一种植物通用型增殖培养基及组织培养方法与流程

本发明属于林木繁殖技术领域，具体涉及一种植物通用型增殖培养基及组织培养方法。

背景技术

植物的组织培养是根据植物细胞全能性理论，近几十年来发展较快的一项无性快繁新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在无菌条件下接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。但是在进行增殖时，往往以20～30d甚至更长的时间为一个增殖周期，增殖系数也较低。目前并没有一种可以通用型增殖培养基既可以缩短增殖周期，还可以提高增殖系数。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物通用型增殖培养基以及基于该培养基的植物组织培养方法，缩短增殖培养时间到7～10天，增殖系数达6～8，且增殖不定芽生长发育正常。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种植物通用型增殖培养基，所述增殖培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：卡拉胶6.0～10.0g/l，蔗糖32.0～50.0g/l，肌醇0.02～0.06g/l，6-ba1.0～1.5mg/l和naa0.015mg/l，所述植物通用型增殖培养基的ph值为5.8～6.0。

本发明提供了一种基于上述植物通用型增殖培养基的植物组织培养方法，包括以下步骤：

1)选植物幼嫩组织为外植体，消毒后得消毒外植体；

2)将步骤1)得到的所述消毒外植体接种到分化初始培养基上进行分化培养，得分化不定芽；所述分化培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：卡拉胶6.0～10.0g/l，蔗糖32.0～50.0g/l，肌醇0.02～0.06g/l，6-ba0.5mg/l和naa0.1mg/l；

3)将步骤2)得到的所述分化不定芽接种到上述技术方案所述增殖培养基上进行增殖培养，得增殖不定芽；

4)将步骤3)得到的所述增殖不定芽接种到生根培养基上进行生根培养；所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：卡拉胶6.0～10.0g/l，蔗糖32.0～50.0g/l，肌醇0.03～0.08g/l，iba0.3～0.7mg/l和naa0.1mg/l。

优选的，步骤1)所述植物包括构属、鹅掌楸属和杨属黑杨派。

优选的，步骤1)所述幼嫩组织包括幼嫩顶芽或侧芽。

优选的，步骤2)所述分化培养的培养温度为25±2℃，光照强度为1000～1500lx，光照时间为7～13h/d，空气湿度为75～80％。

优选的，所述分化培养的培养时间为25～35d。

优选的，步骤3)所述增殖培养的培养温度为25±2℃，光照强度为1000～1500lx，光照时间为7～13h/d，空气湿度为75～80％。

优选的，所述增殖培养的时间为5～9d。

优选的，步骤4)所述生根培养的培养温度为25±2℃，光照强度为1000～1500lx，光照时间为7～13h/d，空气湿度为75～80％。

优选的，所述生根培养的时间为36～45d。

本发明提供了一种植物通用型增殖培养基，在本发明实施例中，利用所述增殖培养基进行构属、鹅掌楸属和杨属黑杨派的增殖培养时，可以把增殖培养时间缩短到7～10天，增殖系数达6～8，显著提高了增殖系数，缩短增殖培养时间。

附图说明

图1为利用本发明所述增殖培养基增殖构树组培苗结果图；

图2为利用常规增殖培养基增殖构树组培苗结构图。

具体实施方式

本发明提供了一种植物通用型增殖培养基，所述增殖培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：卡拉胶6.0～10.0g/l，蔗糖32.0～50.0g/l，肌醇0.02～0.06g/l，6-ba1.0～1.5mg/l和naa0.015mg/l，所述植物通用型增殖培养基的ph值为5.8～6.0。

在本发明所述植物通用型增殖培养基中包含卡拉胶，所述卡拉胶在所述增殖培养基中的浓度优选为6.5～9.4g/l，更优选为7.2～8.5g/l，最优选为8g/l。本发明所述卡拉胶可使培养基凝固并且提高培养基透明度。本发明对所述卡拉胶的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规组织培养用卡拉胶即可。

在本发明所述植物通用型增殖培养基中包含蔗糖，所述蔗糖在所述增殖培养基中的浓度优选为35～48g/l，更优选为38～42g/l，最优选为40g/l。本发明所述蔗糖提供植物生长糖类营养。本发明对所述蔗糖的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。

在本发明所述植物通用型增殖培养基中包含肌醇，所述肌醇在所述增殖培养基中的浓度优选为0.026～0.055g/l，更优选为0.034～0.045g/l，最优选为0.04g/l。本发明所述肌醇可以参与植物碳水化合物等生理代谢过程。本发明对所述肌醇的来源并没有特殊限定，利用本领域常规市售产品即可。

在本发明所述植物通用型增殖培养基中包含6-ba植物激素，所述6-ba在所述增殖培养基中的浓度优选为1.1～1.4mg/l，更优选为1.2～1.3mg/l，最优选为1.25mg/l。本发明所述6-ba可以提高组培增殖系数。本发明对所述6-ba的来源并没有特殊限定，利用本领域常规市售产品即可。

在本发明所述植物通用型增殖培养基中包含naa植物激素，所述naa辅助提高组培增殖系数。本发明对所述naa的来源并没有特殊限定，利用本领域常规市售产品即可。在本发明中，较高的6-ba/naa外源植物激素比例有利于提高增殖系数，该配方综合成分缩短了增殖培养时间。

本发明提供了一种基于上述植物通用型增殖培养基的植物组织培养方法，包括以下步骤：

1)选植物幼嫩组织为外植体，消毒后得消毒外植体；

2)将步骤1)得到的所述消毒外植体接种到分化初始培养基上进行分化培养，得分化不定芽；所述分化初始培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：卡拉胶6.0～10.0g/l，蔗糖32.0～50.0g/l，肌醇0.02～0.06g/l，6-ba0.5mg/l和naa0.1mg/l；

3)将步骤2)得到的所述分化不定芽接种到上述技术方案所述增殖培养基上进行增殖培养，得增殖不定芽；

4)将步骤3)得到的所述增殖不定芽接种到生根培养基上进行生根培养；所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：卡拉胶6.0～10.0g/l，蔗糖32.0～50.0g/l，肌醇0.03～0.08g/l，iba0.3～0.7mg/l和naa0.1mg/l。

在本发明所述植物组织培养方法中，选植物幼嫩组织为外植体，消毒后得消毒外植体。本发明所述植物优选包括构属、鹅掌楸属和杨属黑杨派。本发明所述幼嫩组织优选包括幼嫩顶芽或侧芽，本发明对所述幼嫩组织的来源并没有特殊限定。本发明对所述消毒的方法并没有特殊限定，优选用流水冲洗10分钟，洗衣粉液浸泡5分钟，用无菌水清洗3次，在70％酒精中浸泡1分钟，0.1％升汞消毒4分钟，无菌水冲洗3～5次。

得消毒外植体后，本发明将所述消毒外植体接种到分化初始培养基上进行分化培养，得分化不定芽；所述分化初始培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：卡拉胶6.0～10.0g/l，蔗糖32.0～50.0g/l，肌醇0.02～0.06g/l，6-ba0.5mg/l和naa0.1mg/l。本发明所述接种前优选还包括对所述消毒外植体进行裁剪，使消毒外植体长约3～4公分。本发明对所述ms培养基的来源并没有特殊限定。本发明所述分化初始培养基包括卡拉胶，所述卡拉胶在所述分化初始培养基中的浓度优选为6.5～9.4g/l，更优选为7.2～8.5g/l，最优选为8g/l。本发明所述卡拉胶可使培养基凝固并且提高培养基透明度。本发明所述分化初始培养基包括蔗糖，所述蔗糖在所述分化初始培养基中的浓度优选为35～46g/l，更优选为38～42g/l，最优选为40g/l。本发明所述蔗糖提供植物生长糖类营养。本发明所述分化初始培养基包括肌醇，所述肌醇在所述分化初始培养基中的浓度优选为为0.025～0.058g/l，更优选为0.032～0.046g/l，最优选为0.04g/l。本发明所述肌醇可以参与植物碳水化合物等生理代谢过程。本发明所述分化初始培养基中包含6-ba，所述6-ba可以提高组培增殖系数。本发明所述分化初始培养基中包含naa，所述naa辅助提高组培增殖系数。本发明对所述分化初始培养基的各组分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明在所述分化初始培养基上进行分化培养，所述分化培养的温度优选为25±2℃。本发明所述分化培养的光照强度优选为1000～1500lx，更优选为1100～1250lx，最优选为1200lx。本发明所述分化培养的光照时间优选为7～13h/d，更优选为8～12h/d，最优选为10h/d。本发明所述分化培养的空气湿度优选为75～80％。本发明所述分化培养的培养时间优选为25～35d，更优选为28～32d，最优选为30d。

得分化不定芽后，本发明将所述分化不定芽接种到上述增殖培养基上进行增殖培养，得增殖不定芽。本发明所述增殖培养的培养温度优选为25±2℃。本发明所述增殖培养的光照强度优选为1000～1500lx，更优选为1100～1250lx，最优选为1200lx。本发明所述增殖培养的光照时间优选为7～13h/d，更优选为8～12h/d，最优选为10h/d。本发明所述增殖培养的空气湿度优选为75～80％。本发明所述增殖培养的培养时间优选为5～9d，更优选为6～8d，最优选为10d。

得增殖不定芽后，本发明将所述不定芽接种到生根培养基上进行生根培养；所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：卡拉胶6.0～10.0g/l，蔗糖32.0～50.0g/l，肌醇0.03～0.08g/l，iba0.3～0.7mg/l和naa0.1mg/l。本发明所述生根培养基中包含卡拉胶，所述卡拉胶在所述生根培养基中的浓度优选为6.5～9.6g/l，更优选为7.6～8.4g/l，最优选为8g/l。本发明所述卡拉胶可使培养基凝固并且提高培养基透明度。本发明所述生根培养基包括蔗糖，所述蔗糖在所述生根培养基中的浓度优选为35～46g/l，更优选为38～42g/l，最优选为40g/l。本发明所述蔗糖提供植物生长糖类营养。本发明所述生根培养基包括肌醇，所述肌醇在所述生根培养基中的浓度优选为为0.035～0.078g/l，更优选为0.042～0.065g/l，最优选为0.05g/l。本发明所述肌醇可以参与植物碳水化合物等生理代谢过程。本发明所述生根培养基中包含iba，所述6-ba在所述生根培养基中的浓度优选为0.3～0.7mg/l，更优选为0.4～0.6mg/l，最优选为0.5mg/l。本发明所述6-ba可以提高组培增殖系数。本发明所述生根培养基中包含naa，所述naa辅助提高组培增殖系数。本发明对所述生根培养基中的各原料来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明在所述生根培养基上进行生根培养，所述生根培养的培养温度优选为25±2℃。本发明所述生根培养的光照强度优选为1000～1500lx，更优选为1100～1250lx，最优选为1200lx。本发明所述生根培养的光照时间优选为7～13h/d，更优选为8～12h/d，最优选为10h/d。本发明所述生根培养的空气湿度优选为75～80％。本发明所述生根培养的培养时间优选为36～45d，更优选为38～42d，最优选为40d。

下面结合实施例对本发明提供的构树增殖培养基以及基于该培养基的构树组织培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

选构树新嫩侧芽为外植体，先用流水冲洗10分钟，洗衣粉液浸泡5分钟，用无菌水清洗3次，在70％酒精中浸泡1分钟，0.1％升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次后待接种。

在无菌接种台作业，将已消毒外植体留1～2小叶构树侧芽，长约4公分的外植体接种到分化培养基上(ms+卡拉胶8.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+激素6ba0.5mg/l+naa0.1mg/l，ph5.8)每瓶3株，进行培养，培养30天后转入增殖培养基。

在无菌接种台作业，将构树不定芽，接种到增殖培养基(ms+卡拉胶8.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+激素6ba1.0mg/l+naa0.015mg/l，ph5.9)上，每瓶10株，培养10天完成一次增殖不定芽，增殖结果如图1所示，增殖系数达8。

将增殖培养基上生长正常的增殖不定芽，在无菌接种台作业，接种到生根培养基(1/2ms+卡拉胶8.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.05g/l+iba0.5mg/l+naa0.1mg/l，ph5.8)上，培养40天后生根，生根率为35％。

对比例：除与实施例1的增殖培养基组成不同外，其余操作均相同：将构树不定芽接种到对比增殖培养基(ms+琼脂6.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+6-ba0.5mg/l+naa0.015mg/l，ph5.8)上，每瓶10株，培养30天完成一次增殖，增殖结果如图2所示，增殖系数达4。

实施例2

将鹅掌楸种子发芽出土生长30天后幼苗顶芽剪下作为外植体，先用流水冲洗10分钟，洗衣粉液浸泡5分钟，用无菌水清洗3次，在70％酒精中浸泡1分钟，0.1％升汞消毒4分钟,无菌水冲洗4次后待接种。

在无菌接种台作业，将已消毒外植体留1～2叶鹅掌楸顶芽嫩茎，长约4公分的外植体接种到分化培养基上(ms+含卡拉胶8.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+激素6ba0.5mg/l+naa0.1mg/l，ph5.8)每瓶4株，进行培养，培养30天后转入增殖培养基。

在无菌接种台作业，将外植体初代分化培养基上生长正常未污染鹅掌楸新萌嫩茎，接种到增殖培养基(ms+卡拉胶8.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+激素6ba1.2mg/l+naa0.015mg/l，ph5.8-6.0)上，每瓶10株，培养7天完成一次增殖，增殖系数达6。

对比例：除增殖培养基组成不同外，其余操作均相同：将外植体初代分化培养基上生长正常未污染鹅掌楸新萌嫩茎接种在对比例增殖培养基(ms+琼脂6.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+激素6ba0.5mg/l+naa0.015mg/l，ph5.8)上，每瓶10株，培养30天完成一次增殖，增殖系数达4。

实施例3

将购买的黑杨组培瓶苗，在组培室培养7天后。在无菌接种台作业，剪下黑杨组培瓶苗不定芽，接种到增殖培养基(ms+卡拉胶8.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+激素6ba1.0mg/l+naa0.015mg/l，ph5.8-6.0)上，每瓶10株，培养10天后完成一次增殖，增殖系数达7。

对比例：出增殖培养基组成不同外，其余条件与实施例3均相同，将黑杨组培瓶苗不定芽接种到对比例增殖培养基(ms+琼脂6.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+6-ba0.5mg/l+naa0.015mg/l，ph5.8)上，每瓶10株，培养30天完成一次增殖，增殖系数达4。

实施例4

将购买的黑杨组培瓶苗，在组培室培养7天后。在无菌接种台作业，剪下黑杨组培瓶苗不定芽，接种到增殖培养基(ms+卡拉胶8.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+激素6ba1.5mg/l+naa0.015mg/l，ph6.0)上，每瓶10株，培养7天后完成一次增殖，增殖系数达7。

对比例：出增殖培养基组成不同外，其余条件与实施例4均相同，将黑杨组培瓶苗不定芽接种到增殖培养基(ms+琼脂6.0g/l+蔗糖40.0g/l+肌醇0.04g/l+6-ba0.5mg/l+naa0.015mg/l，ph5.8)上，每瓶10株，培养30天完成一次增殖，增殖系数达4。

由上述实施例可知，本发明提供了一种植物通用型增殖培养基以及基于该3种植物通用型培养基的组织培养方法，利用该植物通用型增殖培养基，可在7～10d内完成一次增殖，且增殖系数为6～8。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。