一种拓宽甘蓝型油菜遗传变异范围的方法与流程

本发明属于生物育种技术领域，尤其涉及一种拓宽甘蓝型油菜遗传变异范围的方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：油菜是世界上主要油料作物之一，也是重要的食用油源、和蛋白质饲料、工业原料和蜜源植物。我国是最早进行油菜栽培的国家之一，但过去主要进行的是白菜型油菜栽培。在上个世纪20世纪30年代，甘蓝型油菜(aacc)开始从朝鲜、日本和英国引进并进行栽培，现已广泛分布于中国各地，尤以长江流域各省油菜主产区分布最为集中，已经代替白菜型油菜成为我国最重要的油料作物之一。随着人民物质生活水平的提高及油菜育种研究工作的不断深入，人们对油菜育种目标提出了更高的要求，选育高含油量、高油酸、低芥酸、低硫甙的高产优质多抗的油菜优良品种成为当前油菜育种的主攻目标。但是，我国油菜现在大面积栽培的甘蓝型油菜最初从国外引入，引入的时间短，目前在生产上所用的“双低”(低芥酸、低硫甙)常规品种和杂交品种的遗传来源也来自于国外。可见，我国甘蓝型油菜种内遗传基础狭窄，种内资源也随着部分品种的大量推广日益枯竭。针对这种情况，利用芸薹属种间关系研究，通过远缘杂交导入其它种(属)有利基因拓宽甘蓝型油菜遗传育种基因库，越发显得重要。芸薹属由白菜(b.campestrisl.，2n＝a^ra^r＝20)、甘蓝(b.oleraceal.2n＝c^oc^o＝18)、黑芥(b.nigral,2n＝bb＝16)3个基本种和甘蓝型油菜(b.napusl.,2n＝aacc＝38)、埃塞俄比亚芥(b.carinatabraunl.2n＝bbcc＝34)、芥菜(b.junceaczern&cossl.,2n＝aabb＝36)3个复合种组成。甘蓝型油菜主要通过甘蓝(2n＝a^ra^r)和白菜种间他天然杂交，染色体加倍后形成的，这也成为我们现在人工合成甘蓝型油菜、创造新的种质资源的主要途径。通过该种途径人工合成蓝型油菜存在着杂交亲和性难、杂种后代(人工合成的甘蓝型油菜)遗传稳定进度较慢等缺陷；同时由于其亲本组成为甘蓝和白菜，两个亲本现都是菜用型作物，因此难以选择到适宜油用的性状优良的材料用于生产。另外，在育种上主要还存在着其它选育新型甘蓝型油菜途径，如通过甘蓝型油菜和白菜型油菜、甘蓝型油菜和芥菜型油菜种间杂交，分别在后代中选育获得甘蓝型油菜；这两种途径杂交亲和性较好，工作简单，但是其杂种后代亲和性差，难以获得遗传稳定的性状优良的新型甘蓝型油菜，且遗传基础相对狭窄。近年来，也有利用甘蓝和甘蓝型油菜杂交(acc)，白菜和甘蓝型油菜杂交(aac)，通过利用秋水仙碱进行染色体加倍后获得六倍体植株(aacccc和aaaacc)，再以六倍体作为中间材料和白菜(aa)和甘蓝(cc)杂交，获得甘蓝型油菜(aacc)的相关研究，其实质是将人工合成甘蓝型油菜和天然甘蓝型油菜杂交，拓展甘蓝型油菜的遗传多样性，由于其导入基因组分别来自甘蓝和白菜，因此其仍然无法获得更多优良的性状用于生产。芥菜型油菜是世界上重要的三大类型油菜作物之一，原产于我国西部和西北部，其植株高大，株型松散，分枝纤细，分枝部位高，分枝多，主根发达、耐瘠薄。现有甘蓝型油菜种质资源创新主要通过利用甘蓝(c^oc^o)和白菜型油菜(a^ra^r)种间杂交人工合成甘蓝型油菜(a^ra^rc^oc^o)、或者将甘蓝(c^oc^o)和甘蓝型油菜(2n＝4x＝aⁿaⁿcⁿcⁿ)、白菜(a^ra^r)和甘蓝型油菜(2n＝4x＝aⁿaⁿcⁿcⁿ)、芥菜型油菜(a^ja^jb^jb^j)和甘蓝型油菜(2n＝4x＝aⁿaⁿcⁿcⁿ)种间杂交，经过选育创制新型甘蓝型油菜。该方法来源不够广泛、遗传变异范围小、不容易筛选到农艺性状油菜的新型甘蓝型油菜用于生产。如果利用现有方法将甘蓝、芥菜型油菜、甘蓝型油菜三个物种优良性状集中，创制新型甘蓝型油菜，需要甘蓝和甘蓝型油菜、芥菜型油菜和甘蓝型油菜(2n＝4x＝aⁿaⁿcⁿcⁿ)分别进行种间杂交，分别进行选育，分别获得相对稳定的不同来源的新型甘蓝型油菜后再进行杂交育种，遗传物质聚合；因此、过去需要进行两次种间杂交，两次种间杂种后代的选育，这些过程都会遇到杂交不亲和或者杂种后代不育，均需要采取一定的技术手段，如幼胚挽救等进行克服，耗时长、工序复杂、工作量大。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有人工合成蓝型油菜存在着杂交亲和性难、杂种后代(人工合成的甘蓝型油菜)遗传稳定进度较慢；难以选择到适宜油用的性状优良的材料用于生产；在育种存在杂种后代亲和性差，难以获得遗传稳定的性状优良的新型甘蓝型油菜，且遗传基础相对狭窄。

(2)现有利用甘蓝和甘蓝型油菜杂交导入基因组分别来自甘蓝和白菜，无法获得更多优良的性状用于生产。

(3)现有甘蓝型油菜种质资源创新来源不够广泛、遗传变异范围小、不容易筛选到农艺性状油菜的新型甘蓝型油菜用于生产。

(4)现有将甘蓝、芥菜型油菜、甘蓝型油菜三个物种优良性状集中，创制新型甘蓝型油菜需要进行两次种间杂交，两次种间杂种后代的选育，存在杂交不亲和或者杂种后代不育，耗时长、工序复杂、工作量大。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种拓宽甘蓝型油菜遗传变异范围的方法。

本发明是这样实现的，一种拓宽甘蓝型油菜遗传变异的方法，所述甘蓝型油菜遗传变异范围拓宽的方法通过甘蓝c^oc^o和芥菜型油菜a^ja^jb^jb^j种间杂交，利用b染色体组的选择性落后和非同源染色体的联会交换，选育出拟甘蓝型油菜(a’a’c’c’)后再和天然甘蓝型油菜aⁿaⁿcⁿcⁿ杂交，将来自于3个不同物种的不同染色体组整合。

进一步，所述甘蓝型油菜突变体库的方法包括以下步骤：

步骤一：利用甘蓝和芥菜型油菜种间杂交，授粉10-15d后，幼胚挽救，获得三倍体杂种无性系；

步骤二：在表型鉴定为三倍体杂种无性系中筛选具有微量花粉的植株进行自交和幼胚挽救，建立无性系群体s1；在无性系s1进行自交获得s2群体，s2自交后获得s3；s3进行自交获得s4；s1中没有符合要求的植株，在s1中继续进行幼胚挽救，在s2中筛选可育的类似甘蓝型油菜的无性系进行自交；

步骤三：杂种后代通过连续自交构建重组自交系群体或者小孢子培养构建dh群体，从群体中筛选遗传相对稳定、农艺性状和品质性状优良的材料用于遗传育种。

进一步，所述甘蓝和白菜种间杂交获得三倍体杂种具体为：甘蓝2n＝2x＝coco和芥菜型油菜2n＝4x＝a^ja^jb^jb^j种间杂交，采用盐水涂抹柱头+蕾期授粉的方法，授粉后10-15d，幼胚挽救后获得三倍体杂种2n＝3x＝a^jb^jc^o无性系s0。

进一步，所述拟甘蓝型油菜的人工合成具体包括：

(1)在表型鉴定为三倍体杂种2n＝3x＝a^jb^jc^o无性系中筛选具有微量花粉的植株进行自交和幼胚挽救，建立无性系群体s1；在无性系s1群体中筛选形态类似于甘蓝型油菜、花药饱满、能够自交结实的无性系进行自交，获得s2群体；在s2群体中按照s1选择标准进行选择单株、自交后获得s3；s3进行自交获得s4；

(2)如果s1中没有符合要求的植株，在s1中继续进行幼胚挽救，在s2中筛选可育的类似甘蓝型油菜的无性系进行自交；

(3)从s3或者s4开始，进行细胞学观察，筛选染色体数为38条的单株，作为拟甘蓝型油菜2n＝4x＝a’a’c’c’。

进一步，所述利用拟甘蓝型油菜拓宽甘蓝型油菜种植资源变异范围具体包括：

从s3开始，选择外形类似甘蓝型油菜、育性相对正常的拟甘蓝型油菜2n＝4x＝a，a，c，c，和天然甘蓝型油菜2n＝4x＝aⁿaⁿcⁿcⁿ杂交，杂种后代2n＝4x＝aⁿa，cⁿc，通过连续自交构建重组自交系ril群体或者小孢子培养构建dh群体，从群体中筛选遗传相对稳定、农艺性状和品质性状优良的材料用于遗传育种。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明首先利用甘蓝和芥菜型油菜种间杂交，利用微量花粉自交后进行幼胚挽救，利用表型和细胞学筛选获得拟甘蓝型油菜(a’a’c’c’)；再利用拟甘蓝型油菜和天然甘蓝型油菜(2n＝4x＝aⁿaⁿcⁿcⁿ)杂交，拓宽甘蓝型油菜种质资源范围；只是进行了一次种间杂交，较过去的方法更快、更简单、工作量更少，更容易获得遗传稳定、可利用的甘蓝型油菜。

本发明通过甘蓝(c^oc^o)和芥菜型油菜(a^ja^jb^jb^j)种间杂交，利用b染色体组的选择性落后和非同源染色体的联会交换，选育出拟甘蓝型油菜(a’a’c’c’)后再和天然甘蓝型油菜aⁿaⁿcⁿcⁿ)杂交，将来自于3个不同物种的不同染色体组(a、b、c)整合，创制新型甘蓝型油菜，该类新型甘蓝型油菜遗传基础较过去方法来源更加广泛、遗传变异范围更大、更容易筛选到农艺性状油菜的新型甘蓝型油菜用于生产。

本发明提供的一种甘蓝型油菜突变体库的方法，将芥菜型油菜和甘蓝的优点结合，合成部分稳定的拟甘蓝型油菜(a’a’c’c’)，该类种质较其它来源的人工合成的新型甘蓝型油菜因具有芥菜型油菜特点，性状更加优良。

附图说明

图1是本发明实施例提供的拓宽甘蓝型油菜遗传变异范围的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的拓宽甘蓝型油菜遗传变异范围的方法实现流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了获得新的甘蓝型油菜合成途径，丰富甘蓝型油菜遗传资源库，促进甘蓝型油菜遗传育种；本发明以甘蓝(2n＝c^oc^o)和芥菜型油菜(a^ja^jb^jb^j)种间杂种(a^jb^jc^o)合成拟甘蓝型油菜(a’a’c’c’)，通过拟甘蓝型油菜(a’a’c’c’)和优良的天然甘蓝型油菜杂交、选育，拓宽了甘蓝型油菜遗传变异范围。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的甘蓝型油菜突变体库的方法包括以下步骤：

s101：利用甘蓝和芥菜型油菜种间杂交，授粉10-15d后，幼胚挽救，获得三倍体杂种无性系；

s102：在表型鉴定为三倍体杂种无性系中筛选具有微量花粉的植株进行自交和幼胚挽救，建立无性系群体s1；在无性系s1进行自交获得s2群体，s2自交后获得s3；s3进行自交获得s4；s1中没有符合要求的植株，在s1中继续进行幼胚挽救，在s2中筛选可育的类似甘蓝型油菜的无性系进行自交；连续自交获得s3和s4，通过细胞学选出拟甘蓝型油菜。

s103：杂种后代通过连续自交构建重组自交系群体或者小孢子培养构建dh群体，从群体中筛选遗传相对稳定、农艺性状和品质性状优良的材料用于遗传育种研究。

在本发明的优选实施例中，步骤s101的甘蓝和芥菜型油菜种间杂交获得三倍体杂种具体为：

甘蓝(2n＝2x＝c^oc^o)和芥菜型油菜(2n＝4x＝a^ja^jb^jb^j)种间杂交，采用盐水涂抹柱头+蕾期授粉的方法，授粉后10-15d，幼胚挽救后获得三倍体杂种(2n＝3x＝a^jb^jc^o)无性系(s0)。

在本发明的优选实施例中，步骤s102的拟甘蓝型油菜的人工合成具体包括：

(1)在表型鉴定为三倍体杂种(2n＝3x＝a^jb^jc^o)无性系中筛选具有微量花粉的植株进行自交(蕾期辅助授粉)和幼胚挽救，建立无性系群体(s1)；在无性系(s1)群体中筛选形态类似于甘蓝型油菜、花药饱满、能够自交结实的无性系进行自交，获得(s2)群体；在(s2)群体中按照s1选择标准进行选择单株、自交后获得s3；s3进行自交获得s4；

(2)如果s1中没有符合要求的植株，需要在s1中继续进行幼胚挽救，在s2中筛选可育的类似甘蓝型油菜的无性系进行自交；

(3)从s3或者s4开始，进行细胞学观察，筛选染色体数为38条的单株，作为拟甘蓝型油菜(2n＝4x＝a’a’c’c’)。

步骤s103中，本发明提供的利用拟甘蓝型油菜拓宽甘蓝型油菜种植资源变异范围具体为：

从s3开始，选择外形类似甘蓝型油菜、育性相对正常的拟甘蓝型油菜(2n＝4x＝a’a’c’c’)和天然甘蓝型油菜(2n＝4x＝aⁿaⁿcⁿcⁿ)杂交，杂种后代(2n＝4x＝aⁿa，cⁿc，)通过连续自交构建重组自交系(ril)群体或者小孢子培养构建dh群体，从群体中筛选遗传相对稳定、农艺性状和品质性状优良的材料用于遗传育种研究。

如图2所示，本发明实施例提供的甘蓝型油菜突变体库的方法原理图；甘蓝(b.olerecea)2n＝2x＝c^oc^o＝18和芥菜型油菜(b.jucea)2n＝4x＝a^ja^jb^jb^j＝34种间杂交，经过幼胚挽救，获得三倍体种间杂种2n＝4x＝a^jb^jc^o＝27，通过快速繁殖，获得s0无性系；s0无性系经过自交和幼胚培养，获得s1无性系；s1中选择结实率较高的单株自交，在自交后代(s2及其以后世代)中都选择形态和甘蓝型油菜相似、花粉育性较好的单株自交，在s3或者s4中开始进行细胞学检测，筛选染色体数目为38的拟甘蓝型型油菜；拟甘蓝型油菜2n＝a’a’c’c’＝38和天然甘蓝型油菜2n＝aⁿaⁿcⁿcⁿ＝38杂交获得f1为2n＝aⁿa’cⁿc’＝38，f1通过小孢子培养获得dh群体，进行种质帅选与鉴定或者f1连续自交5-6代，获得重组自交系群体(rils)，进行种质筛选与鉴定。

下面结合本具体实施过程对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1

本发明实施例提供的拓宽甘蓝型油菜突变体库的方法包括以下步骤：

步骤一，选取性状优良的芥菜型油菜和甘蓝(羽衣甘蓝、芥蓝、结球甘蓝等)为实验材料，适当调节播期，让二者花期相遇。选取生长健壮的芥菜型油菜单株为母本，摘除已经开花花朵或者过小的花蕾，保留2-3d后才能开花的花蕾进行剥蕾、去雄，以质量比为10％的nacl溶液涂抹柱头，柱头稍微风干后授以甘蓝新鲜花粉。第二天重复授粉。每次授粉完成后立即套袋。授粉30d后，将为成熟幼胚依次用75％酒精(30-60s)、10％的naclo消毒后无菌条件下接种在ms或者1/2ms培养基上，待幼胚萌发后切取其茎尖转接到快繁培养基(ms+1.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa)上快繁形成无性系。移栽前20-30d左右，将无性系转移到ms或者1/2ms培养上生根。生根后炼苗1-2d移栽大田。通过形态学鉴定真杂种，获得三倍体杂种(2n＝3x＝abc)无性系(s0)。

步骤二，选取真杂种植株中具有微量花粉植株，摘除已经开花或者过小的花蕾，保留2-3d后才能开花的花蕾进行剥蕾，以质量比为10％的nacl溶液涂抹柱头，柱头稍微风干后取该植株自身花粉(提前套袋)辅助授粉。15-20d后去幼胚接种到ms+1.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa培养基上，构建无性系(s1)，每个无性系扩繁10-20株不等。生根培养(ms或者1/2ms培养基)后移栽大田。选取性状表现趋近于甘蓝型油菜，自交结实率高的无性系自交，获得s2株系。继续根据农艺性状和自交结实率选择获得s3、s4、s5株系，对于遗传性状表现趋近甘蓝型油菜的株系进行细胞学鉴定，获得拟甘蓝型油菜。

步骤三，选取s3或者s4株系中性状相对优良的单株和优良的天然甘蓝型油菜杂交，获得杂种(f1)，通过连续性自交或者小孢子培养，分别获得重组自交系群体(rils)或者dh系群体，对重组自交系群体(rils)或者dh系群体进行农艺性状、品质性状调查，筛选优异品系用于育种。

实施例2

以芥菜型油菜09k26、09d311为母本、以羽衣甘蓝09d427、09dk005为父本，授粉1,200左右朵花蕾，获得幼胚71个，培养后获得无性系10个，其中真杂种3个。以芥菜型油菜09d454、09d217为母本，以芥蓝ay169、d229、d230为父本杂交，授粉3300个左右花蕾，获得幼胚800个左右，接种部分幼胚最后获得31个无性系。这些无性系根据花粉粒多少可以分为三类：a、高度不育；b、部分不育(具有微量花粉)；c、完全可育(形态表现类似母本，假杂种)。其中b类型进行蕾期辅助授粉，可获得少量干瘪种子，通过幼胚挽救可以获得少量无性系单株。

以第1种方法获得的无性系进行连续自交4代后获得的拟甘蓝型油菜10d130和中双11号杂交，杂种后代进行小孢子培养和连续自交，分别获得了dh系群体和重组自交系群体，在这些群体中均出现超亲遗传变异(变异范围远远超过10d130和中双11号)，如高油酸、高芥酸、黄籽、矮杆、多分枝、早熟等优良性状。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

(1)三倍体种间杂种的获得：周清元,李加纳,崔翠,等.芥菜型油菜×羽衣甘蓝种间杂种的获得及其性状表现[j].作物学报,2005,31(8):1058-1063.

(2)三倍体种间杂种的获得和拟甘蓝型油菜的人工合成：周清元.甘蓝型油菜新种质资源创建及其株型性状遗传分析[d].西南大学,2013.

(3)甘蓝型油菜遗传变异范围的拓宽：10d130是选育出的染色体数目为38的拟人工合成甘蓝型油菜，主要表现为黄花、半矮杆、黄籽、高芥酸(45％)等；中双11号为中国农业科学院油料作物研究所选育的高产，双低(低硫甙和低芥酸)，普通油酸(60％左右)，晚熟常规新品种，为天然甘蓝型油菜；我们利用二者杂交，在其小孢子培养后代(dh系)和自交后代形成的重组自交系(ril)筛选出具有高油酸(大于75％)、白花、高芥酸(大于50％)、早熟(花期早于10d130)等性状品系，变异范围远远大于两个亲本(10d130和中双11号的表型范围)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。