本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及一种动物鲜精低温稀释液及其制备方法与应用。
背景技术：
人工授精技术对提高公畜利用率，加快品种改良，降低了饲养管理成本，防止各种疾病传播，提高受胎率和进行远距离交流、运输等方面有着重要价值。目前，肉牛的人工授精技术在大部分地区已经实施，羊的人工授精技术只是在个别规模化羊场采用，如果开展优质肉羊杂交改良，需要由种羊场向较远距离羊场或养羊户输送精液，羊的冷冻精液人工授精技术虽然有个别羊场为了加速品种改良而应用，但因受胎率过低，未能广泛开展，目前仍需低温液态保存和运输。随着肉羊产业的发展，优质肉羊品种的杂交利用发展迅速，但由于种羊数量有限，仍需人工授精技术来提高种公羊的利用率，低温精液稀释液的研制和推广有效改善精液保存效果，减少精液浪费。因此，人们针对稀释液成份、制作过程等开展相关研究。国内关于绵羊精液液态保存的相关有效突破报道不是太多，并且目前没有针对澳洲白绵羊鲜精低温保存的报道。申请号为201510046734.8，申请名称为“一种绵羊鲜精保存稀释液及其应用”的中国专利申请公开了一种绵羊鲜精保存稀释液，其主要成份在常规液中加入虾青素。赵晓娥等(赵晓娥,王光亚.布尔山羊精液保存条件的试验研究[j].动物医学进展,1999(2):31-33.)对不同条件下，用不同成分的黧液保存布尔山羊精液的效果进行了对比试验，其中，含30g/l葡萄糖、lg/ledta、13g/ml柠檬酸钠和5％卵黄的稀释液在4℃外界环境条件下对布尔羊精液进行保存，保存96h后活力可以达到52％。李助南等(李助南,郭良辉,袁微,等.不同稀释液对山羊精液的保存效果[j].湖北农学院学报,2001,21(3):217-219.)利用不同配方稀释液保存山羊精液，比较不同理化条件下稀释液的保存效果，其中，v号稀释液以5倍稀释，在常温条件下保存49.7h后绵羊精子活力不小于30％；在5℃条件下保存58.0h后绵羊精子活力不小于30％，精液受胎率为81.4％。周佳勃(周佳勃.山羊体外受精和显微受精及相关问题的研究[d].东北农业大学,2003.)在androhep稀释液中添加卵黄，对精子进行卵黄包被处理，保存8天精子活力不小于30％，但是保存9天后，精子的受精能力以及受精后的胚胎发育能力却显著降低。高维强(用mes稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究[d].山东农业大学，2012:59-60)用所研制的mes稀释液，以及采用卵黄包被处理后，在5℃条件下保存16天后绵羊精子活力仍可维持在30％以上。孟娜娜等(孟娜娜,孙树春,王寒阳,等.绵羊精液4℃液态保存的稀释液配方优化研究[j].中国畜牧杂志,2015,51(5):34-38.)研究绵羊精液液态保存的稀释液配方优化研究，结果表明，以0.375％的大豆卵磷脂取代绵羊精液低温保存稀释液中的卵黄，对精子保存效果最好。赵金红等(赵金红,彭海梅,周鹏,等.酉州乌羊精液品质评定及稀释液配方研究[j].中国草食动物科学,2014,30(s1):6-10.)研究筛选适合酉州乌羊精液的优良稀释液配方，其中，稀释液ⅲ号(葡萄糖1.25g，果糖1.25g、柠檬酸钠1.2g，edta0.24g，nahco30.125g，hepes0.90g，pva0.25g，牛磺酸0.26g、青霉素和链霉素各10万单位)适用于精液保存。
糖类物质可分为单糖、双糖和多糖等。其中，单糖中的果糖、葡萄糖能够穿过精子质膜进入精子，在质膜内进行进一步分解代谢产生能量，为精子提供能量；其它的糖类比如蔗糖、海藻糖和葡聚糖、棉子糖，这些糖虽不能穿过精子的质膜，但是这类糖类在外界为精子提供一定的渗透压，生理上使细胞适度脱水，从而降低胞内冰晶形成几率，并且能与质膜磷脂相互作用，进而提高精子质膜稳定性，有利于精子存活。现在研究中，大多精子稀释液配方成份较多，操作复杂。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种动物鲜精低温稀释液，该稀释液可以将动物精液以液态形式低温0～5℃条件下保存至1～2天，可以达到人工授精的要求，提高了鲜精保存品质，该稀释液制作方法简单，原料成本低，可操作性强，便于生产中推广应用。
本发明的另一目的在于提供上述动物鲜精低温稀释液的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述动物鲜精低温稀释液的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种动物鲜精低温稀释液，包含如下组分：葡萄糖、柠檬酸钠、青霉素、链霉素、恩诺沙星、卵黄、脱脂牛奶、维生素a、维生素d、维生素e和水，其中，葡萄糖、柠檬酸钠、青霉素、链霉素、恩诺沙星、维生素a、维生素d、维生素e和水的质量比为(2～5)：(2～5)：(50×10-3～100×10-3)：(30×10-3～60×10-3)：(1×10-3～1.25×10-3)：(400×10-6～600×10-6)：(200×10-6～400×10-6)：(200×10-6～400×10-6)：100，卵黄、脱脂牛奶和水的体积比为(8～12)：(8～12)：100；
所述的动物鲜精低温稀释液的制备方法，包含如下步骤：
(1)将葡萄糖和柠檬酸钠溶于水中，得到基础液；
(2)将卵黄、脱脂牛奶、青霉素、链霉素和恩诺沙星与步骤(1)制得的基础液混合均匀，得到混合液；然后再加入维生素a、维生素d和维生素e，混合均匀，得到动物鲜精低温稀释液；
步骤(2)中所述的脱脂牛奶优选经90～95℃水浴灭菌10min；
步骤(2)中所述的混合液的制备方法优选为：
将卵黄和脱脂牛奶依次加入步骤(1)制得的基础液中混合均匀，然后加入青霉素、链霉素和恩诺沙星，混合均匀，得到混合液；
或将卵黄和脱脂牛奶依次加入部分步骤(1)制得的基础液中混合均匀，得到a液，将青霉素、链霉素和恩诺沙星加入剩余步骤(1)制得的基础液中混合均匀，得到b液，将b液加入到a液中，混合均匀，得到混合液；
所述的动物鲜精低温稀释液在动物鲜精保存领域中的应用；
所述的动物优选为澳洲白绵羊；
所述的动物鲜精低温稀释液在动物鲜精保存领域中的应用，包含如下步骤：
将动物鲜精低温稀释液缓慢加入到动物新鲜精液中，混合均匀，缓慢降温至0～5℃，然后置于0～5℃条件下保存；
所述的动物鲜精低温稀释液的温度优选与动物新鲜精液的温度相同；
所述的动物鲜精低温稀释液和动物新鲜精液的温度优选为25～37℃；
所述的动物鲜精低温稀释液和动物新鲜精液的温度进一步优选为30℃；
所述的动物鲜精低温稀释液和动物新鲜精液的质量比优选为(6～10)：1；
所述的降温速度优选为0.1～0.4℃/min，降温过程要缓慢进行，不能迅速降温到10℃以下，避免精子受到冷应激；
所述的降温速度进一步优选为0.2℃/min；
本发明的原理：
维生素a(va)是一种环状不饱和一元醇，具有多种生理作用，不足会出现多种症状，如生长迟缓、骨骼畸形、繁殖器官退化、夜盲症等。精液中添加维生素a可有延缓性功能衰退的作用、提高精子存活时间。
维生素d(vd)为类固醇衍生物，其功能为促进钙磷吸收、代谢和成骨作用。缺乏维生素d引起钙和磷代谢障碍，羔羊出现佝偻病，成年羊出现骨组织疏松症。精液中添加维生素d改善精子质量，增加精子的运动能力，提高母羊授配率。
维生素e又叫抗不育维生素，化学结构类似酚类的化合物，极易氧化，具有生物学活性，其中以α-生育酚活性最高。维生素e有延缓性功能衰退的作用，维生素e有利精子的生成和提高精子的活力，从而提高授配率。
恩诺沙星为广谱抗生素，具有较强的杀茵作用，将其加到精液低温保存稀释液中，能延长精子的存活时间。
本发明中，动物鲜精低温稀释液最好缓缓加入精液中，不要将精液倒入动物鲜精低温稀释液中，稀释后应轻轻混合均匀，避免剧烈振荡，从而保证精子质量。经动物鲜精低温稀释液稀释保存的精液在输精前可直接进行升温处理，升温的速度对精子质量基本无影响(例如：可将贮精瓶直接投入30℃温水中即可)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的动物鲜精低温稀释液能使绵羊鲜精在低温0～5℃条件下保存24h后，活力达70％以上，母羊受胎率达75％以上；72h后活力达50％以上，母羊受胎率达70％以上。
(2)本发明提供的动物鲜精低温稀释液制备方法简单、生产成本低廉，应用效果好，可以在生产中大规模推广应用。
(3)本发明提供的动物鲜精低温稀释液对精子的稀释倍数高，提高了每只优秀种公羊的授配母羊数。
(4)本发明可以将动物精液以液态形式低温0～5℃条件下保存至1～2天，可以达到人工授精的要求，提高了鲜精保存品质，从而提高优良种公羊的利用率并获得高的母羊受胎率，解决了优秀种公羊采精后远距离运输问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种动物鲜精低温稀释液的制备方法，包含如下步骤：
(1)分别称取3g分析纯葡萄糖和3g柠檬酸钠加入100ml蒸馏水中，搅拌至溶解，然后120℃高压灭菌30min，冷却，得到基础液；
(2)新鲜鸡蛋用体积分数为75％的酒精棉球消毒外壳，待其完全挥发后，将鸡蛋磕开，分离蛋清、蛋黄和系带，将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内，并小心地将蛋黄倒在用四层对折(8层)的消毒纸巾上；小心地使蛋黄在纸巾上滚动，使其表面的稀蛋清被纸巾吸附；然后用针头小心将卵黄膜挑一个小口，再用去掉针头的10ml的一次性注射器，从小口慢慢吸取卵黄，尽量避免将气泡吸入，同时应避免吸入卵黄膜，得到卵黄；将10ml卵黄加入步骤(1)制得的基础液中，混合均匀；
(3)将新鲜脱脂牛奶置于烧杯中，92℃水浴灭菌10min，除去奶皮，取灭菌后的10ml脱脂牛奶加入步骤(2)制得的含有卵黄的基础液中，混合均匀；
(4)将60mg青霉素、50mg链霉素和1.1mg的恩诺沙星依次加入步骤(3)制得的含有卵黄和脱脂牛奶的基础液中，混匀使其彻底溶解，得到混合液；
(5)在步骤(4)制得的混合液中加入400μg维生素a、200μg维生素d和200μg维生素e，混合均匀，得到动物鲜精低温稀释液。
实施例2
一种动物鲜精低温稀释液的制备方法，包含如下步骤：
(1)分别称取5g分析纯葡萄糖和5g柠檬酸钠加入100ml蒸馏水中，搅拌至溶解，然后120℃高压灭菌30min，冷却，得到基础液；
(2)新鲜鸡蛋用体积分数为75％的酒精棉球消毒外壳，待其完全挥发后，将鸡蛋磕开，分离蛋清、蛋黄和系带，将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内，并小心地将蛋黄倒在用四层对折(8层)的消毒纸巾上；小心地使蛋黄在纸巾上滚动，使其表面的稀蛋清被纸巾吸附；然后用针头小心将卵黄膜挑一个小口，再用去掉针头的10ml的一次性注射器，从小口慢慢吸取卵黄，尽量避免将气泡吸入，同时应避免吸入卵黄膜，得到卵黄；将12ml卵黄加入步骤(1)制得的基础液中，混合均匀；
(3)将新鲜脱脂牛奶置于烧杯中，90℃水浴灭菌10min，除去奶皮，取灭菌后的12ml脱脂牛奶加入步骤(2)制得的含有卵黄的基础液中，混合均匀；
(4)将100mg青霉素、60mg链霉素和1.25mg的恩诺沙星依次加入步骤(3)制得的含有卵黄和脱脂牛奶的基础液中，混匀使其彻底溶解，得到混合液；
(5)在步骤(4)制得的混合液中加入600μg维生素a、400μg维生素d和400μg维生素e，混合均匀，得到动物鲜精低温稀释液。
实施例3
一种动物鲜精低温稀释液的制备方法，包含如下步骤：
(1)分别称取2g分析纯葡萄糖和2g柠檬酸钠加入100ml蒸馏水中，搅拌至溶解，然后120℃高压灭菌30min，冷却，得到基础液；
(2)新鲜鸡蛋用体积分数为75％的酒精棉球消毒外壳，待其完全挥发后，将鸡蛋磕开，分离蛋清、蛋黄和系带，将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内，并小心地将蛋黄倒在用四层对折(8层)的消毒纸巾上；小心地使蛋黄在纸巾上滚动，使其表面的稀蛋清被纸巾吸附；然后用针头小心将卵黄膜挑一个小口，再用去掉针头的10ml的一次性注射器，从小口慢慢吸取卵黄，尽量避免将气泡吸入，同时应避免吸入卵黄膜，得到卵黄；将8ml卵黄加入30ml步骤(1)制得的基础液中，混合均匀；
(3)将新鲜脱脂牛奶置于烧杯中，95℃水浴灭菌10min，除去奶皮，取灭菌后的8ml脱脂牛奶加入步骤(2)制得的含有卵黄的基础液中，混合均匀，得到a液；
(4)将50mg青霉素、30mg链霉素和1.0mg的恩诺沙星依次加入剩余步骤(1)制得的基础液中，混匀使其彻底溶解，得到b液；将b液加入到步骤(3)制得的a液中，混合均匀，得到混合液；
(5)在步骤(4)制得的混合液中加入500μg维生素a、300μg维生素d和300μg维生素e，混合均匀，得到动物鲜精低温稀释液。
对比实施例1
一种动物鲜精低温稀释液的制备方法，包含如下步骤：
(1)分别称取分析纯葡萄糖3g和柠檬酸钠3g加入100ml蒸馏水中，搅拌至溶解，然后120℃高压灭菌30min，冷却，得到基础液；
(2)新鲜鸡蛋用体积分数为75％的酒精棉球消毒外壳，待其完全挥发后，将鸡蛋磕开，分离蛋清、蛋黄和系带，将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内，并小心地将蛋黄倒在用四层对折(8层)的消毒纸巾上；小心地使蛋黄在纸巾上滚动，使其表面的稀蛋清被纸巾吸附；然后用针头小心将卵黄膜挑一个小口，再用去掉针头的10ml的一次性注射器，从小口慢慢吸取卵黄，尽量避免将气泡吸入，同时应避免吸入卵黄膜，得到卵黄；将10ml卵黄加入步骤(1)制得的基础液中，混合均匀；
(3)将新鲜脱脂牛奶置于烧杯中，92℃水浴灭菌10min，除去奶皮，取灭菌后的10ml脱脂牛奶加入步骤(2)制得的含有卵黄的基础液中，混合均匀；
(4)将60mg青霉素、50mg链霉素和1.1mg的恩诺沙星依次加入步骤(3)制得的含有卵黄和脱脂牛奶的基础液中，混匀使其彻底溶解，得到动物鲜精低温稀释液。
对比实施例2
一种动物鲜精低温稀释液的制备方法，包含如下步骤：
(1)分别称取5g分析纯葡萄糖和5g柠檬酸钠加入100ml蒸馏水中，搅拌至溶解，然后120℃高压灭菌30min，冷却，得到基础液；
(2)新鲜鸡蛋用体积分数为75％的酒精棉球消毒外壳，待其完全挥发后，将鸡蛋磕开，分离蛋清、蛋黄和系带，将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内，并小心地将蛋黄倒在用四层对折(8层)的消毒纸巾上；小心地使蛋黄在纸巾上滚动，使其表面的稀蛋清被纸巾吸附；然后用针头小心将卵黄膜挑一个小口，再用去掉针头的10ml的一次性注射器，从小口慢慢吸取卵黄，尽量避免将气泡吸入，同时应避免吸入卵黄膜，得到卵黄；将12ml卵黄加入步骤(1)制得的基础液中，混合均匀；
(3)将新鲜脱脂牛奶置于烧杯中，90℃水浴灭菌10min，除去奶皮，取灭菌后的12ml脱脂牛奶加入步骤(2)制得的含有卵黄的基础液中，混合均匀；
(4)将100mg青霉素、60mg链霉素和1.25mg的恩诺沙星依次加入步骤(03)制得的含有卵黄和脱脂牛奶的基础液中，混匀使其彻底溶解，得到动物鲜精低温稀释液。
对比实施例3
一种动物鲜精低温稀释液的制备方法，包含如下步骤：
(1)分别称取分析纯葡萄糖2g和柠檬酸钠2g加入100ml蒸馏水中，搅拌至溶解，然后120℃高压灭菌30min，冷却，得到基础液；
(2)新鲜鸡蛋用体积分数为75％的酒精棉球消毒外壳，待其完全挥发后，将鸡蛋磕开，分离蛋清、蛋黄和系带，将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内，并小心地将蛋黄倒在用四层对折(8层)的消毒纸巾上；小心地使蛋黄在纸巾上滚动，使其表面的稀蛋清被纸巾吸附；然后用针头小心将卵黄膜挑一个小口，再用去掉针头的10ml的一次性注射器，从小口慢慢吸取卵黄，尽量避免将气泡吸入，同时应避免吸入卵黄膜，得到卵黄；将8ml卵黄加入30ml步骤(1)制得的基础液中，混合均匀；
(3)将新鲜脱脂牛奶置于烧杯中，95℃水浴灭菌10min，除去奶皮，取灭菌后的8ml脱脂牛奶加入步骤(2)制得的含有卵黄的基础液中，混合均匀，得到a液；
(4)将51μg青霉素和30μg链霉素依次加入剩余步骤(1)制得的基础液中，混匀使其彻底溶解，得到b液；将b液加入到步骤(3)制得的a液中，混合均匀，得到动物鲜精低温稀释液。
效果实施例1
(1)新鲜精液的获取
采精前一周内每只种澳洲白绵羊公羊开始补饲鸡蛋3枚/d，胡萝卜100克。种公羊每天运动一次，早晨6:00开始，8:00结束；每日采精前对采精公羊驱赶运动，懒惰的以发情母羊引诱，路程3km，平均时速9km/h，采用从热身慢到加速快再到缓缓降下的方法，休息0.5h后开始采精，采用假阴道法采集澳洲白绵羊的精液。
(2)新鲜精液的稀释
将实施例1或对比实施例1制得的动物鲜精低温稀释液(30℃)按照质量比6:1缓慢加入到步骤(1)获得的澳洲白绵羊新鲜精液(30℃)中，混合均匀，避免剧烈振荡；然后按照0.2℃/min的降温速度缓慢降温至0℃，然后置于0℃条件下保存；
(3)效果检查
每天四次，每间隔6h检测一次，时间分别为6:00、12:00、18:00、24:00，分别检测精子的活力、死亡率和畸型率等指标。同时，将不同保存时间处理后的精液稀释液对经过用cidr同期发情处理的母羊100只进行人工授精，输精前精液稀释液进行升温处理，将贮精瓶直接投入30℃温水中即可。
表1实施例1制得的动物鲜精低温稀释液的效果评价
表2对比实施例1制得的动物鲜精低温稀释液的效果评价
通过测定分析，实施例1制得的动物鲜精低温稀释液中添加脱脂牛奶和维生素a、维生素d和维生素e有助于提高精子活力和保存时间，该稀释液制备操作过程简便有效，快速可行，精子保存24h后，活力能达到70％以上，可用于绵羊鲜精规模化人工授精。
效果实施例2
(1)新鲜精液的获取
采精前一周内每只种澳洲白绵羊公羊开始补饲鸡蛋3枚/d，胡萝卜100克。种公羊每天运动一次，早晨6:00开始，8:00结束；每日采精前对采精公羊驱赶运动，懒惰的以发情母羊引诱，路程3km，平均时速9km/h，采用从热身慢到加速快再到缓缓降下的方法，休息0.5h后开始采精，采用假阴道法采集澳洲白绵羊的精液。
(2)新鲜精液的稀释
将实施例2或对比实施例2制得的动物鲜精低温稀释液(30℃)按照质量比10:1缓慢加入到步骤(1)获得的澳洲白绵羊新鲜精液(30℃)中，混合均匀，避免剧烈振荡；然后按照0.2℃/min的降温速度缓慢降温至0℃，然后置于0℃条件下保存；
(3)效果检查
每天四次，每间隔6h检测一次，时间分别为6:00、12:00、18:00、24:00，分别检测精子的活力、死亡率和畸型率等指标。同时，将不同保存时间处理后的精液稀释液对经过用cidr同期发情处理的母羊100只进行人工授精，输精前精液稀释液进行升温处理，将贮精瓶直接投入30℃温水中即可。
表3实施例2制得的动物鲜精低温稀释液的效果评价
表4对比实施例2制得的动物鲜精低温稀释液的效果评价
通过测定分析，实施例2制得的动物鲜精低温稀释液中添加脱脂牛奶和维生素a、维生素d和维生素e有助于提高精子活力和保存时间，该稀释液制备操作过程简便有效，快速可行，精子保存24h后，活力能达到70％以上，可用于绵羊鲜精规模化人工授精。
效果实施例3
(1)新鲜精液的获取
采精前一周内每只种澳洲白绵羊公羊开始补饲鸡蛋3枚/d，胡萝卜100克。种公羊每天运动一次，早晨6:00开始，8:00结束；每日采精前对采精公羊驱赶运动，懒惰的以发情母羊引诱，路程3km，平均时速9km/h，采用从热身慢到加速快再到缓缓降下的方法，休息0.5h后开始采精，采用假阴道法采集澳洲白绵羊的精液。
(2)新鲜精液的稀释
将实施例3或对比实施例3制得的动物鲜精低温稀释液(30℃)按照质量比8:1缓慢加入到步骤(1)获得的澳洲白绵羊新鲜精液(30℃)中，混合均匀，避免剧烈振荡；然后按照0.2℃/min的降温速度缓慢降温至0℃，然后置于0℃条件下保存；
(3)效果检查
每天四次，每间隔6h检测一次，时间分别为6:00、12:00、18:00、24:00，分别检测精子的活力、死亡率和畸型率等指标。同时，将不同保存时间处理后的精液稀释液对经过用cidr同期发情处理的母羊100只进行人工授精，输精前精液稀释液进行升温处理，将贮精瓶直接投入30℃温水中即可。
表5实施例3制得的动物鲜精低温稀释液的效果评价
表6对比实施例3制得的动物鲜精低温稀释液的效果评价
通过测定分析，与对比实施例3相比，实施例3制得的动物鲜精低温稀释液中添加恩诺沙星、维生素a、维生素d和维生素e有助于提高精子活力和保存时间。
上述实施例中，凡是人工授精使用的器械，都必须经过严格的消毒。在消毒以前，应将器械洗净擦干，然后按器械的性质、种类分别包装。消毒时，除不易放入或不能放入高压消毒锅(或蒸茏)的金属器械、玻璃输精器及胶质的内胎以外，一般都应尽量采用蒸汽消毒，其他采用酒精或火焰消毒。蒸汽消毒时，器材应按使用的先后顺序放入消毒锅，以免使用时在锅内翻上翻下，耽误时间。凡士林、生理盐水棉球用前均需消毒好。消毒好的器材、药液要防止污染并注意保温。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。