一种紫美石榴花粉贮藏方法与流程

本发明涉及植物发育生物学领域，具体涉及一种紫美石榴花粉贮藏方法。

背景技术：

杂交育种是石榴新品种创制的重要途径。花粉生活力是确保杂交育种成功的一个重要条件。由于我国南北地区栽培石榴的花期不一致，四川、云南地区的盛花期在四月中旬，而河南和山东地区的石榴盛花期在五月中、下旬，这为南北地区不同品种间杂交带来一定的困扰。花粉采集和贮藏是石榴种质资源创新过程中亟待解决的问题。目前石榴花粉贮藏时多采用硅胶干燥、玻璃化液pvs4等较为复杂干燥方法，处理过程复杂，或者是未经干燥处理直接进行贮藏的方法，会导致在花粉有效生活力范围内的贮藏时间大大缩短。室温条件下，石榴花粉贮藏5天已完全失去生活力；采用液氮贮藏花粉，后期花粉解冻以及低温复苏后花粉活力会急剧下降，以上等均不适为用于石榴杂交试验花粉的最佳贮藏方法。本发明以‘紫美’石榴品种为试材，旨在研究石榴花粉贮藏最佳处理方式及贮藏条件，为石榴杂交育种工作提供技术支撑。

1996年‘紫美’石榴从以色列引入攀枝花市，经攀枝花市农林科学研究院、凉山州亚热带作物研究所、四川省农业科学院园艺研究所联合多年试验筛选的优良品种。‘紫美’石榴树型半开张，树势强，成枝力强；叶片长椭圆形，倒卵形，幼叶浅红色，老叶深红色；萼片深红色，花托深红色、筒状或钟状；总花量中等，两性花比例较高。在四川攀西地区亚热带气候条件下，‘紫美’石榴在2月中旬萌芽，3月上中旬现蕾，花期从3月下旬到5月上旬；9月中下旬果实成熟，果实为近球形，果皮深红色，平均单果重587克。‘紫美’石榴耐储性强，果皮质地粗糙，果皮厚度3毫米；籽粒紫红色，汁液紫黑色，籽粒特软。‘紫美’石榴具有果皮深红，外观美观，籽粒较软，商品价值较高，市场潜力大。

石榴花粉必须经过生活力测定，才能确定是否可以用于杂交授粉。对没有确定有无生活力及生活力大小的花粉，如果盲目使用，可能将会导致杂交工作的失败或无法对杂交结果进行可靠的分析。本发明包含三个关键技术步骤的石榴花粉贮藏方法，该技术操作简单易行，有效维持贮藏期间石榴花粉活力，在石榴生产、育种、科学研究等领域具有重要的应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术和研究的不足，本发明的目的是提供一种紫美石榴花粉贮藏方法，该方法简单、。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种紫美石榴花粉贮藏方法，包括以下步骤：

(1)花粉收集：当石榴花处于盛花期时，于早晨8:00-10:00采集发育成熟、含苞欲放的花朵，保证花器官发育的有效性；

(2)花粉干燥：将采集的花朵小心摘除花瓣，放置室内自然干燥；待花药开裂散粉时，轻轻振动花朵，将花粉均匀地收集在干净的白纸上，继续晾至花粉干燥，干燥状态是花粉完全散开，不成团状；

(3)花粉贮藏：将玻璃干燥器内部清洗干净，并用75％酒精擦拭内壁，将变色硅胶倒入并布满干燥器底部；将干燥好的石榴花粉装入容器中，封口，放置于密封的干燥器内，于4℃保存。

进一步的技术方案，所述步骤(1)中，盛花期是四川地区四月底至五月初，70％～75％紫美石榴花开放的时期。

进一步的技术方案，所述步骤(1)中，发育成熟的花即为花朵子房明显膨大、花型为葫芦状或筒状的花，所选花为完全花。

进一步的技术方案，所述步骤(2)中，自然干燥是于25℃室内自然光照下干燥24h。

进一步的技术方案，所述步骤(3)中，容器为10ml离心管，保存是置于冰箱保鲜层4℃贮藏。

本发明采用液体培养基培养测定贮藏期间紫美石榴花粉活力状况。把花粉均与散播在液体培养液上，使其花粉发芽，以测定花粉生活力的一种方法。具体操作如下：滴1-2滴液体培养基于载玻片上，用大头针取少量花粉均匀撒在液体培养基上，液体培养基为蔗糖。将载玻片放在湿度85％-90％的培养皿中，25℃条件下暗培养12h。生活力正常的花粉发芽时呈圆形，花粉管直线延伸；生活力差的花粉发芽后其花粉管弯曲；没有生活力的花粉粒不能萌发。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明石榴花粉收集方法，选取发育成熟的完全花，保证花器官发育的有效性，自然状态下保证花粉育性的一致性，避免因不同类型花器官发育程度不一致导致花粉活力差异问题。

2.本发明石榴花粉干燥方法，在室内自然干燥，相比以往的太阳直射或干燥器内，保证自然条件下花粉活性和研究的客观性。

3.本发明石榴花粉贮藏方法，分别放置多个温度梯度进行贮藏，通过花粉活力检测，一周后，在室温条件下的花粉已经完全丧失生活力。而采用4℃保存，贮藏花粉可直接用于实验研究，同时避免现有技术中采用-20℃、-80℃、液氮等低温处理后的复苏过程对花粉的损伤等问题，并且该方法简单、可重复性强。

4.本发明石榴花粉活力测定时，花粉培养环境的相对湿度为85％-90％，保证花粉萌发培养过程中所需水分。

5.本发明采用液体ms为基本培养基，在基本成份不变的前提下，设置蔗糖和葡萄糖两个处理，在相同贮藏时间和贮藏条件下，通过花粉活力测定发现，葡萄糖培养基花粉活力明显低于蔗糖，说明蔗糖为糖源的液体培养基更适合紫美石榴花粉离体培养。

6.本发明首次形成石榴花粉收集、干燥、保存和活力测定的体系，方法具有操作简单、迅速并且可重复性强等特点，同时该方法延长了石榴花粉有效贮藏时间，可提高石榴人工杂交授粉的成功率，保证杂交育种为石榴选育优良新品种的主要途径。

附图说明

图1花粉的干燥与收集

图2花粉贮藏

图3花粉活力测定步骤

图4不同培养液对石榴花粉萌发率的影响

图5不同贮藏时间，紫美石榴花粉萌发率的变化图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和要点更加清楚，下面结合本发明实施例和附图对本发明实施例中的技术方案进行详细的说明。

实施例

一种紫美石榴花粉贮藏方法，包括以下步骤：

(1)花粉收集：当石榴花处于盛花期时，于早晨8:00-10:00采集发育成熟、含苞欲放的花朵，保证花器官发育的有效性；盛花期是四川地区四月底至五月初，70％～75％紫美石榴花开放的时期。发育成熟的花即为花朵子房明显膨大、花型为葫芦状或筒状的花，所选花为完全花。

(2)花粉干燥：将采集的花朵小心摘除花瓣，放置室内自然干燥，自然干燥是于25℃室内自然光照下干燥24h；待花药开裂散粉时，轻轻振动花朵，将花粉均匀地收集在干净的白纸上，继续晾至花粉干燥，干燥状态是花粉完全散开，不成团状；

(3)花粉贮藏：将玻璃干燥器内部清洗干净，并用75％酒精擦拭内壁，将变色硅胶(一种颗粒状干燥剂，蓝色，吸水后变白)倒入并布满干燥器底部；将干燥好的石榴花粉装入容器中，封口，放置于密封的干燥器内，于4℃保存。容器为10ml离心管，保存是置于冰箱保鲜层4℃贮藏。

将干燥分装好的花粉多个温度梯度进行贮藏。自然干燥后的石榴花粉在下离心管内室温下保存，一周后花粉完全失去活力。当花粉贮藏温度为25℃或高于该温度时，花粉失水严重，影响后期萌发率；当贮藏温度处于0℃以下，细胞内自由水凝固，花粉细胞结构遭到破坏，使花粉丧失生活力。甘油等防冻剂的使用虽在一定程度上保护细胞免受低温损伤，但低温仍会对花粉造成不可避免的伤害，低温贮藏后花粉的复苏等步骤使得试验变得繁杂，通过多个温度比较，发现贮藏一周后4℃条件下花粉活力高达42.1％，实验结果最优，能够有效避免以上问题与弊端。

将贮藏的石榴花粉定期检测其生活力，培养时用糖源分别为蔗糖和葡萄糖两种液体培养基。滴1-2滴液体培养基在载玻片上，用大头针取少量花粉置于溶液中。将花粉均匀撒在液体培养基上。将载玻片放在湿度85％-90％的培养皿中，放置于培养箱中25℃进行培养(见图3)。12h后在光学显微镜下统计发芽花粉粒的数量，每个重复镜检3个以上具代表性的视野，计算花粉萌发率：花粉萌发率(％)＝花粉管长度大于花粉直径的花粉数量/视野内花粉总数×100％。

相同的处理及贮藏条件下，通过比较在ms中分别添加蔗糖和葡萄糖两种培养液对花粉萌发的影响发现，葡萄糖(40.7％)培养的花粉萌发率明显低于蔗糖(46.2％)(图4)。通过多组实验发现，ms+4.2g/l蔗糖，萌发率最好，同样作为碳源为花粉细胞提供能量来源，蔗糖比葡萄糖能更好的调节培养基内的渗透压，葡萄糖作为碳源易使细胞脱水而生长不良。由以上可知，石榴花粉活力测定适合用蔗糖培养液培养石榴花粉萌发。

通过数据分析发现，本发明的方法特别适合紫美石榴花粉的短期贮藏，在贮藏21天后，萌发率仍保持在32.48％，在花粉有效萌发率范围内(＞20.0％)，4℃下贮藏130天时萌发率依然可达21.5％。说明该贮藏方法能有效地维持石榴花粉活力。本发明贮藏了三个月的石榴花粉仍然可以用于杂交工作(图5)，满足我国石榴周年不同地区石榴的杂交育种及相关科研工作。