一种建立稳定的次级共生菌人工转染蚜虫种群的方法与流程

本发明涉及一种建立稳定的次级共生菌人工转染蚜虫种群的方法。

背景技术

麦长管蚜(sitobionavenaefabricius)属半翅目hmioptera，蚜科aphidinea，长管蚜属sitobion，主要分布于亚洲、东非、欧洲、北美等地区，在我国则遍及各产麦区，局部地区危害严重。寄主范围广泛，主要危害小麦、大麦、燕麦，偶尔为害高粱、玉米和水稻。麦长管蚜主要以取食植物叶片为害为主，产生的蜜露能诱发煤污病，同时是传播植物病毒的载体，对我国小麦产量和质量造成了重大的影响。

昆虫与内共生菌的互作关系在自然界普遍存在,几乎所有昆虫都含有内共生菌。在长期的协同进化过程中,昆虫与其体内共生菌形成了密切的互利共生关系，昆虫为共生菌提供稳定的小生境并共享某些代谢途径，而内共生菌不仅能为宿主昆虫提供多种必需营养物质，抵御病原微生物侵染，降低宿主被寄生性天敌寄生的风险，还通过调节宿主耐热性和抗药性、改变体色等途径提高昆虫对环境的适合度。因此，内共生菌被认为是调控宿主昆虫新陈代谢及生物学性状的重要因子之一。

研究表明，昆虫内共生菌可分为初级共生菌和次级共生菌，初级共生菌主要局限于特化的含菌细胞中，而次级共生菌因其发生概率低很难寄生在宿主昆虫专一组织中，例如蚜虫次级共生菌分布于菌胞周围的鞘细胞和次级菌胞中，或分散或聚集于血腔中。相关研究表明，蚜虫次级共生菌在提高宿主蚜虫适应性上具有重要作用。然而这类共生菌很难从蚜虫体内分离出来。同时，由于不能体外培养，导致对这类共生菌的功能研究只能以蚜虫为载体，这样就大大增加了研究难度。面对该瓶颈问题，相关研究人员主要通过显微注射来达到获得感染某种次级共生菌的目的，但由于蚜虫微小、体璧柔软同时组织液多，因此通过显微注射导致的机械损伤容易造成高死亡率，同时感染率也具有不稳定性。而且，使用显微注射的方法操作难度较大，对操作条件包括针头的粗细程度和注射量的多少也需要不断摸索，同时获得转染蚜虫种群的时间周期也具有不稳定性。

技术实现要素：

鉴于常规使用显微注射的方法获得人工转染蚜虫种群的方法存在众多弊端，而且不能稳定的获得转染的蚜虫种群，这样会加大对蚜虫内共生菌功能验证的难度。针对这一瓶颈问题，本发明提供了一种建立稳定的次级共生菌人工转染蚜虫种群的方法。

本发明首先提供了一种感染靶标次级共生菌的蚜虫种群的构建方法(方法a)，包括如下步骤：

(1)采用含有所述靶标次级共生菌的寄主植物饲喂蚜虫种群；

(2)完成步骤(1)后，选取单头蚜虫构建单性系种群；

(3)完成步骤(2)后，筛选得到感染靶标次级共生菌的蚜虫种群。

所述步骤(1)中，所述蚜虫种群为未感染靶标次级共生菌的蚜虫种群。

所述“未感染靶标次级共生菌的蚜虫种群”的制备方法(方法b)如下：选取单头蚜虫构建单性系种群，筛选得到未感染靶标次级共生菌的蚜虫种群。

所述“未感染靶标次级共生菌的蚜虫种群”的鉴定方法包括如下步骤：检测该种群中任意n头蚜虫基因组dna中是否含有所述次级共生菌的特异片段，如果n头蚜虫基因组dna中均不含有所述次级共生菌的特异片段，则所述蚜虫种群为未感染靶标次级共生菌的蚜虫种群。n可为任意自然数，具体可为10。

所述“检测该种群中任意n头蚜虫基因组dna中是否含有所述次级共生菌的特异片段”具体可通过pcr检测实现。

所述步骤(1)中，蚜虫选取3至4龄若蚜。

所述步骤(1)中，所述饲喂时间为17±2天。

所述步骤(1)中，含有所述靶标次级共生菌的寄主植物的鉴定方法包括如下步骤：检测所述寄主植物基因组dna中是否含有所述次级共生菌的特异片段，如果含有所述次级共生菌的特异片段，则寄主植物含有所述靶标次级共生菌，如果不含有所述次级共生菌的特异片段，则寄主植物不含有所述靶标次级共生菌。

所述“检测所述寄主植物基因组dna中是否含有所述次级共生菌的特异片段”具体可通过pcr检测和/或原位杂交检测实现。

所述步骤(1)中，含有所述靶标次级共生菌的寄主植物的获得方法如下：采用寄主植物饲喂感染靶标次级共生菌的蚜虫种群，获得含有所述靶标次级共生菌的寄主植物。所述饲喂时间具体可为48h。所述蚜虫为新生成蚜。

所述步骤(3)中，“感染靶标次级共生菌的蚜虫种群”的鉴定方法包括如下步骤：检测该种群中任意n头蚜虫基因组dna中是否含有所述次级共生菌的特异片段，如果n头蚜虫基因组dna中均含有所述次级共生菌的特异片段，则所述蚜虫种群为感染靶标次级共生菌的蚜虫种群。n可为任意自然数，具体可为10。

所述“检测该种群中任意n头蚜虫基因组dna中是否含有所述次级共生菌的特异片段”具体可通过pcr检测实现。

以上任一所述靶标次级共生菌具体可为hamiltonelladefensa。

以上任一所述蚜虫具体可为麦长管蚜。

以上任一所述寄主植物具体可为小麦苗。

以上任一所述方法中，当所述靶标次级共生菌具体可为hamiltonelladefensa时，所述次级共生菌的特异片段具体可为如下(a)或(b)；

(a)序列表的序列1所示的dna分子；

(b)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子。

以上任一所述方法中，当所述靶标次级共生菌具体可为hamiltonelladefensa时，以上任一所述利用pcr检测“所述寄主植物或蚜虫基因组dna中是否含有所述次级共生菌的特异片段”的方法具体如下：以寄主植物或蚜虫的基因组dna为模板，采用引物f和引物r组成的引物对进行pcr扩增，根据结果进行判断：如果能够得到1200-1800bp的片段，且将该片段回收后进行测序，测序结果在ncbi上进行序列比对，结果显示该片段是所述次级共生菌的特异片段，则所述寄主植物或蚜虫的基因组dna中含有所述次级共生菌的特异片段；如果未获得1200-1800bp的片段或得到的片段经测序不是所述次级共生菌的特异片段，则所述寄主植物或蚜虫的基因组dna中不含有所述次级共生菌的特异片段。

以上任一所述方法中，当所述靶标次级共生菌具体可为hamiltonelladefensa时，以上任一所述原位杂交检测采用的特异探针如序列表的序列4所示，探针5’-端采用cy3修饰。

以上任一所述蚜虫的饲养条件具体可为光照白天16h/黑夜8h，相对湿度为70％～75％。

以上任一所述引物f为如下(a1)或(a2)；

(a1)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子。

所述引物r为如下(a3)或(a4)；

(a3)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子。

本发明还保护一种研究某种蚜虫次级共生菌对蚜虫的作用的方法，包括如下步骤：构建两个蚜虫种群，种群a和种群b；通过比较种群a和种群b中蚜虫的差异，获得靶标次级共生菌对蚜虫的作用；

种群a为未感染靶标次级共生菌的蚜虫种群；

种群b为采用以上任一所述方法a制备的感染靶标次级共生菌的蚜虫种群。

本发明还保护一种研究某种蚜虫次级共生菌与蚜虫相互关系的方法，包括如下步骤：构建两个蚜虫种群，种群a和种群b；通过比较种群a和种群b中蚜虫的差异，获得靶标次级共生菌对蚜虫的作用；

种群a为未感染靶标次级共生菌的蚜虫种群；

种群b为采用以上任一所述方法a制备的感染靶标次级共生菌的蚜虫种群。

以上任一所述种群a具体可为所述方法b制备的蚜虫种群。

根据本发明的技术方案，利用感染hamiltonella菌的植物叶片人工转染不含hamiltonella菌的蚜虫种群，通过pcr和原位杂交的方法进行验证，可以准确获得与不含hamiltonella菌的蚜虫遗传背景一致的人工转染的hamiltonella菌的蚜虫种群，从而为研究hamiltonella菌对蚜虫的影响提供材料基础。以前为了研究共生菌的功能，主要是通过显微注射法，用注射针管吸取含有某种共生菌的蚜虫组织液注射到不含有某种共生菌的蚜虫种群体内，达到人工转染的目的。但是由于操作难度大，注射后产生的机械损伤导致高死亡率，同时感染率不稳定性使获得可供研究的蚜虫种群具有一定困难。本发明在通过简单的操作过程即可获得稳定的人工转染蚜虫种群同时排除机械损伤对蚜虫造成的影响。

附图说明

图1为麦长管蚜饲养示意图。

图2为小麦苗叶片是否感染hamiltonella菌的电泳检测结果。

图3为原位杂交检测结果。

图4为麦长管蚜中是否含有hamiltonella菌的电泳检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中的hamiltonella菌全称为hamiltonelladefensa，是半翅目昆虫体内存在的一种次生共生细菌。

实施例中使用的引物对信息如下：

f(序列表的序列2)：agcacagtttactgagttca(5’-3’)；

r(序列表的序列3)：tacggytaccttgttacgactt(5’-3’)。

实施例中麦长管蚜基因组dna或小麦苗叶片基因组dna提取方法如下：

(1)麦长管蚜：挑取单头成蚜于国产1.5ml离心管中，利用手动研磨器在液氮中研磨充分，加入100μl裂解液充分匀浆；小麦苗叶片：小麦苗叶片取2cm左右剪碎后研磨充分，加入400μl裂解液充分匀浆。

裂解液：10mla液+20mlb液+0.585gnacl+1gsds，蒸馏水定容至100ml。

a液：1mtris-hcl溶液(ph＝7.6)。

b液：0.5medta溶液(ph＝8.0)。

(2)完成步骤(1)后，将匀浆液65℃加热40min(每隔10min剧烈摇晃离心管一次)。

(3)完成步骤(2)后，加入裂解液体积一半的3m醋酸钾溶液(单头蚜虫50μl，小麦苗叶片200μl)，剧烈摇晃充分混匀，静止5min后于12000转的低温离心机上离心20min。

(4)完成步骤(2)后，吸取上清液与1.5ml离心管中(不需顾虑是否吸到杂质)，再次12000转的低温离心机上离心10min后，再次取上清(此时尽量不要吸到杂质)，加入等体积的异丙醇混匀后放置-80℃冰箱中冷藏1～2h。

(5)完成步骤(4)后，于12000转的低温离心机上离心20min，小心倒出上清液，加入500ml75％(体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀后，晾干，加入20μl去离子水，得到dna溶液。

实施例1、共生菌人工转染蚜虫种群的方法建立

1、从云南省玉溪市易门县小麦田中采集麦长管蚜若干头，每一头成蚜饲养在养虫笼中建立单性系种群，待其产蚜，等到种群数量足够时，筛选含有hamiltonella菌的麦长管蚜的种群，筛选方式如下：

从单性系种群中选取10头麦长管蚜，提取单头麦长管蚜基因组dna，以基因组dna为模板，采用引物f和引物r组成的引物对进行pcr扩增，得到的pcr产物进行凝胶电泳鉴定，如果能够得到1500bp左右的片段，且将片段回收后进行测序得到的测序结果(序列表的序列1)在ncbi上进行序列比对，结果显示该片段是hamiltonella菌的特异片段，则检测该麦长管蚜为含有hamiltonella菌的麦长管蚜，若10头均感染hamiltonella菌，则单性系种群的为含有hamiltonella菌的麦长管蚜单性系种群(该种群中的麦长管蚜均感染hamiltonella菌)。

pcr反应体系：2xtranspcrmix为10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板为2μl，灭菌水6ul；pcr反应程序：94℃4min，94℃30s，60℃45s，72℃1min，共35个循环，最后72℃10min延伸，扩增产物4℃保存。

2、饲养步骤1筛选得到的含有hamiltonella菌的麦长管蚜单性系种群，饲养条件为：光照白天16h/黑夜8h，相对湿度为70％～75％。待种群量相对较大时，选取若干四龄若蚜于含有小麦苗的培养皿中继续在相同条件下饲养24h。

2、完成步骤1后，挑取10～15头新生成蚜于生态盒中，接于高10cm左右的盆栽小麦苗上放入养虫笼中(如图1a和b)饲养48h，饲养条件为：光照白天16h/黑夜8h，相对湿度为70％～75％。

3、完成步骤2后，去除所有蚜虫，剪下部分被取食后的小麦苗叶片，筛选被hamiltonella菌感染的小麦苗叶片，筛选方式如下：

提取小麦苗叶片基因组dna，以基因组dna为模板，采用引物f和引物r组成的引物对进行pcr扩增，得到的pcr产物进行凝胶电泳鉴定，如果能够得到1500bp左右的片段，且将片段回收后进行测序得到的测序结果(序列表的序列1)在ncbi上进行序列比对，结果显示该片段是hamiltonella菌的特异片段，则小麦苗叶片为被hamiltonella菌感染的小麦苗叶片。

pcr反应体系：2xtranspcrmix为10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板为2μl，灭菌水6ul；pcr反应程序：94℃4min，94℃30s，60℃45s，72℃1min，共35个循环，最后72℃10min延伸，扩增产物4℃保存。

部分检测结果如图2所示。图2中，标注a的泳道为被hamiltonella菌感染的小麦苗叶片检测结果，标注b的泳道为未被hamiltonella菌感染的小麦苗叶片检测结果。

4、取1-2cm步骤3筛选得到的被hamiltonella菌感染的小麦苗叶片，进行原位杂交实验，根据hamiltonella菌的特异性荧光探针(序列表的序列4，5’-ccagattcccagactttactca-3’，5’-端采用cy3修饰)，利用共聚焦显微镜检测hamiltonella菌的感染情况及在叶片中的分布位置。

原位杂交实验步骤如下：

(1)取1-2cm步骤3筛选得到的被hamiltonella菌感染的小麦苗叶片，迅速放入装有1ml固定液的1.5ml离心管中固定10～12h。

(2)完成步骤(1)后，吸尽固定液，加入1ml预杂交液于42℃预杂交1h，重复三次。

(3)完成步骤(2)后，加入1ml含有100pmol/l特异性荧光探针的预杂交液，杂交12h。

(4)完成步骤(3)后，吸尽杂交液，加入清洗液(pbst)1ml，放置于脱色摇床中脱色30min，重复3次。

(5)完成步骤(4)后，将植物叶片夹出放于载玻片上，用镊子或解剖针将叶片切割成宽0.5cm、长1.0cm左右的小片段后加入抗荧光信号猝灭剂(solarbio，购买自北京睿恒均安科技有限公司)进行压片后，放置于激光共聚焦显微镜下在633nm下观察观察。

固定液：1体积份冰醋酸、3体积份无水乙醇和6体积份氯仿混合。

预杂交液：10％(体积百分比)sds，30％(体积百分比)去离子甲酰胺，1mtris-hcl(ph＝8.0)，5mnacl，其余为水。

结果如图3所示(图中荧光位置用圆圈圈出)，a为小麦叶片中的荧光信号，b为小麦叶片中荧光信号局部放大的图片。

5、从中国农业科学院植物保护研究所廊坊实验基地采集麦长管蚜，每一头成蚜饲养在养虫笼中建立单性系种群，待其产蚜，等到种群数量足够时，筛选不含有hamiltonella菌的麦长管蚜的种群，筛选方式如下：

从单性系种群中选取10头麦长管蚜，提取单头麦长管蚜基因组dna，以基因组dna为模板，采用引物f和引物r组成的引物对进行pcr扩增，得到的pcr产物进行凝胶电泳鉴定，如果不能够得到1500bp左右的片段，则检测的麦长管蚜为不含有hamiltonella菌的麦长管蚜，若10头均不感染hamiltonella菌，则单性系种群为不含有hamiltonella菌的麦长管蚜单性系种群(该种群中的麦长管蚜均不感染hamiltonella菌)。

pcr反应体系：2xtranspcrmix为10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板为2μl，灭菌水6ul；pcr反应程序：94℃4min，94℃30s，60℃45s，72℃1min，共35个循环，最后72℃10min延伸，扩增产物4℃保存。

6、采用步骤3和步骤4筛选得到的含有hamiltonella菌的小麦叶片饲喂步骤5筛选的不含有hamiltonella菌的麦长管蚜的种群(三～四龄若蚜)17±2天，饲养条件为：光照白天16h/黑夜8h，相对湿度为70％～75％。

7、完成步骤6后，将每一头成蚜饲养在养虫笼中建立单性系种群，待其产蚜，等到种群数量足够时，筛选含有hamiltonella菌的麦长管蚜的种群，检测方式如下：

从单性系种群中选取10头麦长管蚜，提取单头麦长管蚜基因组dna，以基因组dna为模板，采用引物f和引物r组成的引物对进行pcr扩增，得到的pcr产物进行凝胶电泳鉴定，如果能够得到1500bp左右的片段，且将片段回收后进行测序得到的测序结果(序列表的序列1)在ncbi上进行序列比对，结果显示该片段是hamiltonella菌的特异片段，则检测该麦长管蚜为含有hamiltonella菌的麦长管蚜，若10头均感染hamiltonella菌，则单性系种群的为含有hamiltonella菌的麦长管蚜单性系种群(该种群中的麦长管蚜均感染hamiltonella菌)。

pcr反应体系：2xtranspcrmix为10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板为2μl，灭菌水6ul；pcr反应程序：94℃4min，94℃30s，60℃45s，72℃1min，共35个循环，最后72℃10min延伸，扩增产物4℃保存。

结果如图4所示。图4中，标注a的泳道为含有hamiltonella菌的麦长管蚜检测结果，标注b的泳道为不含有hamiltonella菌的麦长管蚜检测结果。

通过鉴定，不含有hamiltonella菌的麦长管蚜经饲喂后感染了hamiltonella菌。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一种建立稳定的次级共生菌人工转染蚜虫种群的方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1302

<212>dna

<213>次级共生菌(hamiltonelladefensa)

<400>1

ctgctggaaacggcagctaataccgcatgaagtcgcgagaccaaagtgggggaccttcgg60

gcctcacgccttcggatgagcccagatgagattagctggtaggtaaggtaaaggcttacc120

taggcgacgatctctagcgggtctgagaggatagcccgccacactggaactgagacacgg180

tccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgc240

agccatgccacgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaa300

gcgataaatgcgaataccatttatttttgacgttactcgcagaagaagcaccggctaact360

ccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgta420

aagggcatgtaggcggtgagttaagtcagatgtgaaatccccgagctcaacttgggaatg480

gcatttgaaactgggtcgctagagttttctagaggggggtagaattccaggtgtagcggt540

gaaatgcgtagatatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggagaaagactg600

acgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctg660

taaacgatgtcgatttggaggttgcggtcttgaactgtggcgtccggagctaacgcgtta720

aatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggccc780

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gacatccacggaattgtgcagagatgcgcaagtgccttcgggaaccgtgagacaggtgct900

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tgctacaatggcgtatacaaagggatgcgaacctgcgagggaaagcggaactcagaaagt1140

acgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaat1200

cgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac1260

catgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccgcaa1302

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agcacagtttactgagttca20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccagattcccagactttactca22