本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种制备李、杏银叶病无菌接穗的方法。
背景技术
果树银叶病报道始见于上世纪50年代，是一种能导致果树快速死亡的毁灭性病害，在许多国家曾造成重大损失，在我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、河南、山东、山西、安徽、江苏、上海、浙江、湖北、四川、贵州、云南、甘肃等地均有发生。李、杏树上过去发生较少，近年在各地均有发生，四川一般李、杏园平均病株率为6%～12%，高者可达85%，危害日益严重。
银叶病侵染树体后，全树叶片呈现银灰色，光合作用受到显著影响，植株发芽迟、花期短；花易焦边、枯萎、早落，幼果僵硬增大缓慢，新梢停止生长早而细弱、继而枝干木质部变褐，根部发生腐烂，整株趋于死亡。由于近几年来银叶病发病较普遍又难以治愈，绝大部分果农不仅对此病了解甚少，在防治上更是缺乏相应措施，每年都有大批李、杏树感病死亡，造成果农损失，严重威胁这两种果树产业的发展。李、杏银叶病实际上属于枝干和根系病害，因其以病菌侵入枝干木质部，使木质部和髓部变为褐色，并分泌毒素传导至叶片，产生中毒反应，致叶肉细胞与表皮分离，其间隙充满空气，全叶呈浮肿状银灰色，故称银叶病。李、杏银叶病病原菌属担子菌亚门韧革菌真菌，其菌丝体寄生于枝干与根系的木质部内，以分泌毒素在寄主体内传导而产生为害。由于病菌存在于木质部内，对该病的防治相对困难，生产上通常采用页面喷药、树盘灌根、树干钻孔等三种方法进行防治，具有一定的治疗效果，但容易复发，不能彻底治愈，尤其是采用发病区域的枝条进行嫁接，基本上嫁接繁殖苗85%以上都会继续携带该病。对于如何获得银叶病无菌接穗目前国内外尚未见报道。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种制备李、杏银叶病无菌接穗的方法。本发明针对不同发病程度，采用安全、低毒的药物结合虹吸或真空填充技术，获得银叶病无菌接穗，操作简单、效果显著，具有实际应用价值。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备李、杏银叶病无菌接穗的方法，包括带叶片的生长期绿枝接穗和不带叶片的休眠期硬枝接穗，其特征在于，制备所述带叶片的生长期绿枝接穗，包括以下步骤：
s1.选择表皮呈红褐色的一年生老熟枝条中枝条基部8个芽至上部6个芽之间芽分化饱满的茎段，取40cm～50cm长，将其下部切成斜马蹄状，上部切成平面后，平放入灭菌液a中浸泡1～2分钟，之后清水洗净待用；
s2.在光照、温度为30～35℃条件下，将清洗过后的枝条底部浸入硫酸-8-羟基喹啉溶液中，叶部使用芸苔素内酯溶液进行叶面喷雾一次，25～30小时后取出枝条；
s3.将枝条底部插入蒜泥溶液中6小时，之后即可作为接穗使用；
制备所述不带叶片的休眠期硬枝接穗，包括以下步骤：
s1.选择表皮呈红褐色的一年生老熟春梢中枝条基部8个芽至上部6个芽之间芽分化饱满的茎段，取40cm～50cm长，将其下部切成斜马蹄状，上部切成平面后，平放入灭菌液b中浸泡10～12分钟，之后清水洗净待用；
s2.在真空、温度为20～25℃条件下，将清洗过后的枝条底部浸入硫酸-8-羟基喹啉溶液中，其中真空条件为，以一片柑橘叶浸入硫酸-8-羟基喹啉溶液中作为指示，慢慢抽真空，当叶片表面无气泡冒出并沉到溶液底部时即可，缓慢放真空直至真空度为0；
s3.将枝条取出，于4℃中放置24小时后，插入蒜泥溶液中6小时，之后即可作为接穗使用。
进一步的，所述灭菌液a为70%甲基硫菌灵1200倍液，即为70%甲基硫菌灵的1200倍稀释液。
进一步的，所述灭菌液b为2～3°bé石硫合剂溶液。
进一步的，所述蒜泥溶液的配置方法为：选择去皮后的红皮大蒜1斤，在器皿中捣烂成泥，加入250ml纯净水，摇匀后过滤使用得蒜泥溶液。
进一步的，所述硫酸-8-羟基喹啉溶液的浓度为0.5%。
进一步的，所述芸苔素内酯溶液的浓度为0.01-0.05mg/kg。
进一步的，所述带叶片的生长期绿枝接穗制备时间为当年春季萌芽后至次年秋季落叶前；所述不带叶片的休眠期硬枝接穗制备时间为当年秋季落叶后至次年春季萌芽前。
进一步的，所述光照包括人工光照和自然光照中的一种或两种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明内外兼治，效果显著，既考虑到了枝条表皮所携带病原菌及其他病害的消毒，又针对银叶病通过木质部进行传播危害的特性，采用虹吸或抽真空的方式，使药液直接进入木质部产生作用，迅速高效效消灭病菌，采用该技术处理后的枝条无菌率达95%以上，采用该枝条作为接穗进行嫁接的李、杏嫁接苗银叶病发病率仅为2%～5%；
（2）本发明省时省工、操作简单，使用的设备都是实验室或生产上很容易获得的，成本较低，整个处理过程不超过48小时，对技术要求不高，便于掌握和应用，具有普遍推广的可行性；
（3）本发明针对性强，安全环保，以李树和杏树银叶病为对象，针对的树种和病害单一，根据不同时期接穗的生长状况和特性采用不同的方法处理，采用的溶液和试剂包括常规蔬菜、广谱性杀菌剂等，低毒低残留，针对性强，没有明显安全隐患。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例一
2014年5月，取5年生患有银叶病的李树树冠外围光照条件较好的一年生老熟枝条10枝，枝条基部8个芽至上部6个芽之间芽分化饱满的茎段，取50cm长，下部切成斜马蹄状，上部切成平面；枝条平放入浓度为70%甲基硫菌灵1200倍液中浸泡1分钟，之后清水冲洗3次，插入瓶中待用。白天保持室温32℃，烧杯中放入0.5%的硫酸-8-羟基喹啉溶液深度3cm，将枝条一枝枝分别插到试管架上，枝条底部浸入溶液中，叶部喷施0.05mg/kg的芸苔素内酯溶液进行叶面喷雾一次，25个小时后取出枝条，将枝条底部插入蒜泥溶液中6小时，所述蒜泥溶液的配置方法为，选择去皮后的红皮大蒜1斤，在器皿中捣烂成泥，加入250ml纯净水，摇匀后过滤使用得蒜泥溶液，之后即可作为接穗，嫁接繁殖使用。以毛桃为砧木嫁接50株苗木，2017年调查只有3株染银叶病，其余均正常。
实施例二
2014年2月，取5年生李树树冠外围光照条件较好的一年生充分老熟春梢10枝，枝条基部8个芽至上部6个芽之间芽分化饱满的茎段，取40cm长，下部切成斜马蹄状，上部切成平面；枝条平放入浓度为2°bé的石硫合剂溶液中浸泡10分钟，之后清水冲洗3次，插入瓶中待用。使用真空干燥器，往真空干燥器中倒入3cm深的质量分数为0.5%的硫酸-8-羟基喹啉溶液，将枝条一枝枝分别插到试管架上，枝条底部浸入溶液，溶液里浸入一片柑橘叶作为指示，在室温25℃条件下慢慢抽真空，当叶片表面无气泡冒出并沉到溶液底部时，慢慢打开阀门。将枝条从干燥器中取出，4℃冰箱存放24小时后，插入蒜泥溶液中6小时，之后即可作为接穗，嫁接繁殖使用。以毛桃为砧木嫁接20株苗木，2017年调查调查无一株染银叶病。
实施例三
2015年5月，取7年生患有银叶病的杏树树冠外围光照条件较好的一年生老熟枝条20枝，枝条基部8个芽至上部6个芽之间芽分化饱满的茎段，取40cm～50cm长，下部切成斜马蹄状，上部切成平面；枝条平放入浓度为70%甲基硫菌灵1200倍液中浸泡1分钟，之后清水冲洗3次，插入瓶中待用。白天保持室温32℃，烧杯中放入0.5%的硫酸-8-羟基喹啉溶液3cm，将枝条一枝枝分别插到试管架上，枝条底部浸入溶液中，叶部喷施0.01mg/kg的芸苔素内酯溶液进行叶面喷雾一次，25个小时后取出枝条。将枝条从烧杯中取出，底部插入蒜泥溶液中6小时，之后即可作为接穗，嫁接繁殖使用。以山杏为砧木嫁接30株苗木，2017年调查只有2株染银叶病，其余均正常。
实施例四
2015年2月，取7年生杏树树冠外围光照条件较好的一年生充分老熟春梢20枝，枝条基部8个芽至上部6个芽之间芽分化饱满的茎段，取40cm长，下部切成斜马蹄状，上部切成平面；枝条平放入浓度为3°bé石硫合剂溶液中浸泡10分钟，之后清水冲洗3次，插入瓶中待用。使用pc真空干燥器t250-ii真空干燥器，干燥器下部倒入3cm深的质量分数为0.5%的硫酸-8-羟基喹啉溶液，将枝条一枝枝分别插到试管架上，枝条底部浸入溶液，溶液里浸入一片柑橘叶作为指示，在室温25℃条件下慢慢抽真空，当叶片表面无气泡冒出并沉到溶液底部时，慢慢打开阀门。将枝条从干燥器中取出，4℃冰箱存放24小时后，插入蒜泥溶液中6小时，之后即可作为接穗，嫁接繁殖使用。采用培养基分离检测，20只枝接穗均未检测出银叶病病菌。