一种产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态显微观察方法与流程

本发明涉及一种产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态显微观察方法，属于鱼类形态学观察领域。

背景技术：

产漂流性卵的鱼类广泛分布内陆江河水系，通过对其鱼卵、仔鱼活体摄影是研究鱼类早期生活史一项重要手段。通过固定液固定保存鱼卵和仔鱼来观察其形态发育情况是目前常用的方法，该方法存在观察、拍照效果不佳问题，还存在需要经常更换固定液，步骤复杂，在存、取过程中容易破坏标本结构，固定液刺激性气味大等问题。漂流性鱼卵受精卵通体透明、可直接在解剖镜下观察胚胎发育情况。但因存在漂流性鱼卵因胚胎较小、卵膜过大，受精卵悬浮水中、胚胎悬浮于卵膜内而造成的双双流动，不易寻找最佳拍摄角度；其次胚胎发育至肌肉效应期后，因胚胎活动，部分组织常贴于内膜壁，不易获取完整胚胎影像；活体仔鱼极易多动，不易定格画面捕捉发育细节等问题。

因此，亟需设计一种产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态显微观察方法。

技术实现要素：

本发明针对产漂流性鱼卵鱼类早期发育过程中因漂流性鱼卵因胚胎较小、卵膜过大，受精卵悬浮水中、胚胎悬浮于卵膜内而造成的双双流动，不易寻找最佳拍摄角度；其次胚胎发育至肌肉效应期后，胚胎缩于卵膜内，不易获取完整胚胎影像；活体仔鱼极易多动，不易定格画面捕捉发育细节等问题而设计的一种产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态显微观察方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态显微观察方法，其特征在于：

由鱼卵受精后至尾芽期间发育形态观察方法、肌肉效应期至出膜前期间发育形态观察方法及出膜后仔鱼发育形态观察方法组成；

所述鱼卵受精后至尾芽期间发育形态观察方法为：

（1）用吸管或小汤勺取受精后至尾芽期间鱼卵一粒，放至干净、干燥的培养皿中央区域；

（2）用干燥小型长条状海绵吸尽鱼卵与培养皿接触间的水分，使鱼卵能稳固在培养皿上；

（3）将上述置有鱼卵的培养皿放在解剖镜物镜下，用干燥小型长条状海绵拨动鱼卵至所需要观察或拍摄角度；

（4）调节解剖镜，获取观察或拍照画面；进一步地5分钟内完成观察或拍照；

所述小型长条状海绵端口面积不超过0.1cm²。

所述肌肉效应期至出膜前期间阶段发育形态观察方法为：

（1）用吸管或小汤勺取肌肉效应期至出膜前期阶段的鱼卵一粒，放至干净、干燥培养皿中央区域；

（2）用干燥小型长条状海绵吸尽鱼卵与培养皿接触间的水分，使鱼卵能稳固在培养皿上；所述小型长条状海绵端口面积不超过0.1cm²。

（3）将上述置有鱼卵的培养皿放在解剖镜物镜下，调节解剖镜观察显微倍数，采用线针分别从鱼卵左右侧相向刺破鱼卵膜，刺破点的垂直高度为鱼卵与培养皿接触3/4处；所述线针的长度为3-5cm；

（4）待胚胎流出膜后，用滴管滴0.1-0.2ml生理盐水至胚胎上；

（5）用10ml注射器沿将胚胎外围液体抽取，直至注射器针头吸住卵膜，移除卵膜，若液体抽干还未吸住卵膜，再用滴管添加0.1-0.2ml生理盐水、再次抽取，可反复几次，直至注射器针头吸住卵膜，移除卵膜；

（6）用10ml注射器往去膜胚胎上滴下0.05-0.1ml50%浓度的乙醇，静置1-2分钟后，再用10ml注射器往去膜胚胎上滴下0.04-0.05ml50%浓度的乙醇，静置1-2分钟；

（7）控制0.1-0.2ml液体覆盖胚胎，所述控制方法为：若液体较多时用10ml注射器吸取多余液体，若液体不足时用生理盐水补充；

（8）移动培养皿至胚胎位于解剖镜观察视野内，调节解剖镜倍数，获取观察或拍照画面；进一步地5分钟内完成观察或拍照。

所述出膜后仔鱼发育形态观察方法为：

（1）用吸管或小汤勺取仔鱼一尾，放至干净、干燥的培养皿中央区域；

（2）用10ml注射器添加或吸取控制仔鱼与培养皿接触部分水分不超过1ml；

（3）用10ml注射器在仔鱼周围滴下0.05-0.1ml90%浓度的乙醇，静置2-3分钟后，再用10ml注射器在仔鱼周围滴下0.05-0.1ml50%浓度的乙醇，静置3-4分钟；

（4）控制0.3-0.4ml液体覆盖仔鱼；所述控制法为：若液体较多时用10ml注射器吸取多余液体，若液体不足时用生理盐水补充；

（5）移动培养皿至仔鱼位于解剖镜观察视野内，调节解剖镜倍数，获取观察或拍照画面，进一步地5分钟内完成观察或拍照；若仔鱼眼晶体反光，用10ml注射器向仔鱼眼上滴下0.04-0.1ml生理盐水，静置1分钟，调节解剖镜倍数，获取观察或拍照画面，进一步地5分钟内完成观察或拍照。

有益效果：

1、本发明方法可解决因漂流性鱼鱼卵受精后至尾芽期间因胚胎较小、卵膜过大，受精卵悬浮水中、胚胎悬浮于卵膜内双双流动，不易寻找最佳拍摄角度问题；其次解决肌肉效应期至出膜前期间，胚胎缩于卵膜内，且易翻动，不易获取完整胚胎影像问题；最后是解决出膜后仔鱼极易多动，无法定格拍照画面问题。实践证明，本发明方法用于漂流性鱼卵或仔鱼显微观察、拍照，角度可调、胚胎发育画面易捕捉，且仔鱼极少脱色、脱水、拍摄效果鲜活、细节完整。

2、与一般采用固定液保存观察法相比，本发明方法可清楚的观察到鱼卵胚胎的胚环、胚盾、眼囊、耳囊、眼晶体、耳石是否出现；胚孔是否闭合；肌节是否形成；肌肉是否开始收缩等细节；仔鱼的鳍褶、色素、肠、肛门、血管开始出现；鳔几室、肌节数等细节。而采用固定液保存观察法样品整体会脱色严重，很多细节无法观察清楚，且在存、取过程易导致样品损坏，无法保证样品完整性。

3、本发明针对不同的发育阶段特点采用不同的显微观察处理方法，不会导致样品的脱水、脱色情况，可以清晰直观观察到产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态细节变化，可为区分鱼的种类或判断早期发育具体时期的提供重要依据。

4、本发明肌肉效应期至出膜前期阶段发育形态观察方法中去膜过程中，通过使用线针分别从受精卵左右侧相向刺破鱼卵膜，且控制刺破点的高度，可有效完整的将鱼卵膜去除，使胚胎完整展现出来，可清晰观察并获取整个胚胎发育形态；

5、肌肉效应期至出膜前期阶段及出膜后仔鱼阶段通过大量的摸索，使用50%浓度的乙醇和90%浓度的乙醇对样品进行处理，同时确定使用剂量及作用时间，能有效避免胚胎或仔鱼挣扎变形或脱水脱色，保证了胚胎或仔鱼保持自然形态，极大地提高了观察的准确性，使得观察结果更真实地反映胚胎或仔鱼发育的原本形态。

说明书附图

图1为吻鮈胚孔封闭期胚胎发育形态图；

图2为不同观察方法下吻鮈心脏搏动期胚胎发育形态图；

图3为采用不同方法观察鳜仔鱼期发育形态图；

图4为采用不同方法观察鳊仔鱼期发育形态图。

具体实施例

实施例1

一种产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态显微观察方法，以胚孔封闭期吻鮈鱼卵为例，其观察方法如下：

（1）用吸管或小汤勺取胚孔封闭期吻鮈鱼卵一粒，放至干净、干燥的培养皿中央区域；

（2）用干燥小型长条状海绵吸尽鱼卵与培养皿接触间的水分，使鱼卵能稳固在培养皿上；

（3）将上述置有鱼卵的培养皿放在解剖镜物镜下，用干燥小型长条状海绵拨动鱼卵至所需要观察或拍摄角度；

（4）调节解剖镜，获取观察或拍照画面，进一步地5分钟内完成观察或拍照；

所述小型长条状海绵端口面积不超过0.1cm²。

实施例2

一种产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态显微观察方法，以心脏搏动期吻鮈鱼卵为例，其观察方法如下：

（1）用吸管或小汤勺取心脏搏动期吻鮈鱼卵一粒，放至干净、干燥培养皿中央区域；

（2）用干燥小型长条状海绵吸尽鱼卵与培养皿接触间的水分，使鱼卵能稳固在培养皿上；所述小型长条状海绵端口面积不超过0.1cm²。

（3）将上述置有鱼卵的培养皿放在解剖镜物镜下，调节解剖镜观察显微倍数，采用线针分别从鱼卵左右侧相向刺破鱼卵膜，刺破点的垂直高度为鱼卵与培养皿接触3/4处；所述线针的长度为3cm；

（4）待胚胎流出膜后，用滴管滴0.15ml生理盐水至胚胎上；

（5）用10ml注射器沿将胚胎外围液体抽取，直至注射器针头吸住卵膜，移除卵膜，若液体抽干还未吸住卵膜，再用滴管添加0.15ml生理盐水、再次抽取，可反复几次，直至注射器针头吸住卵膜，移除卵膜；

（6）用10ml注射器往去膜胚胎上滴下0.08ml50%浓度的乙醇，静置1分钟后，再用10ml注射器往去膜胚胎上滴下0.04ml50%浓度的乙醇，静置1分钟；

（7）控制0.15ml液体覆盖胚胎，所述控制方法为：若液体较多时用10ml注射器吸取多余液体，若液体不足时用生理盐水补充；

（8）移动培养皿至胚胎位于解剖镜观察视野内，调节解剖镜倍数，获取观察或拍照画面，进一步地5分钟内完成观察或拍照。

实施例3

一种产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态显微观察方法，以鳜仔鱼为例，其观察方法如下：

（1）用吸管或小汤勺取鳜仔鱼一尾，放至干净、干燥的培养皿中央区域；

（2）用10ml注射器添加或吸取控制仔鱼与培养皿接触部分水分为0.5ml；

（3）用10ml注射器在仔鱼周围滴下0.08ml90%浓度的乙醇，静置2分钟后，再用10ml注射器在仔鱼周围滴下0.08ml50%浓度的乙醇，静置3分钟；

（4）控制0.35ml液体覆盖仔鱼；所述控制法为：10ml注射器吸取多余液体；

（5）移动培养皿至仔鱼位于解剖镜观察视野内，调节解剖镜倍数，获取观察或拍照画面，进一步地5分钟内完成观察或拍照；若仔鱼眼晶体反光，用10ml注射器向仔鱼眼上滴下0.07ml生理盐水，静置1分钟，调节解剖镜倍数，获取观察或拍照画面，进一步地5分钟内完成观察或拍照。

实施例4

一种产漂流性卵鱼类早期不同发育阶段形态显微观察方法，以鳊仔鱼为例，其观察方法如下：

（1）用吸管或小汤勺取鳊仔鱼一尾，放至干净、干燥的培养皿中央区域；

（2）用10ml注射器添加或吸取控制仔鱼与培养皿接触部分水分0.3ml；

（3）用10ml注射器在仔鱼周围滴下0.05ml90%浓度的乙醇，静置2.5分钟后，再用10ml注射器在仔鱼周围滴下0.06ml50%浓度的乙醇，静置3分钟；

（4）控制0.3ml液体覆盖仔鱼；所述控制法为：用10ml注射器吸取多余液体；

（5）移动培养皿，至仔鱼位于解剖镜观察视野内，调节解剖镜倍数，获取观察或拍照画面，进一步地5分钟内完成观察或拍照；若仔鱼眼晶体反光，用10ml注射器向仔鱼眼上滴下0.06ml生理盐水，静置1分钟，调节解剖镜倍数，获取观察或拍照画面，进一步地5分钟内完成观察或拍照。

具体实验效果：

图1为实施例1观察方法的吻鮈鱼卵的显微观察拍照图，胚胎发育胚孔封闭期，神经管形成。

图2为实施例2观察方法的吻鮈鱼卵的显微观察拍照图，胚胎发育进入心脏搏动期，心脏原基出现，心脏开始搏动，眼囊耳囊清晰可见，在耳囊内出现耳石，此时肌节约32对；

常规方法显微观察拍照图，通过胚胎已能够在膜内大幅度移动位置这一经验，能大致判断发育进入心脏搏动期，但胚胎头部、尾部细节未能观察到。由于没有去膜固定，即使偶尔发现胚胎头部、尾部移动到观察视野内，也是一闪而过，具体细节无法捕捉，不能做出很好判断和观察。

图3为实施例3观察方法的鳜仔鱼的显微观察拍照图，颌齿出现时，前后鳃盖骨分界明显，鳃盖上出现棘，胸鳍硬棘形成，尾静脉处出现一列星状黑色素；

采用甲醛固定方法（常规方法）鳜仔鱼显微观察拍照图，整体脱色严重，无法观察有无颌齿，前后鳃盖分界不明显，无法判断鳃盖、胸鳍的棘是否形成。

图4为实施例3观察方法的鳊仔鱼的显微观察拍照图，体修长，鳔两室清晰可见，心脏部位呈鲜红色，背鳍褶稍隆起，开始分化，体侧下部自鳔沿肠管至尾褶后部色素呈青筋一条，尾褶下部亦有一大色素花，尾部肌节20。

采用甲醛固定方法（常规方法）鳊仔鱼显微观察拍照图，仔鱼因存、取过程已损坏尾部，鳔仅一室可见，仔鱼脱色严重，不易观察到体侧下部自鳔沿肠管至尾褶后部色素所呈青筋一条，肌节不易数清。