本发明属于农业技术，特别是涉及4′-氨基-2′-羟基苯乙酮在制备治疗农杆菌感染农药中的应用。
背景技术：
：：4′-氨基-2′-羟基苯乙酮(cas登记号：2476-29-1)是从石榴内生菌phomopsisliquidambari分离出来的一种化学成分，其结构式如下：4′-氨基-2′-羟基苯乙酮是工业生产工程中药物合成的中间体。根癌农杆菌(agriculturaltumefaciens)是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤，冠瘿瘤吸收植物营养，使得营养物质向植物体内的供给减少或阻断，导致植物萎蔫、死亡，引起农作物减产。冠瘿瘤的产生是ti质粒上的t-dna向植物组织中转移，并在植物细胞中大量表达，指导合成冠瘿碱，从而引起转化细胞癌变。研究表明，ti质粒的转移是受qs调控的，因此通过干扰根癌农杆菌qs信号来破坏细菌生物被膜，从而为最终解决由根癌农杆菌引起的农业病害问题提供全新的研究思路。根癌农杆菌的群体感应系统由trar和trai组成，trai能够催化合成信号分子n-(3-oxooctanoyl)-l-homoserinelactone(3-oxo-c8-hsl)，3-oxo-c8-hsl与转录调节子trar结合，形成的复合物能引起ti质粒的转移以及诱导毒力基因的表达，从而侵染植物。根癌农杆菌的鞭毛移动、趋化性以均受到qs的调控。因此，群体感应抑制剂在预防细菌感染方面的应用前景广阔。技术实现要素：发明目的：针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了4′-氨基-2′-羟基苯乙酮在预防和治疗农杆菌感染的抗感染制药用途。技术方案：本发明所述的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮在制备改善或者治疗农杆菌感染等感染相关疾病的农药中的应用。进一步的，所述4′-氨基-2′-羟基苯乙酮通过抑制冠瘿瘤形成达到抗感染目的。更进一步的，所述4′-氨基-2′-羟基苯乙酮通过抑制细菌群体感应从而抑制冠瘿瘤。更进一步的，所述4′-氨基-2′-羟基苯乙酮能够抑制细菌群体感应调控的信号分子的合成，能够抑制细菌群体感应调控的毒力因子的表达，能够抑制细菌群体感应相关基因的表达。有益效果：(1)本发明首次发现了4′-氨基-2′-羟基苯乙酮具有抑制根癌农杆菌感染的作用，并且在有效剂量下不抑制细菌的生长；(2)本发明首次发现了4′-氨基-2′-羟基苯乙酮能有效抑制根癌农杆菌引起的西红柿植株冠瘿瘤，预示着其具有较好的预防和治疗根癌农杆菌等细菌引起的农作物感染。附图说明图1是4′-氨基-2′-羟基苯乙酮对群体感应调控的信号分子合成的影响；图2是4′-氨基-2′-羟基苯乙酮对群体感应调控的毒力因子表达的影响；图3是4′-氨基-2′-羟基苯乙酮对群体感应相关基因的表达的抑制作用；图4是4′-氨基-2′-羟基苯乙酮对根癌农杆菌引起的西红柿冠瘿瘤的抑制作用。具体实施方式下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。药物：本实验所用4′-氨基-2′-羟基苯乙酮由石榴内生真菌phomopsisliquidambari的发酵产物中分离提取获得。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相50℃减压蒸干得粗提物，粗提物依次经过正相硅胶柱(ch3cl2:ch3oh＝20:1)、反向硅胶柱(ch3oh:h2o＝2:3)、正相硅胶柱(ch3cl2:ch3oh＝50:1)、以及hplc最终获得化合物4′-氨基-2′-羟基苯乙酮4.1mg。本领域技术人员采用的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮可直接购置于上海源叶生物科技有限公司。试剂：苯酚、单宁酸、鞭毛染色剂、lb培养基购置于上海生物工程股份有限公司，其它试剂为市售的分析纯试剂。菌株：根癌农杆菌c58由南京农业大学朱军教授惠赠。实施例1群体感应调控的信号分子的合成：用lb培养基复苏根癌农杆菌c58，划单菌落，接种根癌农杆菌c58单菌落到at培养基中(k2hpo410.5g，kh2po40.45g，mgso40.2g，feso45mg，cacl210mg，mncl22mg，(nh4)2so42g，d-甘露醇2g，琼脂8g，水1000ml，ph＝7.0)，28℃、200rpm过夜培养。调od620＝0.5，取调好od的菌液50μl以1:1000加入到50mlat培养基中，同时加入不同浓度的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮，28℃、200rpm培养24h。12,000rpm、4℃离心10min，上清液用相同体积的酸化的乙酸乙酯(含0.5％甲酸)萃取3遍，35℃减压蒸干，干燥物用甲醇溶解，lc/ms/ms测定信号分子的相对含量。根据离子碎片峰和保留时间确定信号分子的种类，根据峰面积进行相对含量的测定。试验结果如图1所示，其中a(a，b)为信号分子标准品3-oxo-c8-hsl的液相图谱，a(c-f)分别为12.5、25和50μgml-14′-氨基-2′-羟基苯乙酮处理后的信号分子3-oxo-c8-hsl的液相图谱，b为信号分子3-oxo-c8-hsl的ms/ms质谱图，c为12.5、25和50μgml-14′-氨基-2′-羟基苯乙酮处理后的信号分子3-oxo-c8-hsl的相对含量。***,p<0.001，vscontrol(spss18.0)，由此可见，4′-氨基-2′-羟基苯乙酮处理明显抑制群体感应调控的信号分子的合成，4′-氨基-2′-羟基苯乙酮具有良好的群体感应抑制活性，能很好的抑制细菌群体感应信号分子的合成，有效量为12.5-50μgml-1。实施例2对群体感应调控的毒力因子的表达的影响：接种根癌农杆菌c58单菌落到at培养基中，28℃、200rpm过夜培养。鞭毛的测定：调od620＝0.5，取调好od的菌液50μl以1:1000加入到50mlat培养基中，同时加入不同浓度的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮，以dmso为阴性对照。28℃、150rpm培养24h。取1μl培养液滴到洁净的盖玻片上，加入5μl鞭毛染色剂染色5min，吸去多余的染料，显微镜观察。试验结果：由图2a可知，与对照组比较，12.5、25和50μgml-1的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮能显著抑制鞭毛的生成，并且随着4′-氨基-2′-羟基苯乙酮浓度的增加，其抑制作用增加。swimming的测定：配置含0.25％琼脂的at固体培养基，向培养基中加入不同浓度的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮，倒平板，每个平板含15mlat固体培养基。取培养过夜的根癌农杆菌c58培养液1μl点在at固体培养基中央，25℃培养24h，观察生长情况，并测量其直径。试验结果：由图2b可知，与对照组比较，12.5、25和50μgml-1的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮能显著抑制swimming，并且随着4′-氨基-2′-羟基苯乙酮浓度的增加，其抑制作用增加。趋化性的测定：配置含0.25％琼脂的at固体培养基，向培养基中加入不同浓度的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮，倒平板，每个平板含15mlat固体培养基。取培养过夜的根癌农杆菌c58培养液1μl点在at固体培养基的一侧，在距离滴加的菌液4cm处放置一片无菌滤纸片，向滤纸片上滴加15％的葡萄糖溶液，直至其饱和。25℃培养96h，观察生长变化，并测量其直径。试验结果：由图2c可知，与对照组比较，12.5、25和50μgml-1的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮能显著抑制根癌农杆菌c58的趋化性，并且随着4′-氨基-2′-羟基苯乙酮浓度的增加，其抑制作用增加。实施例3对群体感应相关基因的表达的影响：接种根癌农杆菌c58单菌落到at培养基中，28℃、200rpm过夜培养。调od620＝0.5，取调好od的菌液50μl以1:1000加入到50mlat培养基中，同时加入不同浓度的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮，以dmso为阴性对照。28℃、200rpm培养24h。按照rneasyminikit试剂盒(天根生物，北京)介绍的方法提取总rna，按照rneasyminikit试剂盒介绍的方法进行rna逆转录实验，设定trar、trai、vira、virg及内参基因atu0241的引物(如表1所示)表1实验用引物table1primersusedinthisstudy(1)根据premixextaqtm(tlirnasehplus)kit建立qrt-pcr反应体系，如表2所示表2qrt-pcr反应体系table2qrt-pcrreaction(2)用appliedbiosystems7300real-timepcrsystem进行rt-pcr实验，反应循环参数如下：95℃，3min；95℃，3s，60℃，30s；实验需重复三次，每个实验需设四个重复。试验结果：由图3可知，4′-氨基-2′-羟基苯乙酮处理后，群体感应相关基因trai、trar、vira、virg均显著下降。实施例4冠瘿瘤抑制试验：接种根癌农杆菌c58单菌落到at培养基中，28℃、200rpm过夜培养。调od620＝0.5，取调好od的菌液50μl以1:1000加入到50mlat培养基中，同时加入不同浓度的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮，以dmso为阴性对照。28℃、200rpm培养24h。吸取培养后的菌液滴加在4周龄的西红柿幼苗的叶子上，正常条件下培养3周，观察冠瘿瘤的生长情况，切下冠瘿瘤，称重。试验结果：由图4a可知，12.5、25、50μgml-1的4′-氨基-2′-羟基苯乙酮处理，冠瘿瘤的形成明显降低，同时根据图4b可知在有效剂量下4′-氨基-2′-羟基苯乙酮可显著降低冠瘿瘤的重量。当前第1页12当前第1页12