一种极早熟水稻的培育方法与流程

本发明涉及农作物遗传育种领域，具体涉及一种极早熟水稻的培育方法。

背景技术：

水稻生育期是水稻品种的重要农艺性状之一，直接影响水稻适宜的种植区域、种植季节及耕作方式。水稻品种的生育期可划分为营养生长期、营养生长和生殖生长并进期及结实成熟期三个阶段。一般的，水稻的营养生长和生殖生长并进期及结实成熟期所需时间相对稳定,因此,不同品种生育期的长短主要是由营养生长期的长短决定。

早熟水稻品种因有较短的生育期，生产上可有更灵活的季节安排，也有更广泛的区域适应性，因此，早熟水稻品种越来越受到生产者的青睐。目前，生产上应用的早熟水稻品种，都或长或短地存在一段营养生长阶段。植株的有效分蘖基本在营养生长阶段完成，主穗和分蘖穗同时进入生殖生长，主穗成熟期与分蘖穗的成熟期差异不大，生育期基本一致。这些早熟水稻品种由于有一段营养生长阶段，其早熟是相对的，理论上，没有营养生长阶段的水稻生育期最短。

水稻是多蘖植物，主茎和分蘖形成有一定的时序差异。营养生长阶段太短或没有营养生长阶段的早熟水稻材料，往往主穗极早抽穗，而分蘖穗抽穗较迟，主穗成熟期和分蘖穗成熟期差异较大，田间表现主穗上的种子已经成熟，甚至过熟霉烂，而部分分蘖穗才抽穗。这种主穗极早熟材料整株熟期不一致，不仅限制了极端早熟（与主穗生育期相近）水稻品种的培育，也制约着它们在生产上的推广应用。

由于主穗极早熟材料主穗与分蘖间成熟期不一致，主要是分蘖穗形成的先后造成的，越早形成的分蘖可能抽穗越早，而迟形成的分蘖穗抽穗期迟。因此，分蘖穗越多，最后形成的穗抽穗及成熟就越迟，主穗成熟期与整株成熟期的差异就越大。为了解决这一问题，本发明提供了一个有效的策略和方法，即通过遗传改良或杂交育种方法减少早熟突变体材料的分蘖数，使其达到寡蘖。这一策略不仅可以减少主穗和整株成熟期的差异，达到生产上可以接受的水平，而且可以使整株的生育期更短，熟期更早（与主穗成熟期相近）。

技术实现要素：

由于水稻品种的营养生长和生殖生长并进期、结实成熟期所经历的时间相对固定，不同品种生育期的差异主要是由营养生长期的不同决定的。为了培育生育期尽可能短的品种，可选择营养生长期尽可能短的种质资源，其极端情况是选择没有营养生长期的种质，水稻品种生育期可达到最短。

但营养生长期太短，会出现主穗和分蘖穗成熟期差异较大（因为分蘖形成存在时间差），易造成主穗变成无效穗（穗太小或种子过熟损失），影响产量；而且整株成熟期比主穗成熟期显著推迟，这种推迟主要是分蘖引起的。

为了解决上述问题，本发明提供了一种极早熟水稻的培育方法，即利用水稻主穗早熟材料的早熟特性结合寡蘖的少蘖特性，通过调控水稻分蘖数控制水稻生育期，同时减少主穗和整株成熟期之间的差异，培育流程如图1所示。

本发明的主要内容包括：一种极早熟水稻的培育方法，包括以下步骤：

（1）寡蘖早熟水稻中间材料的创制；

（2）寡蘖早熟水稻品种培育；

（3）寡蘖早熟水稻直播种植。

步骤（1）所述寡蘖早熟水稻中间材料是通过杂交或基因组编辑方法创制得到；所述的寡蘖是指总穗数1-3穗的水稻。

所述利用杂交方法创制寡蘖早熟水稻中间材料是通过主穗早熟水稻材料与寡蘖水稻品种杂交，然后自交，每代筛选寡蘖早熟个体，创制遗传稳定的寡蘖早熟水稻中间材料。

所述主穗早熟水稻材料为主穗播始期50天以内，而分蘖穗抽穗较主穗抽穗迟10天以上，整株熟期与主穗熟期相差10天以上的水稻材料。

所述利用基因组编辑法创制寡蘖早熟水稻中间材料是通过基因组编辑技术修饰控制水稻分蘖数基因，减少主穗早熟水稻的穗数，获得寡蘖早熟水稻中间材料。

步骤（2）所述寡蘖早熟水稻品种培育方法为：利用权利要求2-5任一所述获得的寡蘖早熟水稻中间材料与优良水稻品种杂交，并以所述优良水稻品种为轮回亲本，与杂种后代连续回交4-5代，然后自交，获得具有轮回亲本背景生育期90天以内的寡蘖早熟优良水稻品种。

步骤（3）所述寡蘖早熟水稻直播种植是将权利要求6获得的具有轮回亲本背景生育期90天以内的寡蘖早熟优良水稻品种进行直播种植。

本发明的主要优点是：

1)本发明通过显著减少水稻主穗早熟材料的分蘖数，使整株成熟期和主穗成熟期接近，减少因主穗和整株成熟期差异较大对水稻主穗早熟材料利用限制，可以充分利用主穗早熟材料的早熟性，培育早熟寡蘖水稻品种。

2)本发明提供了一种新的水稻株型或品种改良策略和方法，尤其是寡蘖早熟水稻品种的培育和应用，将会改变传统的栽培模式和耕作制度，由于分蘖极少或没有分蘖，通过协调产量构成因子（有效分蘖、穗粒数、千粒重）的高产育种模式被打破，有利于形成新的培育高产、优质、高抗和广适应品种的思想和方法。

附图说明

图1为一种极早熟水稻的培育流程图。

图2为不同熟期水稻品种全生育期生长阶段示意图。

图3为水稻水稻短生育期突变体sgp(t)主穗抽穗情况；其中a为播种后46天；b为播种后102天整株成熟，标尺bar=10cm。

图4为播种后70天(a和b)及82天（c）的寡蘖早熟水稻中间材料fte；标尺bar=10cm。

具体实施方式

目前可被利用其早熟性的早熟水稻资源，一般是由自然突变或人工突变水稻抽穗期相关基因而来，其特点是要求主穗成熟期和其分蘖穗成熟期相近或差异不大，否则因抽穗不整齐在育种过程中被淘汰。因此，被利用的早熟水稻资源或利用其培育的品种，都或长或短存在营养生长期，其早熟是相对的，有限的，水稻早熟品种相对迟熟品种主要是营养生长期短，极端情况是没有营养生长期，水稻品种达到极早熟（图2）。而营养生长期极短或没有的水稻主穗早熟资源，通过传统的培育策略和方法难以直接应用，也难以培育出真正极端早熟的水稻品种。

本发明针对水稻主穗早熟资源的主穗成熟期与分蘖穗成熟期差异较大的缺陷和整株生育期的延迟是由于分蘖穗的成熟较迟的特征，提出通过转基因或基因突变或杂交育种的方法减少主穗早熟水稻的分蘖数，创制寡蘖早熟水稻，进而培育适合直播种植的早熟（寡蘖）的优良水稻品种。

下面通过实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：利用杂交法创制寡蘖早熟水稻材料

利用一个水稻短生育期突变体sgp(t)（其特征是主穗早熟）(刘华清等(2008),科学通报,53(13):1552-1559，图3)与寡蘖水稻品种南昌恢杂交，杂种f1种植后自交，获得f2种子，种植1500株的f2群体；按单株调查主穗抽穗期、分蘖、整株成熟期，结合考察其他农艺性状，选择叶片紧凑直立型、株高少于1m、结实率85%以上、主穗播始期50天以内、寡蘖（总穗数≤3）、整株成熟期90天以内的植株按单株收种，种植成f3株系；随后按上述方法选择种植f4、f5、f6，获得生育期70天（图4a,b）或82天(图4c)的寡蘖早熟水稻中间材料fte(few-tilleringearliness)。

实施例2：利用基因组编辑技术创制寡蘖早熟水稻材料

1、基因组编辑靶位点选择及载体构建

选择水稻理想株型基因ipa1，利用pcr扩增短生育期突变sgp(t)背景下ipa1基因序列，测序后比对发现其ipa1基因序列与日本晴的一致。依据crispr/cas9靶位点设计原则，在mirna156结合的位点区选择了2个靶位，其序列分别为：

cipa1-1，tctcttctgtcaacccagccatgg；

cipa1-2，tctctctcttctgtcaacccagc。

利用的是北京唯尚立德公司提供的植物cas9/grna质粒（vk005-01cas9/grnavector）骨架，其中已包括35s启动子和其启动的潮霉素抗性基因、ubi启动子和其启动的已经优化的适应于的水稻的cas9蛋白、以及启动grna的ru6启动子，还包括grna的部分碱基序列，只是缺少与靶序列匹配结合的18-20bp的碱基序列。载体构建过程按公司提供的载体试剂盒使用说明书进行，首先依据grna序列要求合成靶位点正反链引物，随后将两条引物聚合成双链寡核苷酸二聚体（oligoduplex），然后将聚合的寡核苷酸二聚体插入到载体vk005-01cas9/grnavector中，测序确定，构建完整的crispr/cas9表达载体cipa1-1和cipa1-2。

2、水稻遗传转化及转基因阳性植株筛选

采用农杆菌介导籼稻胚性愈伤转化方法将构建的cipa1-1和cipa1-2载体转化到sgp(t)中（转化过程参见：苏军等，2003，农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立;福建农业学报，18(4):209-213），两个载体分别获得转基因再生克隆植株35株和63株。这些再生植株用pcr技术检测转基因阳性植株，检测引物为：

czf,5’gggagatccagctagaggtc3’,

czr,5’ggaaggaggaagacaagg3’。

cipa1-1和cipa1-2转基因植株中分别检测到阳性植株28株和50株。

3、转基因阳性植株中靶位点序列检测

对于载体cipa1-1和cipa1-2获得t0代阳性转基因植株，用引物ipa1-f2/ipa1-r2，扩增ipa1基因的靶位点区；

ipa1-f2,acagcagcagtggatagg,

ipa1-r2，cattattattcatcacagggag

测序分析发现，cipa1-1阳性转基因植株检测到11个靶序列突变植株，cipa1-2阳性转基因植株中检测13个靶序列突变植株。获得的这24个突变体中，有22个是移码突变体（缺失或插入非3的倍数个碱基），另2个突变体发生非移码突变，它们分别是的10号转基因植株（编号cipa1-1-10）在mirna156识别序列区缺失3个碱基（-ctg:gtgctctctctcttctgtcaaccca变成了gtgctctctctctt---tcaaccca）和cipa1-1的13号转基因植株（编号cipa1-1-13）在mirna156识别序列区发生了一个碱基的替换(c替换成t：gtgctctctctcttctgtcaaccca变成了gtgctctctctcttttgtcaaccca)。

4、突变体t1植株分蘖数调查及无转基因成分寡蘖早熟突变体的筛选

将检测到的突变t0代植株收种，并分别种植成t1株系，其中移码突变体每株系种60株，非移码突变体每株系种植120株。所有植株均表现主穗早熟，进一步对有效穗数调查发现，移码突变体株系各单株有效穗数在14-25穗之间，没有寡蘖植株分离。两个非移码突变体株系出现寡蘖分离，cipa1-1-10株系中有23株寡蘖，另有5株少蘖（4-6蘖）；cipa1-1-13株系中有19株寡蘖，另有7株少蘖。随后利用czf/czr引物，在cipa1-1-10和cipa1-1-13的寡蘖植株中分别筛选到无转基因成分寡蘖早熟植株3株。

实施例3：寡蘖早熟水稻品种培育

利用实施例1中创制的早熟寡蘖水稻中间材料fte与水稻优良品种明恢86、93-11杂交，杂种f1分别与其对应的明恢86、93-11回交，选择早抽穗寡蘖的回交1代（bc1）植株继续与轮回亲本回交，至回交5代（bc5）植株进行自交，获得纯合的具有轮回亲本背景的寡蘖早熟水稻品种早熟明恢86（e86）、早熟93-11（e9311），它们的生育期分别为76天和78天。

实施例4：寡蘖早熟水稻直播种植

利用实施例3培育的寡蘖早熟水稻品种e86、e9311进行直播种植试验，试验分3种直播密度：6kg/亩、8kg/亩、10kg/亩；每小区10m²,3次重复。按照常规方法进行田间施肥，但全生育期只施一次肥（基肥）。全生育期（播种到成熟历期）78天，小区测产折合亩产量334.4kg-387.5kg,其中两个品种均以播种密度8kg/亩的产量最高，分别达到387.5kg/亩和384.8kg/亩（表1）。

表1新培育两个寡蘖早熟水稻品种e86、e9311直播种植试验情况

sequencelisting

<110>福建省农业科学院生物技术研究所

<120>一种极早熟水稻的培育方法

<130>9

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tctcttctgtcaacccagccatgg24

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tctctctcttctgtcaacccagc23

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gggagatccagctagaggtc20

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggaaggaggaagacaagg18

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

acagcagcagtggatagg18

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cattattattcatcacagggag22

<210>7

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gtgctctctctcttctgtcaaccca25

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gtgctctctctctttcaaccca22

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gtgctctctctcttttgtcaaccca25