一种保藏秀丽隐杆线虫的方法与流程

本发明涉及生物技术领域中的实验用秀丽隐杆线虫保藏方法，尤其是在实验场所无法提供传统保存方法中的-80℃保藏条件、且一般性的4-15度低温保存的线虫其活性往往大为降低时，给长期保存线虫提供了一种新的可能。

背景技术

秀丽隐杆线虫caenorhabditiselegans，属于线形动物门、线虫纲动物，是一种非寄生性线虫，身体透明，长度约1毫米，主要分布在温带地区的土壤中。其细胞数量不多、功能也不复杂、身体透明，是研究生物学理想的模式动物。秀丽隐杆线虫广泛应用于细胞发育及分化、神经系统、衰老机制以及遗传学等领域的研究，故需要有大量纯化的个体并予以长期保存。传统的长期保藏方法均需要提供-80℃的冷藏条件，操作过程中亦需要购置特制昂贵的冷藏盒，实验耗材、试剂准备过程繁琐复杂，且线虫复苏阶段耗费时间长、成活率经常很低。总之，传统的秀丽隐杆线虫长期保藏方法耗时耗力，要求条件苛刻，复苏时间长且成活率低，其综合保藏复苏效果对专业水平不高的实验室往往带来很大的挑战。

通常状况下，线虫可以在4℃冰箱中通过ngm培养基短期保存。ngm培养基上生长有e.coliop50菌种，封口后倒置存放于4℃冰箱。该条件下可以保存线虫2-3个月。复苏时将含有一定数量线虫的ngm培养基切块放置于新鲜制备的ngm培养基上，使得线虫重新复苏生长。

限制上述保存时间仅为2-3个月的因素之一在于，e.coliop50菌种在4℃时仍会继续生长，逐步耗尽所有的营养物质，然后自身开始死亡和裂解，无法进一步为线虫提供合适的食物和能源。如果能够使得e.coliop50菌种在上述ngm板上的存活时间进一步延长，就能够进一步延长线虫的保存时间。本发明就是通过在ngm培养板上以特定的方式补充e.coliop50菌种液体培养基的方法延长ngm培养板上菌种的存活期限，继而进一步延长线虫的保存期限，或者说，在相同的保存期限内，使用本方法获得的线虫其活性更好。

技术实现要素：

本发明目的在于克服传统的保藏实验用秀丽隐杆线虫方法的不足，采用一种固/液混合态的培养基培养秀丽隐杆线虫达到长期保藏秀丽隐杆线虫的目的。

本发明是基于不具备-80℃条件下，一种简易有效的长期保藏实验用秀丽隐杆线虫的方法。本方法保藏实验用秀丽隐杆线虫周期至少可达半年，且复活率高。但如需更为长期或永久保藏秀丽隐杆线虫，需每隔半年重复本发明操作，或改用传统保藏方式。故本方法适用场所为秀丽隐杆线虫种类少于数百种的实验与研发场所，不适用于以保藏秀丽隐杆线虫为目的的线虫库及保藏组织。

本发明提供了一种简易有效的长期保藏实验用秀丽隐杆线虫的方法，包括以下步骤：

(1)保藏用培养基的配方：ngm固体培养基(100ml)：胰蛋白胨0.25g，nacl0.3g，琼脂粉1.7g，超净水97.5ml，1mol/l氯化钙0.1ml，1mol/l硫酸镁0.1ml，5mg/l胆固醇0.1ml,1mol/l偏磷酸钾缓冲液2.2ml。121℃灭菌20min。lb液体培养基(100ml)：胰蛋白胨1g，酵母粉0.5g，nacl1g，超净水100ml。121℃灭菌20min。

(2)将e.coliop50菌种置于ngm固体培养基上进行平板涂布，37℃恒温培养16h。

(3)保藏用固/液混合态培养基的制备：将制好的ngm固体培养基四等分成四个扇形区域，并选择一个区域进行打碎操作，取走四分之一的培养基碎屑，将lb液体培养基倒入原培养基缺口中，并保持页面低于培养基平面。

(4)保藏秀丽隐杆线虫的选取：选取饥饿状态下l1、l2期秀丽隐杆线虫比较多的培养皿，挑取十数只l1、l2期秀丽隐杆线虫置于固/液混合态培养基中。

(5)使用封口膜小心密封培养皿，置于4℃冰箱长久保存。放置时要求培养皿倾斜10-15度，且培养基缺口处于低位，培养基其他部分处于高位。这样做的好处是培养皿盖顶部产生的冷凝水会自动落入缺口中，不致于落到ngm培养基的线虫上面。

(6)保藏状态下秀丽隐杆线虫的复苏：使用移液枪吸取适量常温无菌水打入固/液混合态培养基，可使保藏状态下秀丽隐杆线虫瞬间激活。用移液枪吸入少量固/液混合态培养基中含有线虫的保藏液，置于培养线虫所用固体培养基即可。

本发明的优点和有益效果是：

1.传统的长期保藏方法均需要提供-80℃的冷藏条件，操作过程中亦需要购置特制的冷藏盒，操作繁琐复杂且成功率较低。而本发明所提供的保藏方法只需使用实验室常用的4℃冰箱即可达到长期保藏线虫的目的，操作过程中亦不需要提供特殊的保藏设施，使用正常培养皿即可达到理想效果。

2.传统的长期保藏方法实验耗材、试剂准备过程繁琐：实验过程中需要单独配制s缓冲液(提供与秀丽隐杆线虫相近的渗透压)与琼脂保护液。而本发明所提供的保藏方法只需将正常实验过程中所使用的ngm固体培养基稍加改进，无需添加额外的试剂与装置，真正达到了保藏的高效简易性。

3.传统的4度冰箱长期保藏方法线虫复苏时间长且成活率低，线虫的复活率很容易低于20％，刚复活的线虫其生理活性明显不高，需要一段时间的反复培养。而本实验方法可以达到瞬间复苏且成活率近似100％。

附图说明

图1线虫保藏用固/液混合态培养基模型图。

具体实施方式

以下通过以n2野生型线虫的长期保藏为例，对本发明进一步详述，但本发明不局限于下述实施例。

(1)实施例1配制保藏用培养基

ngm固体培养基(100ml)：胰蛋白胨0.25g，nacl0.3g，琼脂粉1.7g，超净水97.5ml，1mol/l氯化钙0.1ml，1mol/l硫酸镁0.1ml，5mg/l胆固醇0.1ml,1mol/l偏磷酸钾缓冲液2.2ml，置于100ml锥形瓶中，添加超纯水置100ml刻度线。混合均匀后置于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min。lb液体培养基(100ml)：称取胰蛋白胨1g、酵母粉0.5g、nacl1g置于100ml锥形瓶中，添加超纯水置100ml刻度线。混合均匀后置于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min。

(2)实施例2涂布e.coliop50

将放置于37℃下120rpm振荡培养的e.coliop50菌种置于lb固体培养基上进行平板涂布，放入37℃恒温培养箱中，倒置过夜培养。将涂好菌的培养基倒置，放于4℃冰箱中保存。

(3)实施例3保藏用固/液混合态培养基的制备

将涂布完成的ngm固体培养基四等分成四个扇形区域，并选择一个区域进行打碎操作，取走四分之一的培养基碎屑，将lb液体培养基倒入原培养基缺口中，并保持液面低于培养基平面。

(4)实施例4保藏用秀丽隐杆线虫的选取

选取饥饿状态下l1、l2期秀丽隐杆线虫比较多的培养皿，挑取十数只l1、l2期秀丽隐杆线虫置于已加入lb液体培养基的ngm固体培养基缺口中。使用封口膜小心密封培养皿，置于4℃冰箱长久保存。

(5)实施例5保持培养体系

在种群生态学中，最高环境容纳量(简称"环境容纳量"、k值)是指特定环境所能容许的种群数量的最大值。本发明方法所构建的固/液混合态培养基生态体系可以保证s2区域e.coliop50繁殖基本不受秀丽隐杆线虫干扰且更适合于秀丽隐杆线虫的生长，并源源不断地向s1区域缓慢的注入e.coliop50为秀丽隐杆线虫提供食物。这使得整个培养体系维持在一个较低的k值下，所有l1期秀丽隐杆线虫都将转化为抗逆状态下的dauer态，故而极大地延长了保藏周期，如此保存6个月以后多数线虫的活性仍然与刚开始保存时差别不大。

(6)实施例6保藏状态下秀丽隐杆线虫的复苏操作

使用移液枪吸取适量常温无菌水打入ngm固体培养基s2区域，可使保藏状态下秀丽隐杆线虫瞬间激活，于显微镜下可观察到数以千计的活跃状态下的秀丽隐杆线虫幼虫。用移液枪吸入少量含有线虫的保藏液，置于培养线虫所用固体培养基即可完成整个复苏操作。