一种铁皮石斛组织培养快速繁殖的方法与流程

本发明涉及一种铁皮石斛(dendrobiumofficinale)组培快繁的方法，属于中草药植物组织培养领域。

背景技术

铁皮石斛，兰科石斛属，是我国最珍贵的中药材之一，与天山雪莲、从蓉、深山灵芝、冬虫夏草等共被尊为“中华九大仙草”并列为之首，具有益胃生津、滋阴清热、止咳润肺等功效。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力和扩张血管等作用。近年来，随着人们对铁皮石斛药用价值的认识日益提高，铁皮石斛的需求量也不断提高，传统的野生资源已经不能满足人们的需求量，而且铁皮石斛对生长环境要求苛刻，自然繁殖力低，使得野生资源日渐枯竭，现已被列为国家重点保护的野生药材品种。为了更好地保护和利用铁皮石斛资源，越来越多的科研工作者开始关注铁皮石斛的研发工作，其中铁皮石斛的组织培养技术是其繁殖的一种重要手段，但是一般组织培养过程中如茎段诱导、叶片诱导等污染率较高，诱导率不高，资源消耗量大而且浪费严重，生长周期较长。因此，如何提高培养效率、缩短培养时间、降低资源消耗已成为促进铁皮石解产业发展的当务之急。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种用铁皮石斛蒴果作为外植体的铁皮石斛组织培养快速繁殖的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种铁皮石斛组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)将铁皮石斛成熟蒴果浸泡在多菌灵50％可湿性粉剂的1200～1500质量倍水稀释液中2～3小时，取出后用自来水冲洗干净；在超净工作台中，用体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡30～40s，再用质量浓度0.1％的氯化汞水溶液浸泡10～12min，取出，置于无菌水中并放到恒温摇床内，恒温摇床的转速为80～100rpm，温度为23～25℃，摇动10～20min，再用无菌水冲洗4～6次；

(2)将步骤(1)获得铁皮石斛蒴果放到无菌纸上，用无菌刀在铁皮石斛一端横切个开口，用镊子夹住另一端将蒴果内絮状种子均匀撒到诱导培养基上，在23～25℃，光照强度1000-2000lux，光照时间12h/d培养，诱导出原球茎后继续培养至幼苗长至3～5cm；

(3)将步骤(2)得到的幼苗接种到生根培养基，在23～25℃，光照强度2000-3000lux，光照时间12h/d培养，获得6-8cm高的健壮铁皮石斛成苗。

诱导培养基配方为：在n6培养基中加入萘乙酸，使终浓度为0.5mg/l，加入活性炭，使终浓度为0.5g/l，加入蔗糖，使终浓度为30g/l，加入琼脂，使终浓度为4.6g/l，ph＝5.8。

生根培养基配方为：在n6培养基中加入萘乙酸，使终浓度为1mg/l，加入活性炭，使终浓度为0.5g/l，加入蔗糖，使终浓度为25g/l，加入琼脂，使终浓度为4.6g/l，加入香蕉，使终浓度为25g/l，ph＝5.8。

本发明的优点：

实验证明，本发明的方法，可使铁皮石斛组织培养过程达到零污染，解决了现有组培技术中污染问题；更重要的是避免了现有方法中使用茎段、叶片作为外植体对铁皮石斛造成的资源耗费。而且本发明将原球茎诱导和幼苗培养合为一步，节省了培养基的配制原料及配置时间，生根效果更好，成苗健壮，且大大缩短了培养周期，提高了铁皮石斛的产量及质量。

附图说明

图1为铁皮石斛种子接种到诱导培养基10天的生长情况；

图2为铁皮石斛种子接种到诱导培养基30天的生长情况；

图3为铁皮石斛种子接种到诱导培养基85天的生长情况；

图4为铁皮石斛幼苗移换至生根培养基60天的生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1

一种铁皮石斛组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)选择成熟的铁皮石斛蒴果，在流水下冲洗干净，浸泡在多菌灵50％可湿性粉剂的1300质量倍水稀释液中2.5小时，取出后用自来水冲洗干净；在超净工作台中，用体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡35s，再用质量浓度0.1％的氯化汞水溶液浸泡11min，取出，置于无菌水中并放到恒温摇床内，恒温摇床的转速为90rpm，温度为24℃，摇动15min，再用无菌水冲洗5次；

(2)将步骤(1)获得铁皮石斛蒴果放到无菌纸上，用无菌刀在铁皮石斛一端横切个开口，用镊子夹住另一端将蒴果内絮状种子均匀撒到诱导培养基上，在24℃，光照强度1500lux，光照时间12h/d，诱导出原球茎后继续培养至幼苗长至3～5cm(共培养90天，分别在培养10天，30天，85天时照像，依次见图1、图2和图3)；

(3)将步骤(2)得到的幼苗接种到生根培养基，在24℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d培养，培养(62天，在培养60天时照像，见图4)，获得6-8cm高的健壮铁皮石斛成苗。

本实施例，污染率为0，褐化率为11％(由于铁皮石斛蒴果内种子为絮状，十分微小，不能以种子数计算污染率和褐化率，所以上述结果均以瓶为单位计算，以下同)；同时，铁皮石斛的诱导率和生根率达到100％，培养周期为152天。

实施例2

一种铁皮石斛组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)选择成熟的铁皮石斛蒴果，在流水下冲洗干净，浸泡在多菌灵50％可湿性粉剂的1200质量倍水稀释液中3小时，取出后用自来水冲洗干净；在超净工作台中，用体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡30s，再用质量浓度0.1％的氯化汞水溶液浸泡10min，取出，置于无菌水中并放到恒温摇床内，恒温摇床的转速为80rpm，温度为23℃，摇动20min，再用无菌水冲洗4次；

(2)将步骤(1)获得铁皮石斛蒴果放到无菌纸上，用无菌刀在铁皮石斛一端横切个开口，用镊子夹住另一端将蒴果内絮状种子均匀撒到诱导培养基上，在23℃，光照强度1000lux，光照时间12h/d，诱导出原球茎后继续培养至幼苗长至3～5cm，(共培养95天)；

(3)将步骤(2)得到的幼苗接种到生根培养基，在23℃，光照强度2000lux，光照时间12h/d培养(55天)，获得6-8cm高的健壮铁皮石斛成苗。

本实施例，污染率为0，褐化率为13％；同时铁皮石斛的诱导率和生根率均达100％，培养周期为150天。

实施例3

一种铁皮石斛组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)选择成熟的铁皮石斛蒴果，在流水下冲洗干净，浸泡在多菌灵50％可湿性粉剂的1500质量倍水稀释液中2小时，取出后用自来水冲洗干净；在超净工作台中，用体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡40s，再用质量浓度0.1％的氯化汞水溶液浸泡12min，取出，置于无菌水中并放到恒温摇床内，恒温摇床的转速为100rpm，温度为25℃，摇动10min，再用无菌水冲洗6次；

(2)将步骤(1)获得铁皮石斛蒴果放到无菌纸上，用无菌刀在铁皮石斛一端横切个开口，用镊子夹住另一端将蒴果内絮状种子均匀撒到诱导培养基上，在25℃，光照强度2000lux，光照时间12h/d，诱导出原球茎后继续培养至幼苗长至3～5cm，(培养85天)；

(3)将步骤(2)得到的幼苗接种到生根培养基，在25℃，光照强度3000lux，光照时间12h/d培养(60天)，获得6-8cm高的健壮铁皮石斛成苗。

本实施例，污染率为0，褐化率为8％；同时铁皮石斛的诱导率和生根率均达100％，培养周期为145天。

各实施例采用的诱导培养基的配方为：在n6培养基中加入萘乙酸，使终浓度为0.5mg/l，加入活性炭，使终浓度为0.5g/l，加入蔗糖，使终浓度为30g/l，加入琼脂，使终浓度为4.6g/l，ph＝5.8。

各实施例采用的生根培养基的配方为：在n6培养基中加入萘乙酸，使终浓度为1mg/l，加入活性炭，使终浓度为0.5g/l，加入蔗糖，使终浓度为25g/l，加入琼脂，使终浓度为4.6g/l，加入香蕉，使终浓度为25g/l，ph＝5.8。