本发明属于瓜蒌育苗技术领域，具体涉及一种瓜蒌组织培养育苗方法。
背景技术
瓜蒌（trichosantheskirilowii）是多年生攀缘型草本植物，别名：糖瓜蒌、蒌瓜、栝楼。其果实、果皮、果籽均可入药。成熟的瓜蒌表面呈橙黄色，皱缩或较光滑，顶端有圆形的花柱残基，基部稍尖，具残存果梗。质地脆，容易易破开，内表面为白色，果瓤橙黄色，粘稠状，与多数种子包裹成团。瓜蒌的地域分布广泛，我国辽宁、华北、华东、中南、陕西、甘肃、四川、贵州和云南等地均有大量分布和种植。瓜蒌的药用价值极高，在中药体系中主治功能主要有化痰、润肺、散结、滑肠等。可治痰热咳嗽、胸痹、结胸、肺痿咳血、消渴、黄疸、便秘、痈肿初起等病症。现代的一些研究也表明瓜蒌子、瓜蒌果皮、瓜蒌果实等内部的某些成分有很好的抑菌、抗氧化、抗癌的效果。本文主要对瓜蒌子、瓜蒌皮及瓜蒌果实的主要成分及其药用价值进行综述，为进一步研究瓜蒌的理化成分及药用价值的开发提供一定的借鉴和参考。
目前瓜蒌的种植方法多采用种子繁殖和分根繁殖，种子繁殖需要的时间较长，而且雌雄株比例严重不协调，分根繁殖发芽较慢，而且需要将块根挖出，操作非常繁琐，目前瓜蒌的组织培养快繁技术才刚开始起步，诱导分化阶段需要25~30天才能诱导出愈伤组织，繁殖周期非常长，并且瓜蒌一般作用食品被人们食用，现有的组织培养过程中，为了缩短瓜蒌的繁殖周期，加快瓜蒌的生长速度，在培养基质中添加大量的激素，激素的添加会在瓜蒌中富集，将会产生安全隐患，长期通过无性繁殖技术来繁殖瓜蒌，营养元素含量会不断下降，而且病菌的传染率增加。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种瓜蒌组织培养育苗方法。本发明提供了一种瓜蒌组织培养育苗方法，不仅愈伤组织诱导率高，染菌率低，繁殖周期短，而且培养出的瓜蒌营养成分含量丰富，抗病菌性能强，另外，由于不含激素，安全系数高，具有很好的经济效益和市场推广价值。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种瓜蒌组织培养育苗方法，包括以下步骤：
（1）外植体的准备：
取长有腋芽的雌性瓜蒌枝条，置于75%乙醇中进行浸泡，浸泡处理的时间为3~5min，然后将瓜蒌枝条滤出，用无菌水冲洗，再将瓜蒌枝条切成长度为0.4~0.6cm的小段备用；
（2）培养基质的制备：
a.粉碎处理：
称取相应重量份的黄瓜14~16份、胡瓜11~13份、赖葡萄8.5~9.5份、土豆13~15份、红薯7~9份、南瓜藤6~8份共同置于深冷式粉碎机中进行粉碎处理，粉碎机内的温度控制为-19~-11℃，粉碎处理的时间为32~38min，粉碎后过20目筛；
b.搅拌处理：
将操作a中过筛后的粉末和纯化水按照重量比为1:7.5~8.5共同置于搅拌罐内，然后称取粉末和纯化水总重量份0.65~0.75%的营养液、0.75~0.85%的改性琼脂粉、0.45~0.55%的改性氯化钕置于搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至99~101℃，搅拌处理，至改性琼脂粉完全溶解；
c.辐照灭菌：
将操作b中获得的混合液置于射线辐照仪中进行辐照处理，辐照处理的方式为x射线，辐照处理的总剂量为305~355gy；
（3）接种：将步骤（1）中处理好的外植体接种到步骤（2）制备的基质中，每140~160份基质中接种3~5个外植体，接种后用无菌封口膜将培养瓶进行封口；
（4）光照培养：将步骤（3）中接种后的培养瓶置于光照培养箱内进行培养，培养条件为每天光照处理12~14h，黑暗处理10~12h，温度控制为27~33℃；
（5）激光刺激：等到步骤（4）中的组培苗高度长至1~2cm时，用激光束照射组培苗，具体为每天上午10:00~11:00之间进行照射，每次照射50~60s，持续照射6~8d。
进一步的，所述步骤（2）操作b中营养液，由以下重量份组分组成：硫酸镁1.25~1.35份、碘化钾0.45~0.55份、硼酸0.0025~0.0035份、硫酸锰0.035~0.045份、硫酸锌0.00015~0.00025份、硫酸铜0.00045~0.00055份、钼酸钠0.000025~0.000035份、氯化钴0.000015~0.000025份、柠檬酸0.045~0.055份、无菌水420-480份。
进一步的，所述步骤（2）操作b中改性琼脂粉的制备方法是：将琼脂粉和改性液a按照重量比为1:3.5~4.5共同置于反应釜中，反应釜内的温度为72~78℃，反应釜内的压力为0.22~0.28mpa，搅拌处理22~28min后过滤得滤渣，将滤渣置于烘箱内进行干燥，干燥至恒重即可。
进一步的，所述干燥的温度为52~58℃。
进一步的，所述改性液a，由以下重量份组分组成：癸酰乙醛0.45~0.55份、β-蒎烯0.25~0.35份、大根香叶烯0.55~0.65份、β-巯基乙醇0.4~0.5份、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚0.065~0.075份、聚氧丙烯甘油醚0.15~0.25份、吐温800.045~0.055份、去离子水42~48份。
进一步的，所述步骤（2）操作b中改性氯化钕的制备方法是：将氯化钕浸泡于改性液b中，浸泡处理的同时进行微波处理，浸泡12~18min后，过滤得滤渣，将滤渣置于烘箱内进行干燥，干燥的温度为62~68℃，干燥至恒重即可。
进一步的，所述微波的频率为45~47ghz。
进一步的，所述改性液b，由以下重量份组分组成：十二烷基苯磺酸钠0.35~0.45份、丙酮0.075~0.085份、金丝桃甙0.55~0.65份、乙酸乙酯0.75~0.85份、去离子水32~38份。
进一步的，所述步骤（5）中激光束的形式为氦-镉光束，光束的波长为430~440nm。
本发明提供了一种瓜蒌组织培养育苗方法，首先对外植体进行处理，选择取长有腋芽的雌性瓜蒌枝条，此种枝条细胞分裂分化能力强，有助于愈伤组织和幼苗的形成，将枝条消毒灭菌后切成小段备用；本发明的组培基质在现有的瓜蒌组织培养基质的基础上做了很大的改进，首先在原料方面，黄瓜、胡瓜、赖葡萄、土豆、红薯、南瓜藤天然物质的营养成分来取代基质中添加的大量的大量元素化合物、有机质、激素等，不仅可以节省成本，还能提高安全系数，将黄瓜、胡瓜、赖葡萄等置于深冷式粉碎机中进行粉碎处理，在超低温环境中进行粉碎，可以最大限度的保障原料中有效成分的化学稳定性，在超低温环境下，原料中的水分会凝结成冰晶，避免粉末之间的黏结现象，而且此种粉碎方法粉碎后得到的粉末更细，又有助于营养成分的释放，促进瓜蒌外植体对营养物质的吸收利用，缩短繁殖周期。将粉碎过筛的粉末和纯化水共同置于搅拌罐内，同时在搅拌罐内添加营养液、改性琼脂粉、改性氯化钕，在高温条件下进行搅拌，促使它们形成营养均衡的培养基质溶液，其中营养液中主要包含少量植物组织培养所必需的微量元素，是为了补足黄瓜、胡瓜、赖葡萄等微量元素含量不足的缺陷，保证外植体愈伤组织的诱导率；改性琼脂粉相比较未经改性的琼脂粉熔点降低，缩短了溶解的时间和降低了溶解所需要的能耗，很好的避免了琼脂沸腾，培养基质溢出的现象，而且改性后的琼脂粉还具有杀菌、消毒的作用，可以降低染菌率；改性氯化钕可以激活外植体中多种酶的活性，提高外植体抗病菌的能力，增强外植体细胞的呼吸作用，加快愈伤组织的形成和幼苗的分化，缩短瓜蒌组织培养繁殖周期，并且还能促进细胞分裂、分化，有助于瓜蒌根、茎、叶的形成，取代了激素的功效。最后进行辐照灭菌，与常规的高温高压灭菌相比，辐照灭菌利用射线的穿射性能，灭菌更加彻底，并且还能促进基质中多种成分之间的生化反应，有利于基质的细化。接种后置于光照培养箱中进行培养，通过控制光照培养箱内的光照条件、黑暗条件以及温度来为瓜蒌组织培养提供优越的环境，促进愈伤组织和幼苗的形成。等到组培苗长到一定高度时，对组培苗进行特定波长、特定时间的激光束照射，申请人在大量的实验中发现氦-镉光束照射对幼苗中营养成分的富集作用最为显著，经过特定波长的激光照射后的瓜蒌苗木中的营养成分的含量明显上升。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了一种瓜蒌组织培养育苗方法，不仅愈伤组织诱导率高，染菌率低，繁殖周期短，而且培养出的瓜蒌营养成分含量丰富，抗病菌性能强，另外，由于不含激素，安全系数高，具有很好的经济效益和市场推广价值。
具体实施方式
实施例1
一种瓜蒌组织培养育苗方法，包括以下步骤：
（1）外植体的准备：
取长有腋芽的雌性瓜蒌枝条，置于75%乙醇中进行浸泡，浸泡处理的时间为3min，然后将瓜蒌枝条滤出，用无菌水冲洗，再将瓜蒌枝条切成长度为0.4cm的小段备用；
（2）培养基质的制备：
a.粉碎处理：
称取相应重量份的黄瓜14份、胡瓜11份、赖葡萄8.5份、土豆13份、红薯7份、南瓜藤6份共同置于深冷式粉碎机中进行粉碎处理，粉碎机内的温度控制为19℃，粉碎处理的时间为32min，粉碎后过20目筛；
b.搅拌处理：
将操作a中过筛后的粉末和纯化水按照重量比为1:7.5共同置于搅拌罐内，然后称取粉末和纯化水总重量份0.65%的营养液、0.75%的改性琼脂粉、0.45%的改性氯化钕置于搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至99℃，搅拌处理，至改性琼脂粉完全溶解；
c.辐照灭菌：
将操作b中获得的混合液置于射线辐照仪中进行辐照处理，辐照处理的方式为x射线，辐照处理的总剂量为305gy；
（3）接种：将步骤（1）中处理好的外植体接种到步骤（2）制备的基质中，每140份基质中接种3个外植体，接种后用无菌封口膜将培养瓶进行封口；
（4）光照培养：将步骤（3）中接种后的培养瓶置于光照培养箱内进行培养，培养条件为每天光照处理12h，黑暗处理10h，温度控制为27℃；
（5）激光刺激：等到步骤（4）中的组培苗高度长至1cm时，用激光束照射组培苗，具体为每天上午10:00之间进行照射，每次照射50s，持续照射6d。
进一步的，所述步骤（2）操作b中营养液，由以下重量份组分组成：硫酸镁1.25份、碘化钾0.45份、硼酸0.0025份、硫酸锰0.035份、硫酸锌0.00015份、硫酸铜0.00045份、钼酸钠0.000025份、氯化钴0.000015份、柠檬酸0.045份、无菌水420。
进一步的，所述步骤（2）操作b中改性琼脂粉的制备方法是：将琼脂粉和改性液a按照重量比为1:3.5共同置于反应釜中，反应釜内的温度为72℃，反应釜内的压力为0.22mpa，搅拌处理22min后过滤得滤渣，将滤渣置于烘箱内进行干燥，干燥至恒重即可。
进一步的，所述干燥的温度为52℃。
进一步的，所述改性液a，由以下重量份组分组成：癸酰乙醛0.45份、β-蒎烯0.25份、大根香叶烯0.55份、β-巯基乙醇0.4份、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚0.065份、聚氧丙烯甘油醚0.15份、吐温800.045份、去离子水42份。
进一步的，所述步骤（2）操作b中改性氯化钕的制备方法是：将氯化钕浸泡于改性液b中，浸泡处理的同时进行微波处理，浸泡12min后，过滤得滤渣，将滤渣置于烘箱内进行干燥，干燥的温度为62℃，干燥至恒重即可。
进一步的，所述微波的频率为45ghz。
进一步的，所述改性液b，由以下重量份组分组成：十二烷基苯磺酸钠0.35份、丙酮0.075份、金丝桃甙0.55份、乙酸乙酯0.75份、去离子水32份。
进一步的，所述步骤（5）中激光束的形式为氦-镉光束，光束的波长为430nm。
实施例2
一种瓜蒌组织培养育苗方法，包括以下步骤：
（1）外植体的准备：
取长有腋芽的雌性瓜蒌枝条，置于75%乙醇中进行浸泡，浸泡处理的时间为4min，然后将瓜蒌枝条滤出，用无菌水冲洗，再将瓜蒌枝条切成长度为0.5cm的小段备用；
（2）培养基质的制备：
a.粉碎处理：
称取相应重量份的黄瓜15份、胡瓜12份、赖葡萄9份、土豆14份、红薯8份、南瓜藤7份共同置于深冷式粉碎机中进行粉碎处理，粉碎机内的温度控制为-15℃，粉碎处理的时间为35min，粉碎后过20目筛；
b.搅拌处理：
将操作a中过筛后的粉末和纯化水按照重量比为1:8共同置于搅拌罐内，然后称取粉末和纯化水总重量份0.7%的营养液、0.8%的改性琼脂粉、0.5%的改性氯化钕置于搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至100℃，搅拌处理，至改性琼脂粉完全溶解；
c.辐照灭菌：
将操作b中获得的混合液置于射线辐照仪中进行辐照处理，辐照处理的方式为x射线，辐照处理的总剂量为330gy；
（3）接种：将步骤（1）中处理好的外植体接种到步骤（2）制备的基质中，每150份基质中接种4个外植体，接种后用无菌封口膜将培养瓶进行封口；
（4）光照培养：将步骤（3）中接种后的培养瓶置于光照培养箱内进行培养，培养条件为每天光照处理13h，黑暗处理11h，温度控制为30℃；
（5）激光刺激：等到步骤（4）中的组培苗高度长至1.5cm时，用激光束照射组培苗，具体为每天上午10:30之间进行照射，每次照射55s，持续照射7d。
进一步的，所述步骤（2）操作b中营养液，由以下重量份组分组成：硫酸镁1.3份、碘化钾0.5份、硼酸0.003份、硫酸锰0.04份、硫酸锌0.0002份、硫酸铜0.0005份、钼酸钠0.00003份、氯化钴0.00002份、柠檬酸0.05份、无菌水450份。
进一步的，所述步骤（2）操作b中改性琼脂粉的制备方法是：将琼脂粉和改性液a按照重量比为1:4共同置于反应釜中，反应釜内的温度为75℃，反应釜内的压力为0.25mpa，搅拌处理25min后过滤得滤渣，将滤渣置于烘箱内进行干燥，干燥至恒重即可。
进一步的，所述干燥的温度为55℃。
进一步的，所述改性液a，由以下重量份组分组成：癸酰乙醛0.5份、β-蒎烯0.3份、大根香叶烯0.6份、β-巯基乙醇0.45份、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚0.07份、聚氧丙烯甘油醚0.2份、吐温800.05份、去离子水45份。
进一步的，所述步骤（2）操作b中改性氯化钕的制备方法是：将氯化钕浸泡于改性液b中，浸泡处理的同时进行微波处理，浸泡15min后，过滤得滤渣，将滤渣置于烘箱内进行干燥，干燥的温度为65℃，干燥至恒重即可。
进一步的，所述微波的频率为46ghz。
进一步的，所述改性液b，由以下重量份组分组成：十二烷基苯磺酸钠0.4份、丙酮0.08份、金丝桃甙0.6份、乙酸乙酯0.8份、去离子水35份。
进一步的，所述步骤（5）中激光束的形式为氦-镉光束，光束的波长为435nm。
实施例3
一种瓜蒌组织培养育苗方法，包括以下步骤：
（1）外植体的准备：
取长有腋芽的雌性瓜蒌枝条，置于75%乙醇中进行浸泡，浸泡处理的时间为5min，然后将瓜蒌枝条滤出，用无菌水冲洗，再将瓜蒌枝条切成长度为0.6cm的小段备用；
（2）培养基质的制备：
a.粉碎处理：
称取相应重量份的黄瓜16份、胡瓜13份、赖葡萄9.5份、土豆15份、红薯9份、南瓜藤8份共同置于深冷式粉碎机中进行粉碎处理，粉碎机内的温度控制为-11℃，粉碎处理的时间为38min，粉碎后过20目筛；
b.搅拌处理：
将操作a中过筛后的粉末和纯化水按照重量比为1:8.5共同置于搅拌罐内，然后称取粉末和纯化水总重量份0.75%的营养液、0.85%的改性琼脂粉、0.55%的改性氯化钕置于搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至101℃，搅拌处理，至改性琼脂粉完全溶解；
c.辐照灭菌：
将操作b中获得的混合液置于射线辐照仪中进行辐照处理，辐照处理的方式为x射线，辐照处理的总剂量为355gy；
（3）接种：将步骤（1）中处理好的外植体接种到步骤（2）制备的基质中，每160份基质中接种5个外植体，接种后用无菌封口膜将培养瓶进行封口；
（4）光照培养：将步骤（3）中接种后的培养瓶置于光照培养箱内进行培养，培养条件为每天光照处理14h，黑暗处理12h，温度控制为33℃；
（5）激光刺激：等到步骤（4）中的组培苗高度长至2cm时，用激光束照射组培苗，具体为每天上午11:00之间进行照射，每次照射60s，持续照射8d。
进一步的，所述步骤（2）操作b中营养液，由以下重量份组分组成：硫酸镁1.35份、碘化钾0.55份、硼酸0.0035份、硫酸锰0.045份、硫酸锌0.00025份、硫酸铜0.00055份、钼酸钠0.000035份、氯化钴0.000025份、柠檬酸0.055份、无菌水480份。
进一步的，所述步骤（2）操作b中改性琼脂粉的制备方法是：将琼脂粉和改性液a按照重量比为1:4.5共同置于反应釜中，反应釜内的温度为78℃，反应釜内的压力为0.28mpa，搅拌处理28min后过滤得滤渣，将滤渣置于烘箱内进行干燥，干燥至恒重即可。
进一步的，所述干燥的温度为58℃。
进一步的，所述改性液a，由以下重量份组分组成：癸酰乙醛0.55份、β-蒎烯0.35份、大根香叶烯0.65份、β-巯基乙醇0.5份、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚0.075份、聚氧丙烯甘油醚0.25份、吐温800.055份、去离子水48份。
进一步的，所述步骤（2）操作b中改性氯化钕的制备方法是：将氯化钕浸泡于改性液b中，浸泡处理的同时进行微波处理，浸泡18min后，过滤得滤渣，将滤渣置于烘箱内进行干燥，干燥的温度为68℃，干燥至恒重即可。
进一步的，所述微波的频率为47ghz。
进一步的，所述改性液b，由以下重量份组分组成：十二烷基苯磺酸钠0.45份、丙酮0.085份、金丝桃甙0.65份、乙酸乙酯0.85份、去离子水38份。
进一步的，所述步骤（5）中激光束的形式为氦-镉光束，光束的波长为440nm。
对比实施例1
本对比实施例1与实施例2相比，将步骤（2）操作b中的改性琼脂粉换成未经改性的等质量份的琼脂粉，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例2
本对比实施例2与实施例2相比，省去步骤（2）操作b中的改性氯化钕，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例3
本对比实施例3与实施例2相比，将步骤（2）操作c辐照灭菌换成常规的高温高压灭菌，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例4
本对比实施例4与实施例2相比，省去步骤（5）激光刺激的整个过程，除此外的方法步骤均相同。
对照组
申请号为201710864790.1公开的一种瓜蒌组织培养育苗方法。
为了对比本发明效果，取长有腋芽的雌性瓜蒌枝条作为实验对象，然后分别用实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对照组的育苗方法进行育苗，统计记录愈伤组织诱导率，染菌率，以及组培苗中蛋白质含量、不饱和脂肪酸含量。在统计染菌率时及时清理染菌的外植体。
具体实验对比数据如下表1所示：
表1
由上表1可以看出，本发明提供了一种瓜蒌组织培养育苗方法，不仅愈伤组织诱导率高，染菌率低，繁殖周期短，而且培养出的瓜蒌营养成分含量丰富，抗病菌性能强，另外，由于不含激素，安全系数高，具有很好的经济效益和市场推广价值。