障，使用时也极不方便，必须现场制备。使用二氧化氯的水溶液虽然比较安全，但同样存在不稳定的问题，活化后的二氧化氯溶液的半衰期仅为1天，因此也必须现配现用，活化前多以没有抗菌活性的“稳定性”二氧化氯(其实质是含有亚氯酸盐的碱性溶液)的形式储存，使用时加酸或者氧化剂进行活化产生二氧化氯。其活化反应如下：
ClO-2+H+→HClO2(加少量酸调节pH)
5HClO2→4ClO2↑+HCl+2H2O(放置)
4ClO-2+2H+→2ClO2↑+HClO3+HCl+H2O(加入大量酸活化，pH<1，无外加Cl-)
5ClO-2+4H+→4ClO2↑+Cl-+2H2O(加入大量酸活化，pH<1，有外加Cl-)
2ClO-2+S2O2-8→2C1O2↑+2SO2-4(加入大量强氧化剂活化，pH＝5-9)
由上述反应可知：采用加强酸或加强氧化剂对亚氯酸钠进行活化制备二氧化氯消毒液时均会产生大量的强电解质甚至会产生强酸如盐酸、氯酸等，采用这几种方法制备的二氧化氯消毒液只适合在低浓度下用于表面消毒和水的消毒，不适合在高浓度下采用喷雾的方式用于空间消毒，否则就会对消毒物体的表面特别是对金属物体表面产生腐蚀作用。
当亚氯酸转化为亚氯酸盐如亚氯酸钠盐和钾盐等，无论在固态还是在溶液状态下均比较稳定。
近年来的研究表明，亚氯酸盐在较低pH条件下也具有消毒灭菌活性，且稳定性优于二氧化氯。
PCT国际专利(WO2014/188310EN 2014.11.27)公开了一种的包含亚氯酸水溶液的消毒剂，主要用作物体表面杀菌剂、食品添加剂、防腐剂和药用制剂等，该消毒剂在pH6.5左右时仅能生成少量的二氧化氯，因而比较稳定。该技术并没有注明具体的可稳定时间。事实上，该消毒剂在pH 3.5时会产生大量二氧化氯，因此该技术提出的亚氯酸消毒剂在pH低于6.5时是不稳定的，另外由于含有大量强电解质，也不适合采用喷雾法用于空间消毒。
PCT国际专利(WO2014/188312EN 2014.11.27)公开了一种亚氯酸水溶液制剂的长期保存和新应用，其特征在于包括亚氯酸水溶液、金属氢氧化物和金属磷酸盐，用于物体表面消毒和空气中除异味。该消毒剂的最大特点是在pH5-7时抗菌活性最强，放置1个月，其抗菌活性(用酚系数表示)仅下降约10％左右；但当pH低于4时，放置1个月，其抗菌活性(用酚系数表示)会下降约70％左右。当pH低于3时放置1个月，其抗菌活性(用酚系数表示)就完全消失(此时已经检测不出二氧化氯(紫外光谱在355-358nm的波长处已经没有最大吸收存在)和亚氯酸(紫外光谱在260nm的波长处也检测不出最大吸收存在))。
PCT国际专利(WO2008/099911JA 2008.08.21)公开了一种保存稳定性优异的广谱抗病毒药剂组合物，其特征在于由纯二氧化氯液体制剂构成，所述纯二氧化氯液体制剂作为构成成分含有溶存二氧化氯气体、亚氯酸盐和pH调整剂(磷酸或其盐)，该抗病毒药剂组合物由于加入了磷酸或其盐作为pH调节剂和稳定剂(pH5.5-6)，储放一年后仍然具有广谱的抗病毒活性。
由此可见，现有技术制备的含有亚氯酸钠的消毒液，其pH必须大于5.5，且含有大量强电解质。如果pH低于5.5，则其稳定性不超过1个月。
技术实现要素：
为了解决现有含氯杀孢子剂在用于空间消毒灭菌时存在的安全性、有效性、腐蚀性和稳定性的问题，特别是为了解决现有活性氯消毒液不稳定(尤其在酸性条件下不稳定)、含有大量强电解质容易对金属材料产生腐蚀问题以及不适合用于空间消毒灭菌等问题，本发明提供了一种稳定的、仅含有少量的电解质且对细菌芽孢和病毒均有较好杀灭作用的杀孢子剂。
本发明所述的杀孢子剂，按重量百分比计，包含：
(1)0.05-5％亚氯酸盐；
(2)0.1-10％过氧化氢抗氧剂；
(3)pH调节剂；
其中，所述pH调节剂的用量为使得所述杀孢子剂的pH值为3-6(优选3.5～5.5)。
本发明所述杀孢子剂为微酸性(pH3-6)，且不含大量强电解质。本发明所述的所述杀孢子剂圆满地解决了亚氯酸盐在酸性条件下不稳定的问题和消毒灭菌活性低的问题，同时也产生了优异的消毒杀菌效果，可广泛应用于各种物体表面和可密闭空间(如医院手术室、生产企业车间及隔离器、实验室和生物安全柜等)的消毒或灭菌。
优选地，所述亚氯酸盐的质量百分比为0.1-2.5％。
优选地，所述的亚氯酸盐选自亚氯酸的钾盐、钠盐、钙盐或镁盐中的一种或几种的混合物，更优选为亚氯酸钠。
为了使所述杀孢子剂具有更优异的效果，本发明优选使用过氧化氢作为抗氧剂。此外，本发明所述抗氧剂还可以作为本发明所述杀孢子剂的稳定剂和增效剂。
本发明所述的抗氧剂的质量百分比可以为0.1-10％，优选为0.5-8％。在上述浓度范围内，本发明所述的抗氧剂可使HClO2/ClO-2在溶液中发生如下的循环反应而阻止ClO2分解为Cl2和O2，从而达到稳定HClO2/ClO-2的目的。
理论上，只要是酸性物质，均可作为pH调节剂，包括各种无机酸如盐酸、硫酸、磷酸和碳酸等，各种有机酸如草酸、柠檬酸、醋酸和乳酸等，以及各种酸式盐如硫酸氢钠和磷酸二氢钠等。但通过研究发现，向亚氯酸盐溶液加入不同的pH调节剂(酸性物质)对亚氯酸钠的pH值进行调节，其稳定性均不一样。
为了提高本发明所述杀孢子剂的稳定性等综合性能，本发明所述的pH调节剂优选为可释放氢离子的酸性物质或阳离子交换树脂。
优选地，所述阳离子交换树脂为苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂，更优选001×7型苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂。
优选地，所述酸性物质为磷酸或氨基磺酸。
上述pH调节剂可显著提升本发明所述杀孢子剂的稳定性，其中，强酸性阳离子交换树脂的稳定作用较好，磷酸和氨基磺酸其次。可能的原因是强酸性阳离子交换树脂可以吸附其中的各种金属离子，而金属离子的存在可以对亚氯酸盐和二氧化氯的分解起到催化作用。
本发明选择强酸性阳离子交换树脂或者磷酸或氨基磺酸作为pH调节剂，不仅可以起到pH调节作用，还可以起到稳定剂的作用，另外，选用强酸性阳离子交换树脂还可以起到降低溶液中强电解质的作用。
优选地，所述强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂。由于强酸性阳离子交换树脂不溶于水，只和溶液中的金属离子起交换作用，将溶液中的金属离子慢慢用H+取代而对pH起到调节作用，当达到所需pH后，过滤除去离子交换树脂，也不会产生局部过酸的现象。
从长期的保存稳定性考虑以及从消毒灭菌效果考虑，本发明优选将溶液的pH值调节在3-6的范围内比较合适，更优选3.5～5.5。
更进一步的研究表明，本发明所述的pH调节剂与抗氧剂还具有协同稳定HClO2/ClO-2的作用，所述的抗氧剂也还具有与HClO2/ClO-2协同的抗菌作用。
为了使本发明的杀孢子剂所用的溶剂快速地挥发而产生更快的消毒灭菌效果，本发明除了首选纯化水作为溶剂外，还可以选择水与其他挥发性低碳链的醇(C2-C3)组成的混合溶液作为溶剂；所述挥发性低碳链的醇选自乙醇、正丙醇和异丙醇中的一种或几种，其使用浓度只要能够溶解所述的各组成成分即可，优选占所述溶剂0.5％-50％(w/w)的范围，更优选1％-10％(w/w)。
本发明的杀孢子剂除了包含上述所述主要组成成分外，还可以含有任选的其它可溶性物质，例如过氧化氢稳定剂、表面活性剂、抗腐蚀剂、润湿剂、芳香剂和着色剂等。这些加入的可溶性物质是本领域已知的且不与已经存在的其它成分发生化学反应或者配伍禁忌。其加入量则根据加入物质的种类不同而不同，只要不增加消毒灭菌后所要求或者规定的残留水平，本发明对此不作特别的限定。
作为一个优选的技术方案，本发明所述杀孢子剂由以下重量百分比的组分组成：
(1)0.1-2.5％亚氯酸钠盐；
(2)0.5-8％过氧化氢抗氧剂；
(3)pH调节剂；
(4)余量为水；
其中，所述pH调节剂为磷酸、氨基磺酸或苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂中的一种；所述pH调节剂的用量为使得所述杀孢子剂的pH值为3.5～5.5。
作为一个优选的技术方案，本发明所述杀孢子剂配方如下：
(1)1％亚氯酸钠盐；
(2)5％过氧化氢；
(3)pH调节剂；
(4)余量为水；
其中，所述pH调节剂为苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂；所述pH调节剂的用量为使得所述杀孢子剂的pH值为4。
本发明所述的杀孢子剂可通过本领域常规制备方法制得，为了使本发明所述的杀孢子剂实现最佳的效果，本发明还提供了一种杀孢子剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将亚氯酸盐加入至溶剂中溶解制得溶液；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入pH调节剂以调节溶液pH值(如果使用离子交换树脂调节pH，则应在pH达到要求后过滤除去离子交换树脂)；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入抗氧剂，补加溶剂至所需浓度，搅拌均匀，即得。
本发明制得的杀孢子剂为透明溶液。优选地，将制备好的溶液(杀孢子剂)分装于避光容器中存储。
本发明同时提供了所述杀孢子剂在物体表面消毒和空间消毒或灭菌中的应用。
本发明通过选择过氧化氢作为抗氧剂，选择磷酸或者氨基磺酸或者强酸性阳离子交换树脂作为pH调节剂，选择纯化水或者纯化水与低碳链的醇(C2-C3)组成的混合溶液作为溶剂制备的杀孢子剂，在微酸性条件下(pH3-6)比较好地抑制了溶液中HClO2/ClO-2向ClO2转化，也可以将溶液中使已经产生的ClO2再转化为HClO2/ClO-2，由此保证了HClO2/ClO-2的稳定性得到进一步提高或延长，而且由于所述抗氧剂的协同作用，也使HClO2/ClO-2的消毒灭菌活性得到了加强。由于本发明制备的杀孢子剂不含大量的强电解质，因此作为优选，该杀孢子剂特别适合采用喷雾的方法，用于各种物体表面和可密闭空间(如医院手术室、生产企业车间及隔离器、实验室和生物安全柜等)的消毒或灭菌。
与目前市场上的活性氯杀孢子剂产品相比，本发明具有以下特点：
(1)不含大量强电解质，特别是不含大量硫酸、盐酸或氯酸等强酸性电解质，因而腐蚀性较低，特别适合采用喷雾的方法，用于各种物体表面和可密闭空间(如医院手术室、生产企业车间及隔离器、实验室和生物安全柜等)的消毒或灭菌；
(2)在微酸性环境下，无明显ClO2释放，因而提高了HClO2/ClO-2的稳定性；
(3)与加入的抗氧剂具有协同抗菌作用，也提高了其消毒灭菌活性。
具体实施方式
以下试验例和实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下所述的各组分的浓度均指的是质量百分比浓度。
试验例1：pH调节剂对亚氯酸盐溶液稳定性的影响
取含量80％亚氯酸钠1.25g(相当于亚氯酸钠纯品1g)，先加90ml水溶解，再加适量表1中所列的pH调节剂调节溶液的pH至3.5，最后再补加水至100ml，得浓度为1％的亚氯酸钠/亚氯酸溶液，分别将该溶液经54℃放置1小时和24小时，稀释20倍后测定其在260nm的波长处最大吸收度变化(检查亚氯酸钠的浓度变化)，结果见表1所示。结果表明：选择强酸性阳离子交换树脂或者磷酸或者氨基磺酸作为亚氯酸盐的pH调节剂，不仅可以起到pH调节作用，还可以起到稳定剂的作用。
表1.pH调节剂对亚氯酸/盐溶液稳定性的影响
试验例2：过氧化氢抗氧剂对亚氯酸盐溶液稳定性的影响
取含量80％亚氯酸钠1.25g(相当于亚氯酸钠纯品1g)，先加90ml水溶解，加适量表2中所列的pH调节剂调节溶液pH至4后，再补加水至100ml，得浓度为1％的亚氯酸钠/亚氯酸溶液，另取含量80％亚氯酸钠1.25g(相当于亚氯酸钠纯品1g)，先加90ml水溶解，加50％过氧化氢溶液2g，搅拌均匀，用同样的方法调节溶液pH至4后，再补加水至100ml，得浓度为1％的亚氯酸钠/亚氯酸溶液(含1％过氧化氢)，分别将所制备的溶液经54℃放置1小时和24小时，稀释20倍后测定其在260nm的波长处最大吸收度变化(检查亚氯酸钠的浓度变化)，结果见表2所示。结果表明：加入过氧化氢后，亚氯酸/钠溶液的稳定性明显提高。
表2.抗氧剂(过氧化氢)对亚氯酸/盐溶液稳定性的影响
实施例1
本实施例提供了一种杀孢子剂(共100g)，其配方如下：
(1)80％亚氯酸钠1.25g；
(2)50％过氧化氢5g；
(3)001×7型阳离子交换树脂，调节所述杀孢子剂的pH值为3.5；
(4)余量为水。
实施例2-3
配方见表3。
实施例4～6
本实施例提供了前述实施例1-3所述杀孢子剂的制备方法，按照表3的组成配制实施例1-3的杀孢子剂，具体配制步骤如下：
(1)取亚氯酸钠，加适量的表3中所列溶剂，搅拌使溶解，制成溶液；
(2)加入表3中所列pH调节剂调节溶液的pH值(如果使用离子交换树脂调节pH，则应在pH达到要求后过滤除去离子交换树脂)；
(3)加入过氧化氢作为抗氧剂；
(4)搅拌均匀使成透明溶液；
(5)分装于避光容器中。
表3.实施例1-3的配方组成
性能试验
1.对金属的腐蚀性试验
参照消毒技术规范(2008年)，以碳钢、不锈钢、铜与铝为试验对象，测试了本发明的杀孢子剂(实施例1和实施例2)对金属的腐蚀性(试验前用纯化水稀释至500mg/L浓度亚氯酸钠)，同时与市场上销售的“稳定性二氧化氯消毒液”(使用前按使用说明书进行活化并用纯化水稀释至500mg/L浓度二氧化氯)进行对比，具体方法如下：
分别取碳钢、不锈钢、铜和铝，均制成直径为24±0.2mm，厚约1.0mm，
并有一约2.0mm直径小孔的圆片，试验时，磨去表面氧化层，经实测直径、厚度与孔径后，计算其表面积，再洗净并于50℃烘干1h。称取其质量后，浸泡于实验溶液中(按20ml/cm2用液量)，浸泡时，1种金属用1个容器，24h更换1次实验溶液。浸泡至72h，取出金属片，以蒸馏水冲洗干净，经50℃烘干1h。称取浸泡后金属片质量，据其质量损失计算腐蚀速率R(mm/a)。
[R为腐蚀速率，mm/a(毫米/年)；m为试验前金属片重量，g；mt为试验后金属片重量，g；mk为化学处理去除腐蚀产物样片失重值，g，试验中未进行化学清除处理者，计算时在公式中删去mk值；S为金属片的表面积总值，cm2；t为试验时间，h；d为金属材料密度，kg/m3。]
试验结果见表4所示。由表4可知，本发明杀孢子剂的腐蚀性明显低于市售的稳定性二氧化氯溶液。
表4.对金属的腐蚀性试验结果
2.空间灭菌试验及表面消毒试验
(1)空间灭菌试验方法及结果
取按表3实施例3配制的杀孢子剂进行空间灭菌试验，并同时与单一的亚氯酸钠溶液和过氧化氢溶液进行对比(对比例1和对比例2)，具体方法如下。
①主要实验材料
生物指示剂(嗜热脂肪芽孢杆菌孢子，孢子量分别为103和106CFU/片，含同一批号生物指示剂专用培养液)和TSA，-1型低温汽化纳米雾发生器(武汉市纳米雾科技有限公司提供，雾化速度为15ml/min，可将消毒液雾化至1微米以下的小微粒)。
②试验车间
某制药企业生产车间，高2.8m，宽4.4m，长6.5m，空间总体积约80m3。试验前先将车间除湿、保持相对湿度在70％以下。
③试验方法
将纳米雾发生器放置在车间中间，车间四周布置孢子量分别为103和106CFU/片的生物指示剂各4片(共计8片)，布置的生物指示剂离地面的高度为1m，再加入测试的杀孢子剂或者溶液，密闭所有门窗，开机雾化10min后停机后静置2小时(约相当于雾化5ml/m3)，按无菌方法取出生物指示剂(芽孢条)，放入对应编号的嗜热脂肪芽孢培养液中(同时观察过氧化氢变色化学指示剂是否变色)，按照所购生物指示剂的使用说明书，置于恒温培养箱中，在55-60℃培养24小时后观察。同时取同批生物指示剂1片作阳性对照。经过24小时的培养，若培养液变浑浊，颜色由紫色变为黄色则判定为阳性；若培养液澄清，颜色不变色则为阴性；继续培养至第7天，如果培养液变为黄色，则判定为灭菌不合格；如果培养液仍为紫色，则判定为灭菌合格。
④实验结果
实验结果见表5所示。由表5可知，当雾化体积为5mL/m3，密闭时间为2小时，按表3实施例3配制的杀孢子剂可杀灭六个对数的芽孢，而单一的亚氯酸钠溶液和过氧化氢溶液(对比例1和对比例2)仅可杀灭三个对数的芽孢。由此说明本发明的杀孢子剂明显优于单一的亚氯酸钠溶液和过氧化氢溶液，亚氯酸钠溶液和过氧化氢溶液具有协同的消毒灭菌作用。
表5.不同杀孢子剂或者溶液对空间灭菌试验结果
注：4片指示剂培养后均为紫色，表示无菌生长标记为----；
4片指示培养后均为黄色，表示全部菌生长标记为++++；
4片指示2片为紫色2片为黄色，表示部分菌生长标记为++--。
(2)表面消毒试验方法及结果
①表面消毒试验方法
取按表3实施例3配制的杀孢子剂进行表面消毒试验：采用雾化的方法，用实施例5配制的杀孢子剂对80m3的空间进行纳米雾空间消毒，喷雾体积为5ml/m3，密闭时间为90min。消毒完毕后，采用无菌棉签擦拭灭菌后洁净区内各表面(4个墙面各2个点、地面随机选8个点)，每个点的擦拭面积为5╳5cm2，擦拭完后，用无菌手术剪刀把棉签的头部(棉花部位)剪断，投入装有50ml0.9％无菌氯化钠溶液的锥形瓶中，密闭。将装有样品的锥形瓶反复振摇，使棉签上的微生物释放到溶液中。取样品溶液50ml薄膜过滤，取出滤膜，菌面朝上，贴于TSA培养基上，30-35度培养5天，计数并与灭菌前的检测结果进行对比。
②表面消毒试验结果
结果见表6所示，由表6可知：当雾化体积为5ml/m3，密闭时间为90分钟时，本发明的杀孢子剂不仅可用于空间灭菌，还可用于物体表面进行消毒，消毒后，墙壁、地面和设备的表面微生物均符合GMP环境的要求。
表6灭菌前后微生物污染水平的比较
综上所述，按照本发明生产的的杀孢子剂不仅其消毒杀菌能力强于单一组分的亚氯酸盐或过氧化氢，而且明显提高了亚氯酸盐在酸性条件下的稳定性，由于不含有大量的强电解质，也降低了对金属物体的腐蚀性，比较好地解决了亚氯酸盐在酸性条件下不稳定的问题和消毒灭菌活性低的问题，同时也产生了1+1＞2的消毒杀菌效果，可广泛应用于各种物体表面和可密闭空间(如医院手术室、生产企业车间及隔离器、实验室和生物安全柜等)的消毒或灭菌。
此外，将保存12个月以后的本发明实施例1-3的杀孢子剂重复上述实验，实验结果表明,其消毒灭菌效果没有明显降低。由此说明所述杀孢子剂具有良好的稳定性，保质期长达1年以上。
如上所述，本发明仅仅是基于权利要求书，通过几个具体的实施例和实施方式进行解释，但本发明并不仅限于此。在权利要求书中记载的内容能够实施多种实施方式，任何本领域的技术人员能够想到的各种变化，都应落在本申请的保护范围内。