本发明属于生物技术领域，具体涉及一种药用植物白云参的组织培养方法。
背景技术
白云参，又名土党参，为桔梗科金钱豹属草质缠绕藤本大花金钱豹(campanumoeajavanicabl.subsp.javanica)，主产于红河州和文山州大部分地区，生长在海拔400-1800米的向阳草坡或丛林中。白云参以根茎入药，味甘、微苦，性温，无毒，入肺、脾、肾三经。具有健脾胃、补肺气、祛痰止咳的功效。主治虚劳内伤、肺虚咳嗽、脾虚泄泻、乳汁不多、小儿疳积、遗尿症等，为贵州苗族习用药材。十九世纪三十年代毛灿文先生将白云参与草乌、三七、断节参等配伍，对风湿麻木、筋骨疼痛、跌打损伤、创伤流血有显著疗效。1936年正式以“七星虎力散”在云南注册出售，1958年，将“虎力散”名称进行批量生产。目前全国有11家制药企业以白云参为原料药生产相关制剂。由于长期采挖，白云参野生资源已严重不足，无法满足日益增长的生产需求。目前白云参少有人工种植，繁殖方式为种子繁殖，存在繁殖率低、生长期长等劣势，为解决白云参资源短缺问题，本实验开展了白云参组织培养技术研究，通过组培快繁大量生产组培苗以实现人工规模化种植。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种白云参的组织培养方法，具繁殖周期短、繁殖率高、生长周期短(较种子繁殖少一年种植周期)等优势，适合大面积种植，解决白云参野生资源短缺与保护的问题。
本发明所采用的技术方案是，一种白云参的组织培养方法，按照以下步骤进行：
(1)选择外植体：选择白云参带芽茎段为外植体，用洗洁精稀释液清洗茎段并在自来水下冲洗干净；
(2)消毒灭菌：将茎段转至超净工作台上，放入无菌瓶中，加入75％酒精消毒5-8s，无菌水洗1次，加入饱和漂白粉溶液消毒10-15min，无菌水洗2次，再用0.05％升汞溶液消毒7-10min，无菌水洗6次；
(3)丛生芽诱导：将消毒好的茎段放在无菌吸水纸上吸干表面水分，剪去茎段切口处褐化部分，接种至初代诱导培养基中培养，诱导丛生芽；所述初代诱导培养基为：wpm/ms+zt0.5-1.0mg/l+2,4-d0.05-0.1mg/l+糖25-30g/l+琼脂4.5-5g/l，ph为5.8-6.0；
(4)丛生芽增殖：将步骤(3)诱导出的嫩芽剪下，剪成1-2芽/段的大小，接种至增殖培养基中培养，诱导丛生芽增殖；所述增殖培养基为：wpm/ms+zt0.5-1.0mg/l+2,4-d0.03-0.05mg/l+糖25-30g/l+琼脂4.5-5g/l，ph为5.8-6.0；
(5)壮苗生根：将步骤(4)诱导的丛生芽切下，接种至生根培养基中培养；所述生根培养基为：1/2wpm或1/2ms+naa0.5-1.0mg/l+iba0.1-0.2mg/l+活性炭0.4-0.6g/l+土豆30-50g/l+糖25-30g/l+琼脂4.5-5g/l，ph为5.8-6.0；
上述方法中，步骤(3)、(4)、(5)所用培养基都经过高温湿热灭菌，121℃/25min。
上述方法中，步骤(3)、(4)、(5)所用培养条件均为：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000lx，光照时间12小时/天。
本发明的有益效果在于：利用植物组织培养技术，建立白云参无性繁殖体系，获得大量优质种苗，实现规模化、规范化、产业化种植，解决白云参资源短缺的问题。本发明包含外植体灭菌、芽诱导、丛生芽增殖、生根等4个步骤，外植体灭菌接种成功率80％以上，诱导出芽率95％以上，增殖倍数60-70倍，所得种苗株高8-10cm，展叶8-12片，叶片开展度好，苗高度适中，大小均匀，生根率达98％以上。
具体实施方式
实施例1
(1)白云参带芽茎段的消毒：取白云参带芽茎段，用洗洁精稀释液清洗并在自来水下冲洗干净；然后将茎段转至超净工作台上，放入无菌瓶中，加入75％酒精消毒5-8s，无菌水洗1次，加入饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水洗2次，加入0.05％升汞溶液消毒7min，无菌水洗6次；
(2)丛生芽诱导：将消毒好的茎段放在无菌吸水纸上吸干水分，剪去茎段切口处褐化部分，接种至丛生芽诱导培养基ms+zt0.5mg/l+2,4-d0.05mg/l+糖30g/l+琼脂4.5g/l(ph5.8-6.0)中培养，温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000lx，光照时间12小时/天。培养30天，统计消毒灭菌率和丛生芽诱导率；
(3)丛生芽增殖：将步骤(2)诱导出的嫩芽剪下，剪成1-2芽/段的大小，接种至增殖培养基ms+zt0.6mg/l+2,4-d0.03mg/l+糖30g/l+琼脂4.5g/l(ph5.8-6.0)中培养，温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000lx，光照时间12小时/天；培养30天，统计丛生芽增殖率；
(4)壮苗生根培养：将步骤(3)诱导的丛生芽切下，接种至生根培养基1/2ms+naa1.0mg/l+iba0.2mg/l+活性炭0.5g/l+土豆50g/l+糖30g/l+琼脂4.5g/l(ph5.8-6.0)中，光照时间12小时/天；培养30天，统计生根率。
实施例2
(1)白云参带芽茎段的消毒：取白云参带芽茎段，用洗洁精稀释液清洗并在自来水下冲洗干净；然后将茎段转至超净工作台上，放入无菌瓶中，加入75％酒精消毒5-8s，无菌水洗1次，加入饱和漂白粉溶液消毒12min，无菌水洗2次，加入0.05％升汞溶液消毒8min，无菌水洗6次；
(2)丛生芽诱导：将消毒好的茎段放在无菌吸水纸上吸干水分，剪去茎段切口处褐化部分，接种至丛生芽诱导培养基wpm+zt1.0mg/l+2,4-d0.1mg/l+糖25g/l+琼脂5g/l(ph5.8-6.0)中培养，温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000lx，光照时间12小时/天。培养30天，统计消毒灭菌率和丛生芽诱导率；
(3)丛生芽增殖：将步骤(2)诱导出的嫩芽剪下，剪成1-2芽/段的大小，接种至增殖培养基wpm+zt0.8mg/l+2,4-d0.04mg/l+糖25g/l+琼脂5g/l(ph5.8-6.0)中培养，温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000lx，光照时间12小时/天；培养30天，统计丛生芽增殖率；
(4)壮苗生根培养：将步骤(3)诱导的丛生芽切下，接种至生根培养基1/2wpm+naa0.8mg/l+iba0.2mg/l+活性炭0.6g/l+土豆45g/l+糖25g/l+琼脂5g/l(ph5.8-6.0)中，光照时间12小时/天；培养30天，统计生根率。
对比例1
本实施例的一种大花金钱豹组培方法，为专利cn106561453a(大黄金钱豹的快速繁殖方法)实施例1，具体内容为：
一种大花金钱豹的快速繁殖方法，以大花金钱豹成熟浆果为外植体，经消毒、灭菌后在无菌条件下切开浆果取出大花金钱豹种子，经萌发培养得到的萌发苗依次进行初代培养、继代培养、生根培养和炼苗移栽。
其中，大花金钱豹种子接种至萌发培养基上进行萌发培养7-10天得萌发苗，所述萌发培养基的配方为：ms+1.5mg/l6-ba+0.5mg/lga3+300mg/lpvp，萌发培养的条件为：温度为26±2℃、光照强度为2000lx、光照时间为10h/天。
其中，大花金钱豹成熟浆果作为外植体的消毒、灭菌方法为：取大花金钱豹成熟浆果，在在超净工作台上用体积分数为75％的酒精浸泡5-10s后，用质量分数为0.1％的hgcl2溶液灭菌15min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，无菌吸水纸将水分吸干。
其中，初代培养的具体步骤为：将萌发培养得到的萌发苗切去根部后接种至诱导培养基上培养15-20天，得到丛生芽，其中，初代培养的条件为：温度为26±2℃、光照强度为2000lx、光照时间为10h/天；诱导培养基的配方为：ms+2.5mg/l6-ba+0.5mg/lkt+0.5mg/ltdz+0.2mg/lnaa+300mg/lpvp+200mg/l水解酪蛋白。
其中，继代培养的具体步骤为：将初代培养得到的丛生芽在无菌条件下切下含有2-3个芽的芽丛转接至增殖培养基中进行继代培养，培养周期为15-20天，继代培养的条件为：温度26±2℃、光照强度为2000lx、光照时间为10h/天；增殖培养基的配方为：ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lkt+0.2mg/ltdz+0.2mg/lnaa。
其中，生根培养的具体步骤为：当继代培养得到的芽苗长至2cm以上时，从基部切成单个芽，转接至生根培养基中培养20天得到生根苗，生根培养的条件为：温度26±2℃、光照强度为2000lx、光照时间为10h/天；生根培养基的配方为：1/2ms+1.5mg/liba+0.5mg/labt1。
其中，炼苗移栽的具体步骤为：将生根培养得到的生根苗开盖炼苗4天，然后将生根苗取出，清水洗去其根部的生根培养基，移栽至细沙河苗床上得移栽苗，移栽后的10天内保持环境中相对湿度为95％，控制白天温度为24±1℃，夜间温度为16±2℃，移栽后的15天后上杯种植，移栽后的30天后进行大田栽培。
对比例2
本实施例的一种大花金钱豹组培方法，为专利cn101869074a(一种土党参组培快繁方法)实施例1，其步骤为：
(1)外植体的选取与预处理：剪取长5-10cm的新萌发的嫩枝，剪去叶片，用加有1％(体积比)洗洁精的自来水中漂洗10-30分钟后，用自来水冲洗20-40分钟；
(2)外植体灭菌：将预处理后的嫩枝切成长1-2.0cm的带顶芽的茎段或带腋芽的茎段作为外植体进行表面灭菌，75％(体积比)酒精表面消毒30-45秒，无菌水冲洗3遍，然后用0.1％(重量比)升汞溶液浸泡振荡灭菌10-15分钟，无菌水洗3-5遍。
(3)诱导培养：在无菌条件下将经表面灭菌后的带顶芽的茎段或带腋芽的茎段外植体的一端或二端切口变褐处切除后，顶芽和带腋芽茎段的芽向上接种在诱导培养基中，在培养条件下培养30-45天后，诱导顶芽和腋芽萌芽，然后诱导出丛生芽并抽长成藤条；
(4)增殖培养：在无菌条件下将藤条切成一节一节接入增殖培养基中进行增殖培养，在培养条件下培养30-45天诱导出丛生芽并抽长成藤条；根据对幼苗数量的需求，每隔30-45天按同样方法进行组培苗再增殖培养；
(5)生根培养：将藤条切成一节一节后，接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20-30天后，藤条抽长成5-7cm、苗基部长出3-5根细根；
(6)移栽：将生根组培苗移栽于穴盘内的育苗袋中，培育1-2个月至成苗。
其中，基本培养基和各阶段培养基中添加物的含量为：
1)基本培养基：选用ms基本培养基，蔗糖或白糖20-30g/l，琼脂7-9g/l，ph5.6-5.8；
2)诱导培养基：ms+细胞分裂素0.5mg/l+生长素0.05mg/l+蔗糖或白糖30g/l；
3)增殖培养基：ms+细胞分裂素0.1mg/l+生长素0.01mg/l+蔗糖或白糖30g/l；
4)生根培养基：1/2ms+生长素0.25mg/l+蔗糖或白糖20g/l；
所述的细胞分裂素为ba或kt，生长素为naa或iaa或iba。各组培阶段的培养条件是，培养温度为26±2℃，光照光强为2500-3000lx，光照时间为10-16h/d。
实施例1-2和对比例1-2培养结果如下：
通过比较可知，本发明的方法外植体灭菌成功率比较高，丛生芽诱导率、增殖倍数显著高于对比例1和2，可见本发明的组培方法可极大地节约组培时间，提高白云参的种植效率。