一种牛大力的培育方法与流程

本发明属于植物培育种植技术领域，具体是一种中药牛大力的培育方法。

背景技术：

牛大力（millettiaspecisoachamp.），别名猪脚笠、金钟根、山莲藕、倒吊金钟、大力薯；为豆科崖豆藤属植物——美丽崖豆藤。牛大力是一种分布于热带和亚热带地区的野生名贵药材，以根入药，主要成分为蛋白质、淀粉质及生物碱等。味甘、性平，归肺、肾经；具有补虚润肺、强筋活络的功效。用于腰肌劳损，风湿性关节炎，肺热，肺虚咳嗽，肺结核，慢性支气管炎，慢性肝炎，遗精，白带。70年代，牛大力作为壮腰健肾丸、强力健身胶囊等的原料而用于中成药的生产，在两广地区得到广泛应用。同时，牛大力又是一个多民族使用的民间草药，贾敏如的《中国民族药志要》中记载牛大力是仫佬药、壮药等。近年来，牛大力遭受滥采滥挖，野生资源几近灭绝。国内学者已经采用植物组培技术快速繁殖牛大力，但仍未解决现阶段市场对牛大力的需求。

专利cn201810094607-一种提高牛大力产量的种植方法公开了使用牛大力茎段作为外植体培育牛大力幼苗；诱导培养基为ms培养基加入蔗糖30g/l、琼脂6g/l和玉米素0.3mg/l；增殖培养基为ms培养基加入蔗糖50g/l、琼脂10g/l、萘乙酸0.2mg/l和赤霉素0.2mg/l；生根培养基为ms培养基加入蔗糖60g/l、琼脂15g/l、磷酸二氢钠6g/l、硝酸铵8g/l、萘乙酸0.5mg/l和玉米素0.6mg/l；该专利在组培过程中杀菌剂成分复杂、培养基含糖量高，废弃培养基难处理。专利cn201710767249-一种牛大力的培育方法公开了采用牛大力的种子进行组织培养培育出牛大力幼苗，但是牛大力的种子价格较高，导致培育成本较高。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种牛大力的培育方法，通过该方法可以培育出优质、高产的牛大力产业化组培苗，缓解了市场对牛大力供不应求的现状，而且经过筛选出最佳的牛大力组培种植技术，为建立牛大力组培技术产业化标准奠定了基础。

一种牛大力的培育方法，包括以下步骤：

（1）外植体消毒：选取牛大力半木质化茎段的嫩枝，先用清水冲洗干净，然后剪成长0.5-1.0cm的小茎段，用滤纸吸干表面水分，在3%的过氧化氢溶液中灭菌60s，用无菌水清洗2次，无菌纸吸干表面水分，置于0.1%的升汞液中浸泡灭菌12min，用无菌水清洗5次，无菌纸吸干表面水分。

（2）诱导培育：将消毒后的外植体移入诱导培养基中诱导分化，培育条件：温度为23-27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600-2000lx；诱导培养基为：ms+蔗糖20g/l+卡拉胶4g/l+6-ba2mg/l+kt1mg/l+naa0.4mg/l+ac1g/l，ph值为5.8。

（3）增殖培育：当侧芽分化芽长至3cm时，将嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育，培育条件：温度为23-27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600-2000lx；增殖培养基：ms+蔗糖20g/l+卡拉胶4g/l+6-ba3mg/l+iaa0.2mg/l+naa0.8mg/l，ph值为5.8。

（4）生根培育：当增殖芽长至3cm时，将嫩芽剪下浸泡在50mg/l的iba溶液中5s，再接入生根培养基上诱导生根，培育条件：温度为23-27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600-2000lx；生根培养基为：1/2ms+蔗糖20g/l+卡拉胶4g/l+ac0.5g/l，ph值为5.8。

（5）驯化移栽：生根培养30天后，将生根组培苗的瓶塞打开在室内放置3-5天，取出组培苗用1‰浓度的高锰酸钾溶液洗净根部培养基，随后移栽到蛭石：营养土=1：3的基质中，并用水浇透，搭小拱棚进行保温保湿，温度控制在20-30℃之间，相对湿度保持在85%以上，5天后在小拱棚的塑料膜上面每隔10cm戳一个直径为1mm的小孔，15天后在小拱棚的塑料膜上面每隔20cm戳一个直径为5mm的孔，将25天后原来直径为5mm的孔扩大至1cm，35天后将小拱棚拆除。

所述诱导、增殖、生根培养基在被利用过并移除完嫩芽或幼苗后，立刻将其在121℃高压灭菌30-60min，在无菌条件下冷却，待温度降至100℃时将其倒出，再将其在搅拌下加入1-5mol/l的盐酸溶液，控制溶液中盐酸的浓度在0.1-0.5mol/l之间，保持溶液温度为80-100℃反应3-5h，得到含小分子卡拉胶和小分子糖的物质；再将得到的物质与土壤或固体肥料以1:（10-20）的重量比混合施用于牛大力的后续种植过程中。

所述步骤（1）、（2）、（3）和（4）中可能会与牛大力嫩枝或嫩芽接触的仪器和物质均不采用乙醇灭菌。

本发明的有益效果是：

1、本发明选取牛大力半木质化茎段的嫩枝作为外植体，不仅代谢旺盛、再生能力强，而且原料较充足易得、成本低；在消毒时采用3%的过氧化氢溶液代替乙醇溶液，外植体褐化轻，再置于0.1%的升汞液中浸泡灭菌12min，消毒彻底，无污染，得到的组培苗脱毒彻底。

2、本发明使用的培养基采用卡拉胶作为凝固剂，成本比琼脂低，其培养基的透明度和弹性等方面比用琼脂好，组培苗生长也明显快于琼脂培养基的组培苗，且茎叶根生长量大，可缩短培育时间，降低生产成本。除此之外，卡拉胶可降解为小分子卡拉胶，小分子卡拉胶活性高、易于植物吸收利用。本发明使用的培养基添加的植物激素种类较少，且为常规使用的品种，成本低，较易被组培嫩芽吸收利用，组培后培养基上污染低，所含成分也较简单，可以经过灭菌降解后利用于牛大力的后续种植。

3、本发明采用组培方法培育牛大力的组培苗，不仅培育时间短，3个月左右即可移栽进行营养培育，营养培育一个月后可以移栽大田，移栽存活率高。牛大力的幼苗脱毒彻底，抗病性好且对环境的抗逆性好。而且本发明所使用的培养基均经过验证和筛选，选择最适的植物激素浓度，分化率达85%，增殖系数高达2.7，根系生长良好，生根率达到100%，平均根数为3条，最大根长2.3cm。经过验证和筛选不仅可以促进培育得到更加优质的组培苗，还能节约成本，以最低的成本培育出最优的苗，筛选出最佳的牛大力组培种植技术，为建立牛大力组培技术产业化标准奠定基础。

4、培养基是一类为植物生长发育提供营养的物质，经组织培养后，废弃的培养基仍是富含大量有机质的可利用资源，直接扔掉既浪费资源又污染环境，送去统一处理又需要耗费较多的人力和材料。本发明的培养基添加的植物激素种类较少，培育后污染较低，因此，在本发明将组培过程中移除嫩芽或幼苗后废弃的诱导、增殖、生根培养基，经过灭菌和降解处理后，再次利用到牛大力后续的营养培育和大田培育中，既充分利用了培养基中的营养成分，使得大田培育的幼苗生长得更快、更好，也免去了废弃培养基的处理，减少了其对环境的污染。

附图说明

图1是牛大力组培苗诱导培育的图片；

图2是牛大力组培苗增殖培育的图片；

图3是牛大力组培苗生根培育的图片

图4是牛大力组培苗炼苗后移栽进行营养培育的图片。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1

一种牛大力的培育方法包括以下步骤：

（1）外植体消毒：选取牛大力半木质化茎段的嫩枝，先用清水冲洗干净，然后剪成长0.5-1.0cm的小茎段，用滤纸吸干表面水分，在3%的过氧化氢溶液中灭菌60s，用无菌水清洗2次，无菌纸吸干表面水分，置于0.1%的升汞液中浸泡灭菌12min，用无菌水清洗5次，无菌纸吸干表面水分。

（2）诱导培育：将消毒后的外植体移入诱导培养基中诱导分化，培育条件：温度为23-27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600-2000lx；诱导培养基为：ms+蔗糖20g/l+卡拉胶4g/l+6-ba2mg/l+kt1mg/l+naa0.4mg/l+ac1g/l，ph值为5.8；经过诱导培育后的嫩芽见图1。

（3）增殖培育：当侧芽分化芽长至3cm时，将嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育，培育条件：温度为23-27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600-2000lx；增殖培养基：ms+蔗糖20g/l+卡拉胶4g/l+6-ba3mg/l+iaa0.2mg/l+naa0.8mg/l，ph值为5.8；经过增殖培育后的嫩芽见图2。

（4）生根培育：当增殖芽长至3cm时，将嫩芽剪下浸泡在50mg/l的iba溶液中5s，再接入生根培养基上诱导生根，培育条件：温度为23-27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600-2000lx；生根培养基为：1/2ms+蔗糖20g/l+卡拉胶4g/l+ac0.5g/l，ph值为5.8；经过生根培育后的幼苗见图3。

（5）驯化移栽：生根培养30天后，将生根组培苗的瓶塞打开在室内放置3-5天，取出组培苗用1‰浓度的高锰酸钾溶液洗净根部培养基，随后移栽到蛭石：营养土=1：3的基质中，并用水浇透，搭小拱棚进行保温保湿，温度控制在20-30℃之间，相对湿度保持在85%以上，5天后在小拱棚的塑料膜上面每隔10cm戳一个直径为1mm的小孔，15天后在小拱棚的塑料膜上面每隔20cm戳一个直径为5mm的孔，将25天后原来直径为5mm的孔扩大至1cm，35天后将小拱棚拆除，40天后查看存活情况，记录存活数，并计算存活率得约为99.6%。移栽后的幼苗见图4。

（6）待幼苗长高至20-30cm时，带土移栽至用基肥堆高的种植坑上，一次浇足定根水，第一个月内，每隔2-3天浇一次水，保持土壤湿度为50％-70％，移栽后第15天查看存活情况，记录存活数，计算存活率得约99.7%。

所述诱导、增殖、生根培养基在被利用过并移除完嫩芽或幼苗后，立刻将其在121℃高压灭菌30-60min，在无菌条件下冷却，待温度降至100℃时将其倒出，再将其在搅拌下加入1-5mol/l的盐酸溶液，控制溶液中盐酸的浓度在0.1-0.5mol/l之间，保持溶液温度为80-100℃反应3-5h，得到含小分子卡拉胶和小分子糖的物质。将得到的物质与大田土、腐熟农家肥以1：10：4的重量比混合作为步骤（5）的营养土；若还有剩余，将其与农家肥或有机肥混合，作为步骤（6）的基肥。

所述步骤（1）、（2）、（3）和（4）中可能会与牛大力嫩枝或嫩芽接触的仪器和物质均不能采用乙醇灭菌。

为了说明废弃的培养基仍富含大量营养成分，并能在牛大力的后续种植中应用以促进牛大力的生长，本申请人将本发明废弃的培养基经过消毒灭菌和降解处理后，与大田土、腐熟农家肥以1：10：4的重量比混合作为营养培育中的营养土，再按蛭石和营养土的重量比为1:3制备基质，培育牛大力幼苗，并设置对照组，用大田土、腐熟农家肥以10：4的重量比混合作为营养培育中的营养土，按蛭石和营养土的重量比为1:3制备基质，培育牛大力幼苗，移栽进行营养培育时，牛大力幼苗的平均茎粗0.58cm、平均株高6.02cm，记录牛大力幼苗的生长速度，营养培育35或50天后的具体情况如下：

由表1可以看出，在营养培育的营养土中添加废弃的培养基，可以促进牛大力幼苗长高、长壮。

为了得到更好的组培苗，本申请人在确定组培各培养基的各成分含量时，还进行了试验筛选，分别针对诱导培养基和增殖培养基中6-ba和naa的浓度，以及生根培育前预处理的iba溶液的浓度，具体包括以下内容：

（1）诱导培育：以ms为基本培养基，同时添加蔗糖、卡拉胶、kt、ac以及不同浓度的6-ba和naa，共设有6个处理组(如表2所示)，每个处理组分别接种8瓶，每瓶接有3个茎段，在以下条件诱导分化：温度为23-27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600-2000lx；培养25天后调查侧芽的分化情况，计算分化率，各处理组的分化率见表2：

从侧芽分化结果可以看出：牛大力茎段在所用的6种培养基上均能分化出侧芽，分化率为30%至85%不等。其中组别3：ms+蔗糖20g/l+卡拉胶4g/l+6-ba2mg/l+kt1mg/l+naa0.4mg/l+ac1g/l培养基上的诱导率较高，即6-ba和naa的最适浓度为2mg/l和0.4mg/l。

（2）增殖培育：以ms为基本培养基，同时添加蔗糖、卡拉胶、iaa以及不同浓度的6-ba和naa，共设6个处理组(如表3所示)，每处理组分别接种8瓶，每瓶接有3个茎段，在以下条件诱导增殖：温度为23-27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600-2000lx；培育35天后开始调查芽的增殖情况，各处理组的增殖系数见表3：

从侧芽增殖结果可以看出：牛大力茎段在所用的6种培养基上均能增殖分化出侧芽，增殖系数为1.7-2.7不等，其中组别4：ms+蔗糖20g/l+卡拉胶4g/l+6-ba3mg/l+iaa0.2mg/l+naa0.8mg/l培养基上的增殖系数较高，即6-ba和naa的最适浓度为3mg/l和0.8mg/l。

（3）生根培育：设有6组不同浓度的iba溶液，将剪下的小苗浸泡在不同浓度的iba溶液中5s；再接入生根培养基上诱导生根，培育条件：温度为23-27℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600-2000lx；培养30天后开始调查生根系数和生根率，各处理组的生根系数和生根率见表4：

从生根结果表明，浸泡在20-70mg/liba溶液中5s均可诱导生根，生根率在30%到90%不等，其中浸泡在50mg/liba溶液中5s生根效果最佳，根系生长良好，其生根率达到100%，平均根数为3条，最大根长2.3cm，如图3所示，即iba溶液的最适浓度为50mg/l。