本发明涉及一种酥梨的种质资源保存方法，具体涉及一种酥梨的组培繁殖种质保存和保存后种质恢复生长的方法，属于果林科学技术领域。
背景技术：
梨是蔷薇科苹果亚科梨属植物(pyrus)的总称，为乔木落叶果树，全世界约有30种，是主要的温带果树，其果实也是世界五大水果之一。梨是我国栽培的重要果树之一，栽培历史己有2500多年。我国的梨树栽培面积和产量多年来一直均居世界首位，是世界梨生产第一大国。梨果不仅鲜脆多汁、酸甜可口，而且营养丰富。梨果富含糖类、蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、膳食纤维以及多种维生素，能满足人体多种营养需求。梨还有药用价值，具有降火、清心、润肺、化痰、止咳、退热、解疮毒和酒毒的功效，还可助消化、利尿、润肠通便、降低血压、预防感冒，常食用对健康十分有益。
酥梨是梨的一种栽培品种，其果实近圆柱形，顶部平截稍宽，平均单果重250克；果皮表面光洁，新鲜为绿黄色，贮后黄色；果肉洁白，中粗，酥脆，汁多味浓甜，有石细胞；丰产性好，适应性广，对土壤气候条件要求不严，耐瘠薄，抗寒、抗病虫能力中等。酥梨原产于安徽省砀山县，是最古老的地方梨品种。砀山酥梨是我国传统三大名梨之首，以其果大汁多味甜且具有润肺止咳作用而驰名中外，是我国对外出口的主要品种。砀山酥梨还是我国重要的梨栽培种质资源之一，是我国梨育种的骨干亲本，在育种中发挥着重要作用。很多育种家通过杂交育种、芽变选种等手段，获得了以‘砀山酥梨’为亲本的杂交新品种、‘砀山酥梨’芽变品种，以及提纯复壮的‘砀山酥梨’优系，丰富了我国梨品种资源。但是近年来，由于酥梨产业发展速度过快，但缺乏一定的技术指导，砀山酥梨在全国盲目地推广开来，一些产地的环境不适合酥梨品种的要求，再加上生产管理不规范，导致酥梨原有种质退化，表现为果实外观比较差，果皮粗糙、果实石细胞含量较高，口感差，严重影响了其鲜果品质和市场价值。另一方面，酥梨通常采用嫁接、扦插、压条等无性繁殖方式进行生产，这些方法都可能携带一种甚至多种病毒或类病毒，在长期的繁殖过程中，病毒逐代积累，也会造成酥梨的种质退化。因此，开展酥梨的优良种质资源保存工作已成为当务之急，也是一项十分重要的基础工作。
目前，我国梨种质资源的保存主要以资源圃的形式进行保存，即集中定植梨的种质资源到适合其生长的、有一定生态代表性的圃地，以长久保存。然而，这种保存方法存在着一些缺点，首先是种质圃保存有局限性如易受自然灾害(包括病虫害)的侵袭；其次是占地广，需要耗费大量的人力、物力和财力；第三是繁殖系数不高，无法进行大规模扩繁。因此，开展梨的离体保存工作具有重要的意义。
离体保存按照保存的技术手段可分为常规继代保存、缓慢生长保存以及超低温保存。其中缓慢生长保存是通过改变培养物生长的外界环境条件，使细胞生长降至最小限度，但不死亡，从而达到延长继代培养时间的目的，与常规继代保存相比，具有继代次数少、遗传变异系数低、保存时间长的优点；与超低温保存相比，具有技术设备要求低、操作方便、价格廉价的优点，因此是本发明团队研究的重点方向。
技术实现要素：
本发明针对目前酥梨种质资源的保存方面存在的缺陷或不足，目的在于使其外植体取材方便、继代周期加长、保存时间延长、保存成本降低、种质恢复生长效果好，能较好地稳定品种种性，满足科学开发利用酥梨种质资源的需要。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，该方法的技术流程包括以下步骤：
1）酥梨外植体的取材与消毒
采集酥梨树当年生带芽且生长健壮无病虫的幼嫩枝条，小心摘除叶片，然后将枝条用洗衣粉水刷洗干净，切成1-2cm的茎段，每段含有1个顶芽或腋芽，再将茎段用流水冲洗20-30min，之后在超净工作台上用70%酒精消毒1min，无菌蒸馏水冲洗2-3次，再用0.6%的邻苯二甲醛消毒8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3次；用滤纸吸干表面水分后备用；
2）不定芽诱导培养
将上述消过毒的茎段接种于不定芽诱导培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1800-2200lx、每天光照12-14h的条件下，培养27-35d诱导出不定芽；
3）种质慢生长保存
将诱导产生的高约1.5-2.0cm的不定芽从瓶中取出，切去基部褐化部分，转接到种质保存培养基①或种质保存培养基②上，用封口膜封闭瓶口，然后置于温度4-6℃、光照强度700-900lx、每天光照10-12h的培养条件下缓慢生长，每12个月继代一次，种质保存培养基①和种质保存培养基②继代时交替使用，然后继续进行慢生长保存；
4）种质恢复生长
酥梨种质保存期结束后，将步骤3）中缓慢生长的不定芽转接到复壮培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1500-2000lx、每天光照12-14h的条件下恢复生长，培养15-25d可获得生长健壮的酥梨不定芽；
5）生根培养
将上述不定芽切成单个，转接到生根培养基中，置于温度23-27℃、光照强度2000-2500lx、每天光照13-15h的条件下培养25-30天获得生根的组培苗；
6）炼苗移栽
当组培苗根系长至4-6条，根长3-5cm时，将组培苗移至大棚中利用自然光照进行炼苗，不打开瓶盖炼苗7d，打开瓶盖炼苗5d；将组培苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基，将根部在5.5%高锰酸钾溶液中浸泡20min后，移栽入基质中，进行常规栽培管理。
所述步骤1）中采集酥梨树枝条的时间为春季酥梨的盛花期。
所述步骤2）中不定芽诱导培养基的配方为：1/2ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.8mg/lzt+0.2%活性炭+甲基磺酸乙酯0.4g/l，ph值为5.8~6.0。
所述步骤3）中种质保存培养基①的配方为：kno3198~224mg/l，nh4no3815~835mg/l，kh2po485~90mg/l，mgso4·7h2o174~180mg/l，cacl2·2h2o207~211mg/l，mnso4·4h2o20~23mg/l，znso4·7h2o7~9mg/l，h3bo311~14mg/l，ki0.6~0.7mg/l，cuso4·5h2o0.022~0.026mg/l，cocl2·6h2o0.022~0.026mg/l，na2moo4·2h2o0.20~0.30mg/l，feso4·7h2o27~28mg/l，na2-edta35~36mg/l，肌醇50~60mg/l，谷胱甘肽21~25mg/l，脯氨酸4~8mg/l，维生素b10.3~0.6mg/l，维生素b60.4~0.7mg/l，烟酸0.4~0.6mg/l，核黄素0.4~0.6mg/l，二硫基丙醇5.6~6.2mg/l，氟节胺0.7~0.9mg/l，蔗糖27~32g/l，山梨醇29~33g/l，海藻酸钠2.5~3.0mg/l，葡萄籽粉2.3~2.9g/l，代森铵14~18mg/l，卡拉胶6~7g/l，ph为5.6~6.0。
所述步骤3）中种质保存培养基②的配方为：kno3915~931mg/l，nh4no3815~835mg/l，kh2po418~24mg/l，mgso4·7h2o174~180mg/l，cacl2·2h2o207~211mg/l，mnso4·4h2o20~23mg/l，znso4·7h2o7~9mg/l，h3bo311~14mg/l，ki0.6~0.7mg/l，cuso4·5h2o0.022~0.026mg/l，cocl2·6h2o0.022~0.026mg/l，na2moo4·2h2o0.20~0.30mg/l，feso4·7h2o53~58mg/l，na2-edta60~64mg/l，肌醇50~60mg/l，谷胱甘肽21~25mg/l，赖氨酸4~7mg/l，色氨酸3~5mg/l，维生素b10.3~0.6mg/l，维生素b60.4~0.7mg/l，柠檬酸1.2~1.4mg/l，泛酸0.45~0.55mg/l，大豆卵磷脂17~23mg/l，乳酸链球菌素8.8~9.4mg/l，蔗糖27~32g/l，山梨醇29~33g/l，洋葱浸提液40~46ml/l，活性炭0.4~0.6g/l，卡拉胶6~7g/l，ph为5.6~6.0。
所述步骤3）中继代次数为不超过5次。
所述步骤4）中复壮培养基的配方为：ms+谷胱甘肽3.3g/l+2,4-d1.2mg/l+二苯基脲磺酸钙1.8mg/l+黄瓜汁33ml/l+柠檬酸钛1.4g/l，ph为5.6~6.0。
所述步骤（5）中的生根培养基的配方为：1/2ms+iba1.0mg/l+氯化胆碱0.3mg/l，ph为5.8~6.0。
本发明相比现有技术有如下优点：
1、本发明以酥梨幼嫩枝条的茎段为外植体，取材方便，操作简单；以诱导出的不定芽作为种质保存材料，在种质保存期结束后，可以在恢复生长的同时进行大量增殖，从而为生产提供大量种苗。
2、本发明通过对酥梨组培条件的有效调控，并采用两种不同的种质保存培养基交替使用，减缓了保存材料的生长，降低了营养消耗，极大延长了继代时间，降低了单纯组培保存方法中继代次数过多引起的遗传变异，使种质保存期可以延长到4-5年。
3、采用本发明的方法保存的种质，恢复生长情况良好，移栽成活率高，遗传性状稳定，因此本发明是一种有效的酥梨优良种质资源的保存方法。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
实施例1
2011-2015年，选择砀山酥梨的优良品种‘砀山新酥’作为种质资源，按照本发明的技术流程进行种质保存试验，详细步骤如下：
1）酥梨外植体的取材与消毒
在春季酥梨的盛花期，采集酥梨树当年生带芽且生长健壮无病虫的幼嫩枝条，小心摘除叶片，然后将枝条用洗衣粉水刷洗干净，切成1-2cm的茎段，每段含有1个顶芽或腋芽，再将茎段用流水冲洗20-30min，之后在超净工作台上用70%酒精消毒1min，无菌蒸馏水冲洗2-3次，再用0.6%的邻苯二甲醛8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3次；用滤纸吸干表面水分后备用。
2）不定芽诱导培养
将上述消过毒的茎段接种于不定芽诱导培养基中（不定芽诱导培养基的配方为：1/2ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.8mg/lzt+0.2%活性炭+甲基磺酸乙酯0.4g/l，ph值为5.8），置于温度25℃、光照强度2000lx、每天光照12h的条件下，培养27-35d诱导出不定芽。
3）种质慢生长保存
将诱导产生的高约1.5-2.0cm的不定芽从瓶中取出，切去基部褐化部分，转接到种质保存培养基①或种质保存培养基②上，用封口膜封闭瓶口，然后置于温度5℃、光照强度800lx、每天光照11h的培养条件下缓慢生长，每12个月继代一次，种质保存培养基①和种质保存培养基②继代时交替使用，然后继续进行慢生长保存；继代4次，又培养5个月后统计不定芽存活率和增殖系数；
种质保存培养基①的配方为：kno3211mg/l，nh4no3825mg/l，kh2po487.5mg/l，mgso4·7h2o177mg/l，cacl2·2h2o209mg/l，mnso4·4h2o21.5mg/l，znso4·7h2o8mg/l，h3bo312.5mg/l，ki0.65mg/l，cuso4·5h2o0.024mg/l，cocl2·6h2o0.024mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27.5mg/l，na2-edta35.5mg/l，肌醇55mg/l，l-天冬酰胺23mg/l，脯氨酸6mg/l，维生素b10.4mg/l，维生素b60.6mg/l，烟酸0.5mg/l，核黄素0.5mg/l，二硫基丙醇5.9mg/l，氟节胺0.8mg/l，蔗糖29g/l，山梨醇31g/l，海藻酸钠2.8mg/l，葡萄籽粉2.6g/l，代森铵16mg/l，卡拉胶6.5g/l，ph为5.7；
种质保存培养基②的配方为：kno3923mg/l，nh4no3825mg/l，kh2po421mg/l，mgso4·7h2o177mg/l，cacl2·2h2o209mg/l，mnso4·4h2o21.5mg/l，znso4·7h2o8mg/l，h3bo312.5mg/l，ki0.65mg/l，cuso4·5h2o0.024mg/l，cocl2·6h2o0.024mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27.5mg/l，na2-edta35.5mg/l，肌醇55mg/l，l-天冬酰胺23mg/l，赖氨酸5.5mg/l，色氨酸4mg/l，维生素b10.4mg/l，维生素b60.6mg/l，柠檬酸1.3mg/l，泛酸0.5mg/l，大豆卵磷脂20mg/l，乳酸链球菌素9.1mg/l，蔗糖29g/l，山梨醇31g/l，洋葱浸提液43ml/l，活性炭0.5g/l，卡拉胶6.5g/l，ph为5.8。
4）种质恢复生长
酥梨种质保存4年又5个月后，将存活的不定芽转接到复壮培养基中（复壮培养基的配方为：ms+谷胱甘肽3.3g/l+2,4-d1.2mg/l+二苯基脲磺酸钙1.8mg/l+黄瓜汁33ml/l+柠檬酸钛1.4g/l，ph为5.9），置于温度25℃、光照强度1800lx、每天光照13h的条件下恢复生长，培养15-25d后观察不定芽生长情况。
5）生根培养
将上述不定芽切成单个，转接到生根培养基中（生根培养基的配方为：1/2ms+iba1.0mg/l+氯化胆碱0.3mg/l，ph为5.8），置于温度26℃、光照强度2300lx、每天光照14h的条件下培养25-30天获得生根的组培苗；统计芽苗的生根率。
6）炼苗移栽
当组培苗根系长至4-6条，根长3-5cm时，将组培苗移至大棚中利用自然光照进行炼苗，不打开瓶盖炼苗7d，打开瓶盖炼苗5d；将组培苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基，将根部在5.5%高锰酸钾溶液中浸泡20min后，移栽入基质中，进行常规肥水管理；移栽1个月后统计酥梨组培苗的移栽成活率。
实施例2
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行酥梨的种质保存试验，不同的是将步骤3）中种质保存的培养条件改为酥梨组织培养的常规条件，即温度为25℃、光照强度为2000lx。
实施例3
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行酥梨的种质保存试验，不同的是步骤3）中单独使用种质保存培养基①。
实施例4
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行酥梨的种质保存试验，不同的是步骤3）中单独使用种质保存培养基②。
实施例5
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行酥梨的种质保存试验，不同的是步骤3）中单独使用ms+6-ba0.5mg/l+iba0.1mg/l+pp3335.0mg/l+甘露醇30g/l+活性炭3.0g/l作为种质保存培养基，该配方来源于赵胜利《桃梨离体再生体系建立及试管苗种质保存研究》。
结果统计
1、将实施例1-5中种质保存4年5个月后不定芽存活率和增殖系数、种质复壮后生长情况、生根率、移栽成活率统计如下表1。
由表1可以看出，实施例1即采用本发明的方法保存种质4年5个月后，不定芽的存活率仍可达到68.4%，增殖系数为3.09，说明保存效果好；种质材料经过恢复生长后，不定芽长势旺盛，能够保持较强的生活力，移栽成活率达到95.7%，可见本发明的方法不仅保存时间长，而且对保存材料的伤害较小，保存材料可以在较短时间内恢复正常的生长状态，满足生产上的需要；将实施例1步骤（5）中生根的组培苗采用根尖压片法进行染色体鉴定，发现染色体数量没有发生变化，为2n=2x=34条，染色体形态正常，没有因为长时间的离体保存而发生改变，说明保存后材料的遗传稳定性良好；因此本发明是一种种质保存时间长、遗传稳定性好、种质存活率高的酥梨种质离体保存方法，对酥梨的种质资源保护、品质优化具有重要的意义。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。