瓜蒌离体增殖培养基及其制备方法以及瓜蒌继代培养方法与流程

本发明涉及瓜蒌，具体地，涉及一种瓜蒌离体增殖培养基及其制备方法以及瓜蒌继代培养方法。
背景技术：
：ms培养基是目前使用最普遍的培养基；其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。ms固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。ms培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要；因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。瓜蒌是葫芦科，栝楼属多年生攀缘草本。传统的瓜蒌繁殖一般为分根繁殖和种子繁殖，当然目前瓜蒌繁殖也出现了组织培养繁殖方式，但是现有的继代培养过程中往往发现继代植株的玻璃化现象严重且感菌率较高，从而使得继代培养的成活率较低。技术实现要素：本发明的目的是提供一种瓜蒌离体增殖培养基及其制备方法以及瓜蒌继代培养方法，该瓜蒌离体增殖培养基能够降低瓜蒌继代培养的玻璃化现象和感菌率，进而使得瓜蒌继代培养方法能够得到进一步推广，同时该制备方法具有工序简单和操作设备要求低的特点。为了实现上述目的，本发明提供了一种瓜蒌离体增殖培养基的制备方法，包括：1)将水加热至沸腾，接着加入琼脂进行溶解，然后加入糖、大量母液、微量母液、铁盐母液、有机母液、生长素以及细胞分裂素混合；2)向体系中加入水进行稀释，然后将体系ph调节至6.0-6.4以制得瓜蒌离体增殖培养基；其中，大量母液中含有硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙；微量母液中含有硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴；有机母液中含有甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇。硫酸锰。本发明还提供了一种瓜蒌离体增殖培养基，该瓜蒌离体增殖培养基通过上述的制备方法制备而得。本发明进一步提供了一种瓜蒌继代培养方法，包括：1)将培养环境以及培养工具进行灭菌；2)将瓜蒌外植体置于上述瓜蒌离体增殖培养基中进行培养。在上述技术方案中，本发明通过改变植物组织培养配方中的激素，使瓜蒌的外植体(如茎芽)在植物织培养的配方下快速成长，达到大量培育的目的，从而为瓜蒌前期大面积种植的种苗来源做好基础，在瓜蒌组织快速增长的条件下更进一步的增强其抗病性，耐旱性等不良因素的抗性。在原ms培养基的基础上减少继代植物的玻璃化以及感菌率，并使继代快速生长，从而可以提高瓜蒌的品性，有利于优良性状的累积。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：图1是对比例1制得的培养基培养的瓜蒌外植体的生长状态图；图2是实施例1制得的培养基培养的瓜蒌外植体的生长状态图。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。本发明提供了一种瓜蒌离体增殖培养基的制备方法，包括：1)将水加热至沸腾，接着加入琼脂进行溶解，然后加入糖、大量母液、微量母液、铁盐母液、有机母液、生长素以及细胞分裂素混合；2)向体系中加入水进行稀释，然后将体系ph调节至6.0-6.4以制得瓜蒌离体增殖培养基；其中，大量母液中含有硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙；微量母液中含有硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴；有机母液中含有甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇。硫酸锰。在上述技术方案中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高增殖培养基降低玻璃化以及感菌率的效果，优选地，步骤1)中的水、琼脂、糖、大量母液、微量母液、铁盐母液、有机母液、生长素以及细胞分裂素、步骤2)中的水的用量比为1l：6-8g：25-35g：45-55ml：8-12ml：8-12ml：8-12ml：0.48-0.52mg：0.38-0.42mg。在上述技术方案中，各个母液中各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高增殖培养基降低玻璃化以及感菌率的效果，优选地，在所述大量母液中，硝酸钾的浓度为35-40g/l、硝酸铵的浓度为30-35g/l；硫酸镁的浓度为5-10g/l、磷酸二氢钾的浓度为2-5g/l、氯化钙的浓度为7-9g/l；在所述微量母液中，硫酸锰的浓度为2.1-2.3g/l、硫酸锌的浓度为800-900mg/l、硼酸的浓度为600-650mg/l、碘化钾的浓度为80-85mg/l、钼酸钠的浓度为23-26mg/l、硫酸铜的浓度为2.3-2.6mg/l、氯化钴的浓度为2.3-2.6mg/l；在所述有机母液中，甘氨酸的浓度为190-220mg/l、盐酸硫胺素的浓度为8-12mg/l、盐酸吡哆素的浓度为49-52mg/l、盐酸的浓度为49-52mg/l、肌醇的浓度为9-11g/l；所述铁盐母液中铁盐的浓度为2700-2800mg/l。在本发明中，铁盐母液中铁盐的具体种类可以在宽的范围内变化，但是为了进一步提高增殖培养基降低玻璃化以及感菌率的效果，优选地，铁盐母液中铁盐选自硫酸亚铁、硝酸铁中的至少一者。在本发明中，生长素以及细胞分裂素的具体种类可以在宽的范围内变化，但是为了进一步提高增殖培养基降低玻璃化以及感菌率的效果，优选地，生长素为萘乙酸naa，细胞分裂素为6-苄基氨基嘌呤6-ba。本发明还提供了一种瓜蒌离体增殖培养基，该瓜蒌离体增殖培养基通过上述的制备方法制备而得。本发明进一步提供了一种瓜蒌继代培养方法，包括：1)将培养环境以及培养工具进行灭菌；2)将瓜蒌外植体置于上述瓜蒌离体增殖培养基中进行培养。在上述培养方法中，培养的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步降低玻璃化以及感菌率的效果，优选地，在步骤2)中，培养满足以下条件：温度为25-28℃，光照强度为2000-5000lx，光照时间为9-11h。在上述培养方法中，灭菌的方式可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高成活率，优选地，在步骤1)中，工作台以及无菌操作室采用紫外线照烧20-30min进行灭菌；接种工具先通过酒精擦拭，然后置于300-350℃中加热20-25min。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例11)将水加热至沸腾，接着加入琼脂进行溶解，然后加入糖、大量母液、微量母液、铁盐母液(2750mg/l的硫酸亚铁溶液)、有机母液、生长素(萘乙酸naa)以及细胞分裂素(6-苄基氨基嘌呤6-ba)混合；2)向体系中加入水进行稀释，然后将体系ph调节至6.2以制得瓜蒌离体增殖培养基；其中，步骤1)中的水、琼脂、糖、大量母液、微量母液、铁盐母液、有机母液、生长素以及细胞分裂素、步骤2)中的水的用量比为1l：7g：30g：50ml：10ml：10ml：10ml：0.50mg：0.40mg；大量母液中含有硝酸钾的浓度为38g/l、硝酸铵的浓度为33g/l；硫酸镁的浓度为8g/l、磷酸二氢钾的浓度为3g/l、氯化钙的浓度为8g/l；微量母液中含有，硫酸锰的浓度为2.2g/l、硫酸锌的浓度为850mg/l、硼酸的浓度为630mg/l、碘化钾的浓度为83mg/l、钼酸钠的浓度为25mg/l、硫酸铜的浓度为2.4mg/l、氯化钴的浓度为2.4mg/l；有机母液中含有，甘氨酸的浓度为200mg/l、盐酸硫胺素的浓度为10mg/l、盐酸吡哆素的浓度为50mg/l、盐酸的浓度为50mg/l、肌醇的浓度为10g/l。实施例21)将水加热至沸腾，接着加入琼脂进行溶解，然后加入糖、大量母液、微量母液、铁盐母液(2700mg/l的硫酸亚铁溶液)、有机母液、生长素(萘乙酸naa)以及细胞分裂素(6-苄基氨基嘌呤6-ba)混合；2)向体系中加入水进行稀释，然后将体系ph调节至6.0以制得瓜蒌离体增殖培养基；其中，步骤1)中的水、琼脂、糖、大量母液、微量母液、铁盐母液、有机母液、生长素以及细胞分裂素、步骤2)中的水的用量比为1l：6g：25g：45ml：8ml：8ml：8ml：0.48mg：0.38mg；大量母液中含有硝酸钾的浓度为35g/l、硝酸铵的浓度为30g/l；硫酸镁的浓度为5g/l、磷酸二氢钾的浓度为2g/l、氯化钙的浓度为7g/l；微量母液中含有，硫酸锰的浓度为2.1g/l、硫酸锌的浓度为800mg/l、硼酸的浓度为600mg/l、碘化钾的浓度为80mg/l、钼酸钠的浓度为23mg/l、硫酸铜的浓度为2.3mg/l、氯化钴的浓度为2.3mg/l；有机母液中含有，甘氨酸的浓度为190mg/l、盐酸硫胺素的浓度为8mg/l、盐酸吡哆素的浓度为49mg/l、盐酸的浓度为49mg/l、肌醇的浓度为9g/l。实施例31)将水加热至沸腾，接着加入琼脂进行溶解，然后加入糖、大量母液、微量母液、铁盐母液(2800mg/l的硫酸亚铁溶液)、有机母液、生长素(萘乙酸naa)以及细胞分裂素(6-苄基氨基嘌呤6-ba)混合；2)向体系中加入水进行稀释，然后将体系ph调节至6.4以制得瓜蒌离体增殖培养基；其中，步骤1)中的水、琼脂、糖、大量母液、微量母液、铁盐母液、有机母液、生长素以及细胞分裂素、步骤2)中的水的用量比为1l：8g：35g：55ml：12ml：12ml：12ml：0.52mg：0.42mg；大量母液中含有硝酸钾的浓度为40g/l、硝酸铵的浓度为35g/l；硫酸镁的浓度为10g/l、磷酸二氢钾的浓度为5g/l、氯化钙的浓度为9g/l；微量母液中含有，硫酸锰的浓度为2.3g/l、硫酸锌的浓度为900mg/l、硼酸的浓度为650mg/l、碘化钾的浓度为85mg/l、钼酸钠的浓度为26mg/l、硫酸铜的浓度为2.6mg/l、氯化钴的浓度为2.6mg/l；有机母液中含有，甘氨酸的浓度为220mg/l、盐酸硫胺素的浓度为12mg/l、盐酸吡哆素的浓度为52mg/l、盐酸的浓度为52mg/l、肌醇的浓度为11g/l。对比例1按照实施例1的方法进行，所不同的是将步骤1)中的水、琼脂、糖、大量母液、微量母液、铁盐母液、有机母液、生长素以及细胞分裂素、步骤2)中的水的用量比为1l：6-8g：25-35g：45-55ml：8-12ml：8-12ml：8-12ml：0.24mg：0.35mg。对比例2按照实施例1的方法进行，所不同的是将步骤1)中的水、琼脂、糖、大量母液、微量母液、铁盐母液、有机母液、生长素以及细胞分裂素、步骤2)中的水的用量比为1l：6-8g：25-35g：45-55ml：8-12ml：8-12ml：8-12ml：0.53mg：0.44mg。对比例3按照实施例1的方法进行，所不同的是，未使用生长素以及细胞分裂素。应用例11)将工作台以及无菌操作室采用紫外线照烧25min进行灭菌，将接种工具先通过酒精擦拭，然后置于330℃中加热23min，然后冷却待用；2)将瓜蒌外植体分别接种于上述实施例和对比例中的培养基中进行培养观察，然后统计成活率，患病率，具体见表1。其中，成活率的计算公式为成活率＝成活的数量÷总数量×100％，患病率的计算公式为患病率＝患病的数量÷成活后总数量×100％。表1培养基成活率/％患病率/％实施例185.7％7.1％实施例271.4％9.3％实施例378.6％7.0％对比例162.9％15.9％对比例261.5％14.3％其中，图2是实施例1制得的培养基培养的瓜蒌外植体的生长状态图，图1是对比例1制得的培养基培养的瓜蒌外植体的生长状态图；由图对比可知，图1中的幼苗只生根不长芽，感菌率还高，并且生长速度慢；图2的幼苗总体上比图1的生长效率要高。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页12