一种降低受体贝移植免疫排斥的方法与流程

本发明涉及一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，尤其涉及一种利用霉酚酸酯降低受体贝移植免疫排斥的方法，属于海水珍珠养殖技术领域。

背景技术：

人工培育海水珍珠即模仿天然珍珠的形成过程，通过手术将供体贝的外套膜小片组织和一个圆形的珠核一起移植到受体贝的内脏团结缔组织中。随后，细胞小片组织与受体贝组织相互作用，上皮细胞逐渐增殖、分化，形成包围珠核的珍珠囊。珍珠囊不断分泌珍珠质，沉积在珠核表面形成珍珠。在生产中，常常利用细胞小片保养液提高育珠效益，其原理主要是维持小片活性，促进细胞增殖以及避免感染。

细胞小片和珠核的植入过程类似于高等生物的器官移植，在移植后初期，植入的异体外套膜组织和珠核会引起受体贝的移植排斥反应，在移植后约10-15天，一部分受体贝逐渐接受植入的小片组织和珠核，建立免疫耐受，形成包围珠核的珍珠囊。在该过程中，过强的排斥反应会导致珍珠囊发育异常以及受体贝的吐核，甚至是受体贝死亡，从而降低珍珠的质量和产量。

因此，有效调控珍珠贝植核后的移植排斥，促成珍珠贝的免疫耐受，是珍珠产业持续发展中迫切需要解决的问题，而现有生产技术尚未有针对性方案。

免疫抑制剂是一类可抑制机体异常免疫反应的药物，其在临床上主要用于防止器官移植时的排斥反应。霉酚酸酯(mycophenolatemofetil，mmf)，又名吗替麦考酚酯，是一种毒性小，免疫抑制作用强的免疫抑制剂，目前已被广泛应用于临床器官移植领域，使器官移植的成功率大大提高。研究表明，mmf在生物体内首先转换成活性代谢产物霉酚酸(mycophenolicacid，mpa)。mpa能可逆地抑制鸟嘌呤核苷三磷酸腺苷从头合成途径的限速酶-次黄嘌呤核苷酸脱氢酶，从而减少细胞内的鸟嘌呤核苷酸，阻断dna的合成，抑制免疫细胞的增生。同时，mmf还可以通过抑制免疫细胞表面粘附分子的形成，抑制免疫细胞向炎症部位的聚集。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供了一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过细胞小片和珠核将霉酚酸酯溶液带入受体贝体内，利用霉酚酸酯对受体贝免疫反应的抑制作用，加快受体贝从免疫排斥向免疫耐受转化促进细胞小片存活和细胞增生，从而促进珍珠囊形成，提高留核率和成珠率，以提高珍珠产量。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过以下步骤将免疫抑制剂霉酚酸酯带入受体贝体内：(1)将霉酚酸酯溶解于基础液配置为霉酚酸酯溶液；(2)制作海水珍珠贝外套膜小片，将霉酚酸酯溶液滴加在外套膜小片上浸润；(3)将珠核浸润于霉酚酸酯溶液；(4)按常规方法将外套膜小片和珠核植入受体贝内脏团；(5)利用喷雾器对受体贝植核部位进行喷雾；(6)按常规方法进行养殖育珠；

上述霉酚酸酯溶液含有0.20％-0.35％的霉酚酸酯；上述基础液以每升灭菌海水溶解葡萄糖3-5克，复合氨基酸1-3克，抗生素0.1-0.15克配置而成；上述喷雾的溶液为基础液；上述受体贝为马氏珠母贝、大珠母贝、珠母贝或企鹅珍珠贝；上述抗生素为青霉素+链霉素、氟苯尼考+强力霉素或者盐酸恩诺沙星。

本发明的有益效果是，该方法将免疫抑制剂霉酚酸酯应用于育珠生产，适当降低受体贝在植核手术后的移植免疫排斥反应，加快受体贝从免疫排斥向免疫耐受转化，促进珍珠囊形成，从而提高珍珠产量。

附图说明

图1为霉酚酸酯组和对照组育珠贝血细胞免疫相关基因表达量比较；(a)为霉酚酸酯处理对核因子κb抑制蛋白激酶(inhibitorofnf-κbkinases，ikk)基因表达的影响，(b)为霉酚酸酯处理对核因子κb(nuclearfactorkb，nf-κb)基因表达的影响。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过以下步骤将免疫抑制剂霉酚酸酯带入马氏珠母贝体内：(1)将霉酚酸酯溶解于基础液配置为0.20％霉酚酸酯溶液；(2)制作马氏珠母贝外套膜小片，将霉酚酸酯溶液滴加在外套膜小片上浸润；(3)将珠核浸润于霉酚酸酯溶液；(4)按常规方法将外套膜小片和珠核植入马氏珠母贝内脏团；(5)利用喷雾器对马氏珠母贝植核部位进行基础液喷雾；(6)按常规方法进行养殖育珠；所述的基础液以每升灭菌海水溶解葡萄糖3克，复合氨基酸1克，盐酸恩诺沙星0.1克配置而成。

实施例2

一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过以下步骤将免疫抑制剂霉酚酸酯带入大珠母贝体内：(1)将霉酚酸酯溶解于基础液配置为0.35％霉酚酸酯溶液；(2)制作大珠母贝外套膜小片，将霉酚酸酯溶液滴加在外套膜小片上浸润；(3)将珠核浸润于霉酚酸酯溶液；(4)按常规方法将外套膜小片和珠核植入大珠母贝内脏团；(5)利用喷雾器对大珠母贝植核部位进行基础液喷雾；(6)按常规方法进行养殖育珠；所述的基础液以每升灭菌海水溶解葡萄糖5克，复合氨基酸3克，盐酸恩诺沙星0.15克配置而成。

实施例3

一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过以下步骤将免疫抑制剂霉酚酸酯带入珠母贝体内：(1)将霉酚酸酯溶解于基础液配置为0.3％霉酚酸酯溶液；(2)制作珠母贝外套膜小片，将霉酚酸酯溶液滴加在外套膜小片上浸润；(3)将珠核浸润于霉酚酸酯溶液；(4)按常规方法将外套膜小片和珠核植入珠母贝内脏团；(5)利用喷雾器对珠母贝植核部位进行基础液喷雾；(6)按常规方法进行养殖育珠；所述的基础液以每升灭菌海水溶解葡萄糖4克，复合氨基酸2克，盐酸恩诺沙星0.2克配置而成。

实施例4

时间：2016年5月25日插核，2017年1月7日收珠

地点：徐闻县大井村

实验方法：一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过以下步骤将免疫抑制剂霉酚酸酯带入马氏珠母贝体内：(1)将霉酚酸酯溶解于基础液配置0.25％霉酚酸酯溶液；(2)制作马氏珠母贝外套膜小片，将霉酚酸酯溶液滴加在外套膜小片上浸润；(3)将珠核浸润于霉酚酸酯溶液；(4)按常规方法将外套膜小片和珠核植入马氏珠母贝内脏团；(5)利用喷雾器对马氏珠母贝植核部位进行基础液喷雾；(6)按常规方法进行养殖育珠；基础液以每升灭菌海水溶解葡萄糖4克，复合氨基酸2克，盐酸恩诺沙星0.15克配置而成。

试验设计：霉酚酸酯组和对照组(常规生产技术)各插核2000只，各组均由相同的小片技术员和插核技术员制作细胞小片及插核。

育珠性能比较：霉酚酸酯组存活率、留核率与平均珍珠层厚度分别提高了7.9％、24.5％、8.0％。

表1实施例4各组育珠性能测试

实施例5

时间：2017年4月22日插核，在插核后第6h，12h，1d，3d，6d，12d，18d，30d进行取样。

地点：徐闻县大井村

实验方法：一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过以下步骤将免疫抑制剂霉酚酸酯带入马氏珠母贝体内：(1)将霉酚酸酯溶解于基础液配置0.30％霉酚酸酯溶液；(2)制作马氏珠母贝外套膜小片，将霉酚酸酯溶液滴加在外套膜小片上浸润；(3)将珠核浸润于霉酚酸酯溶液；(4)按常规方法将外套膜小片和珠核植入马氏珠母贝内脏团；(5)利用喷雾器对马氏珠母贝植核部位进行基础液喷雾；(6)按常规方法进行养殖育珠；基础液以每升灭菌海水溶解葡萄糖4克，复合氨基酸2克，盐酸恩诺沙星0.15克配置而成。

试验设计：霉酚酸酯组插核100只，对照组按照常规生产技术插核100，各组均由相同的小片技术员和插核技术员制作细胞小片及插核。在上述各时间点分别取育珠贝血细胞，提取rna，利用荧光定量pcr的方法检测免疫相关基因ikk和nf-kb的表达。

结果：如图1所示，与对照组相比，在插核后3d天到12天，霉酚酸酯处理显著性降低了ikk和nf-κb的表达。ikk和nf-κb均为nf-κb信号通路中的关键成分，其表达降低说明霉酚酸酯处理可显著性降低插核贝的免疫排斥反应，避免过强的免疫反应对珍珠贝产生损伤。同列柱上标不同小写字母表示有显著差异(p<0.05)。

实施例6

时间：2017年11月15-16日插核，2018年9月18日收珠

地点：徐闻县大井村

实验方法：一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过以下步骤将免疫抑制剂霉酚酸酯带入马氏珠母贝体内：(1)将霉酚酸酯溶解于基础液配置0.30％霉酚酸酯溶液；(2)制作马氏珠母贝外套膜小片，将霉酚酸酯溶液滴加在外套膜小片上浸润；(3)将珠核浸润于霉酚酸酯溶液；(4)按常规方法将外套膜小片和珠核植入珠母贝内脏团；(5)利用喷雾器对珠母贝植核部位进行基础液喷雾；(6)按常规方法进行养殖育珠；基础液以每升灭菌海水溶解葡萄糖5克，复合氨基酸2克，盐酸恩诺沙星0.2克配置而成。

试验设计：霉酚酸酯组插核5000只，对照组按照常规生产技术插核3000只，各组均由相同的小片技术员和插核技术员制作细胞小片及插核。

育珠性能比较：霉酚酸酯组存活率和商品珠率与对照组基本一致，但留核率提高了27.5％，优珠率提高了17.8％，每万贝商品珠产量提高了23.2％。

表2实施例6各组育珠性能测试

实施例7

时间：2017年8月25日插核，2018年8月15日收珠

地点：徐闻县承梧村

实验方法：一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，该方法通过以下步骤将免疫抑制剂霉酚酸酯带入大珠母贝体内：(1)将霉酚酸酯溶解于基础液配置为0.35％霉酚酸酯溶液；(2)制作大珠母贝外套膜小片，将霉酚酸酯溶液滴加在外套膜小片上浸润；(3)将珠核浸润于霉酚酸酯溶液；(4)按常规方法将外套膜小片和珠核植入“左袋”(肠道回曲处前方和缩足肌腹面的地方)；(5)利用喷雾器对植核部位进行基础液喷雾；(6)按常规方法进行养殖育珠，基础液为每升灭菌海水溶解葡萄糖5克，复合氨基酸3克，盐酸恩诺沙星0.15克配置而成。

试验设计：霉酚酸酯组和对照组(常规生产技术)各插核300只，外套膜小片与植核操作分别同一个技术员完成；植核母贝来源于三亚养殖群体，母贝壳长14-16cm。

育珠性能比较：霉酚酸酯组存活率、留核率、商品珠率与平均珍珠层厚度分别提高了10.7％、18.5％、13.2％与12.1％。

表3实施例7各组育珠性能测试

通过以上具体实施例，可以得出结论，霉酚酸酯可显著性降低插核贝的免疫排斥反应，避免过强的免疫反应对珍珠贝产生损伤，促进珍珠囊形成，从而提高珍珠产量。