本发明涉及植物组织培养技术领域，具体为一种秦岭石蝴蝶试管内叶插快繁体系的建立方法。
背景技术：
秦岭石蝴蝶(petrocosmeaqinlingensisw.t.wang)为苦苣苔科(gesneriaceae)石蝴蝶属(petrocosmea)植物，是秦岭地区特有的多年生草本植物，花期8-9月，生于山地岩石上，海拔650米，被列为国家ⅱ级重点保护野生植物，并被定为濒危种。秦岭石蝴蝶是石蝴蝶属分布最北端的种类，自然居群数量极少，多次野外调查并未发现其野生居群，研究者曾认为该种已灭绝。2015年陕西省野生植物资源调查重新发现了该种，其分布区域非常狭窄，仅限于陕西省勉县茶店镇附近，多生于阴湿、苔藓积聚多的石灰石崖壁上。
自然条件下秦岭石蝴蝶种子不育，无性繁殖速度又很慢。生境独特且繁殖方式限制是该种致濒的重要原因。利用植物组织培养技术进行秦岭石蝴蝶的快速繁殖，可以在短时间内获得大量与母株遗传背景一致的优质种苗，克服自然繁殖方式较慢的特点，但是，在此之前还没有建立秦岭石蝴蝶试管内快速繁殖的报道，更没有成功的实例。所以实现秦岭石蝴蝶的快速繁殖对于秦岭石蝴蝶的野外回归与种质资源保护具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种以带柄叶片为外植体材料，经过叶片消毒、接种、叶插增殖以及生根壮苗等步骤成功实现秦岭石蝴蝶的叶插快繁培养，能够克服自然繁殖方式较慢的特点，在短时间内获得大量遗传性状稳定一致的优质种苗，技术易掌握，增殖系数极高的秦岭石蝴蝶试管内叶插快繁体系。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种秦岭石蝴蝶试管内叶插快繁体系的建立方法，包括以下步骤：
(1)叶片的消毒及接种：从秦岭石蝴蝶母株上摘取健康的带柄叶片为外植体材料，对外植体材料进行清洗和消毒，然后将外植体材料无菌操作下叶柄端朝下斜插入基础培养基中，基础培养基由一定体积比的珍珠岩、蛭石和泥炭加水混均后于121.3℃下灭菌60min制得；
(2)叶插增殖培养：从步骤(1)中斜插入基础培养基的外植体材料的叶柄基部向培养基中添加增殖培养液，诱导不定芽的形成，增殖培养液为ms营养液+iba，iba浓度为100～600mg/l，ph值为5.8；
(3)生根壮苗培养：将步骤(2)中得到的不定芽丛分为单株，挑选芽体大于2cm且带有3～5片叶的单株转入基础培养基，从单芽基部向基础培养基中加入生根壮苗培养液进行生根壮苗，其中生根壮苗培养液为ms营养液+iba，iba浓度为200mg/l，ph值为5.8。
优选的，步骤(1)和(3)中基础培养基的制备过程为：
首先按照2：1：1的体积比量取珍珠岩、蛭石和泥炭并加水混均，待吸水饱和后分别装入240ml的培养瓶中，装入体积为培养瓶体积的1/3，然后盖上透气盖，最后将培养瓶于121.3℃下灭菌60min，得到基础培养基。
优选的，步骤(1)和(3)中ms营养液不加蔗糖，ph值为5.8。
优选的，步骤(1)中外植体材料的清洗和消毒过程为：
首先使用软毛刷擦拭去除表面的尘土与杂质，然后放入250ml广口瓶中，滴入2滴洗洁精后加入自来水，震荡洗涤10～15min后使用自来水冲洗30～40min，最后使用灭菌去离子水冲洗7～8次，每次1min。
优选的，步骤(2)中增殖培养液的加入量为1ml的ms营养液+1ml的iba，不定芽丛的形成时间为4～8周。
优选的，步骤(3)中生根壮苗培养液的加入量为1ml的ms营养液+0.5ml的iba，培养3～6周成为根系发达的壮苗，培养8周后部分单株在培养瓶内正常开花。
优选的，步骤(1)(2)(3)中的培养条件为培养温度25+2℃，光照强度60-100umol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，湿度60-70％。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明以带柄叶片为外植体材料，经过叶片消毒、接种、叶插增殖以及生根壮苗等步骤通过组织培养技术成功实现秦岭石蝴蝶的叶插快繁培养，建立增殖系数极高的秦岭石蝴蝶试管内叶插快繁体系。
2、本发明提供的方法能够克服秦岭石蝴蝶自然繁殖方式较慢的特点，在短时间内获得大量遗传性状稳定一致的优质种苗，成苗率高，技术易掌握。
具体实施方式
以下具体实施方式是对本发明的进一步详细描述，不是对本发明的限制。
实施例1
(1)培养基的制备：首先制备秦岭石蝴蝶培养过程中使用的培养基，包括基础培养基与附加ms营养液及激素的具体培养基，其中基础培养基的配制过程为：按照2：1：1的体积比量取珍珠岩、蛭石和泥炭并加水混均，待吸水饱和后分别装入240ml的培养瓶中，装入体积为培养瓶体积的1/3，然后盖上透气盖，最后将培养瓶于121.3℃下灭菌60min；增殖培养液为ms营养液+iba，iba的浓度为100mg/l；生根壮苗培养液为ms营养液+iba，iba的浓度为200mg/l；增殖培养液和生根壮苗培养液中使用的ms营养液不加蔗糖，ph值为5.8。
(2)叶片的消毒及接种：从秦岭石蝴蝶母株上摘取健康带柄叶片为外植体材料，将其先用软毛刷擦拭去除表面尘土和杂质，然后放入250ml广口瓶中并滴入2滴洗洁精，加入自来水震荡洗涤10min，然后使用自来水冲洗30min，最后使用灭菌去离子水冲洗8次，每次1min；将清洗消毒后的带柄叶片叶柄朝下通过无菌操作过程斜插入基础培养基中。
(3)叶插增殖培养：从步骤(2)中斜插入基础培养基的叶柄基部向培养基中添加由1ml的ms营养液和1ml的浓度为100mg/l的iba组成的ph为5.8的增殖培养液，然后于25+2的培养温度、60～100umol·m-2·s-1的光照强度以及60～70％的湿度下进行16h·d-1的光照从而诱导不定芽的形成，培养4周开始形成不定芽，不定芽首先发生在叶柄基部，培养第5周每个叶片的增殖系数为3.67，单个叶片的最大增殖系数为7，培养至第8周每个叶片的平均增殖系数为22.67，其中单个叶片的最大增殖系数达36。
(4)生根壮苗培养：将步骤(3)得到的不定芽从分为单株，挑选芽体大于2cm且带有3～5片叶的单株转入基础培养基，从单芽基部向培养基中加入由1ml的ms营养液和0.5ml的浓度为200mg/l的iba组成的ph为5.8的生根壮苗培养液，然后于25+2℃的培养温度、60～100umol·m-2·s-1的光照强度以及60～70％的湿度下进行16h·d-1的光照，从而进行生根壮苗，培养第2周开始生根，第6周后成为根系发达的壮苗，第8周后部分单株在培养瓶内正常开花。
实施例2
与实施例1的基本步骤相同，不同的是步骤(3)中使用的增殖培养液由1ml的ms营养液和1ml浓度为200mg/l的iba组成，ph为5.8。
加入该增殖培养液在与实施例1相同条件下培养后，第4周开始形成不定芽，不定芽在叶片正面和背面均能形成，多数发生在叶片近叶柄基部，少数发生在叶缘，培养第5周每个叶片的增殖系数为11.67，单个叶片的最大增殖系数为16，培养至第8周每个叶片的平均增殖系数为51，其中单个叶片的最大增殖系数达68。
实施例3
与实施例1的基本步骤相同，不同的是步骤(3)中使用的增殖培养液由1ml的ms营养液和1ml浓度为400mg/l的iba组成，ph为5.8。
加入该增殖培养液在与实施例1相同条件下培养后，第4周开始在叶片近叶柄基部形成不定芽，同时叶柄基部形成少量的白色发状根，培养第5周每个叶片的增殖系数为9.33，单个叶片的最大增殖系数为12，培养至第8周每个叶片的平均增殖系数为33.67，其中单个叶片的最大增殖系数达37。
实施例4
与实施例1的基本步骤相同，不同的是步骤(3)中使用的增殖培养液由1ml的ms营养液和1ml浓度为600mg/l的iba组成，ph为5.8。
加入该增殖培养液在与实施例1相同条件下培养后，第3周叶柄基部形成大量明显的白色发状根，培养第4周开始形成不定芽，不定芽多数发生在叶片近叶柄基部，在正面和背面均能形成，培养第5周每个叶片的增殖系数为4.33，单个叶片最大增殖系数为6，培养至第8周每个叶片的平均增殖系数为16.33，其中单个叶片的最大增殖系数达21。
对比例
与实施例2的基本步骤相同，不同的是步骤(3)中使用的增殖培养液为1ml的ms营养液和1ml的(iba+tdz+naa)，其中iba的浓度为200mg/l，tdz浓度为2.0mg/l，naa浓度为0.2mg/l，ph为5.8。
加入该增殖培养液在与实施例2相同条件下培养后，第4周开始形成不定芽，不定芽多数发生在叶片近叶柄端，在正面和背面均能形成，培养第5周每个叶片的增殖系数为5.67，单个叶片最大增殖系数为6，培养至第8周每个叶片的平均增殖系数为28.33，其中单个叶片的最大增殖系数达32。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。