本发明涉及临床医学
技术领域：
，具体涉及细胞冻存液、细胞冻存复苏方法及其应用。
背景技术：
：细胞治疗在各大疾病领域上发挥重要作用，细胞治疗是利用成体细胞或干细胞对组织或器官进行修复的治疗方法。其中，干细胞和免疫细胞是疾病治疗的种子细胞。干细胞由于具有自我更新和多向分化的潜能，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞，已经被广泛应用于科学研究和临床治疗。随着细胞替代治疗的发展，干细胞移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要手段。目前在世界范围内已经有干细胞药物产品上市，随着科技的发展，干细胞会更有效和广泛的用于各种疾病的治疗，以弥补传统药物治疗对于某些疾病效果不佳的不足。人们需要将有用细胞种子资源保存起来以供日后的方便使用，以及在需要时用于科学研究和临床治疗。免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者放疗、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。提前将免疫细胞培养好并冻存起来，待到需要时立刻复苏并回输，则可解决临床治疗过程中时间冲突的问题，并且随时可以使用，对于医生选择治疗方案相当有利。目前细胞的低温保存需要添加冷冻保护剂，如果直接冷冻细胞内会产生冰晶对细胞造成伤害从而导致细胞死亡。冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，其中，渗透性冷冻保护剂对细胞冻存起到重要的作用，包括二甲基亚砜(dmso)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、和甲酰胺等。渗透型冷冻保护剂能够穿过细胞膜渗透到细胞内，其中最常用的就是dmso，dmso能够渗透到细胞内增大胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程。但是dmso对细胞存在一定的毒性，在一些临床治疗案例中，注射了含有dmso的细胞的病人表现出恶心、头痛、高血压和腹部绞痛等症状。因此，对于临床治疗的细胞应该尽量减少dmso的用量，或将其替换为一种更安全的冷冻保护剂。目前已经有一些公司生产出不含dmso成分的冻存液，例如，日本全药工业株式会社生产的gmp级无血清无dmso的细胞冻存液，其冷冻保护剂为1，2--丙二醇，虽然毒性较低，但制造商研制过程中从未用它测试过治疗用的细胞类型。专利ep2305792a公开的技术使用了不含动物源成分、不含dmso的细胞冻存液，使用安全无毒的琥珀酰-ε-多聚赖氨酸作为冷冻保护剂替代有毒的dmso，没有引入任何动物源性物质，减少了污染的几率。但是其所公开的细胞冻存液在长时间保存细胞时对细胞造成一定程度的损伤，细胞存活率有待进一步提高。因此，有必要提供一种新型的细胞冻存液以解决现有技术存在的上述问题。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种细胞冻存液，实现细胞冻存液的安全无毒、进一步提高细胞存活率。本发明的所述细胞冻存液，包含酰基化ε-多聚赖氨酸、多元醇和平衡缓冲液。本发明所述细胞冻存液，其有益效果在于：所述细胞冻存液包含酰基化ε-多聚赖氨酸和多元醇，替代了有毒性的dmso作为冷冻保护剂，稳定性好，无毒副作用，与已有的琥珀酰-ε-多聚赖氨酸冻存液相比，添加所述多元醇，能够进一步减小冻存复苏过程中对细胞的损伤，提高细胞存活率。进一步地，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为10～200mg/ml，所述多元醇占所述细胞冻存液体积的百分比为1％～20％，余量为所述平衡缓冲液。进一步地，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为80～130mg/ml，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为10％～20％。进一步地，所述酰基化ε-多聚赖氨酸选自丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸、戊二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸或乙二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸中的至少一种。进一步地，所述多元醇选自丙二醇或甘油。进一步地，所述细胞冻存液组分还包含糖类。进一步地，所述糖类包括葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、海藻糖或棉子糖中的至少一种。进一步地，所述糖类含量为2～40mm。进一步地，所述平衡缓冲液包括：可溶性钠盐、可溶性钾盐、可溶性镁盐和可溶性钙盐，所述平衡缓冲液中，所述可溶性钠盐含量为5～120mm、所述可溶性钾盐含量为5～120mm、所述可溶性镁盐含量为5～15mm，所述可溶性钙盐含量为0.1～1mm。其有益效果在于：所述平衡缓冲溶液中盐离子浓度模拟细胞内环境，从而减小对细胞的损伤，提高细胞存活率。进一步地，所述平衡缓冲液还包含：渗透压稳定剂、还原剂、氨基酸和活性代谢中间产物，所述平衡缓冲液中，所述渗透压稳定剂含量为0.01～40mm，所述还原剂含量为0.002～5mm，所述氨基酸含量为15～50mm，所述活性代谢中间产物含量为1～10mm。其有益效果在于：所述平衡缓冲液中添加了多种安全的渗透压稳定剂、还原剂、氨基酸和活性代谢中间产物，这些添加物能够稳定细胞膜结构，更好的保存细胞活性，防止细胞衰老。进一步地，所述渗透压稳定剂选自甘露糖醇、羟乙基淀粉、羟甲基纤维素钠、右旋糖酐-40或山梨醇中的至少一种。进一步地，所述还原剂选自维生素c、维生素e、谷胱甘肽、n-乙酰-l-半胱氨酸或叔丁基对苯二酚中的至少一种。进一步地，所述还原剂为维生素c、n-乙酰-l-半胱氨酸和叔丁基对苯二酚。进一步地，所述维生素c含量为0.5～2mm，所述n-乙酰-l-半胱氨酸含量为1～5mm，所述叔丁基对苯二酚含量为2～5μm。进一步地，所述氨基酸选自组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸中的至少一种。进一步地，所述氨基酸为组氨酸和谷氨酸。进一步地，所述组氨酸含量为20～50mm，所述谷氨酸含量为15～30mm。进一步地，所述活性代谢中间产物选自α-酮戊二酸或腺苷。进一步地，所述平衡缓冲液还包括人血清白蛋白，所述平衡缓冲液中，所述人血清白蛋白含量为2～20mg/ml。进一步地，所述平衡缓冲液的ph为7.0～7.6。进一步地，所述平衡缓冲液为基础培养基，所述基础培养基选自mem培养基、dmem培养基、dmem/f12培养基或rpmi160培养基中的至少一种。其有益效果在于：利用所述培养基作为所述平衡缓冲液，操作方便，同时也有利于提高细胞活性。本发明还提供了使用所述细胞冻存液进行细胞冻存复苏的方法，包含以下步骤：s1:取待冻存细胞悬液，离心收集细胞，用所述细胞冻存液重悬细胞并调整细胞浓度，获得细胞悬液；s2:吸取所述细胞悬液分装于冻存管或冻存袋中，然后将所述冻存管或冻存袋冻存；s3:取出所述冻存管或冻存袋，在30-40℃的条件下对所述冻存管或冻存袋进行解冻处理，得到复苏后的细胞。本发明所述细胞冻存复苏方法的有益效果在于：利用本发明所述细胞冻存液冻存复苏细胞，能够有效减少冻存复苏过程中对细胞的损伤，提高细胞存活率。进一步地，在所述步骤s2中，将所述冻存管或冻存袋置于-82℃～-78℃中冻存。其有益效果在于：将所述冻存管直接置于-82℃～-78℃中冻存，该过程不需要程序降温，简化了操作步骤，提高了细胞冻存效率。进一步地，将所述冻存管或冻存袋置于-82℃～-78℃中冻存至少3小时后移入液氮中冻存。其有益效果在于：将所述冻存管先置于-82℃～-78℃中冻存至少3小时，然后再直接移入液氮中长期冻存，该过程简化了操作步骤，相对于细胞的玻璃化冻存，该冻存方法可以有效减少冻存过程中冰晶的形成，减小了对细胞的损伤，提高了细胞存活率。进一步地，所述细胞悬液浓度为1×106～100×106个/ml。进一步地，在步骤s2中，每个所述冻存管中装入0.2～1ml所述细胞悬液，或者吸取所述细胞悬液分装于冻存袋中，每个所述冻存袋中装入10～50ml所述细胞悬液。其有益效果在于：本发明所述冻存复苏方法一次性可以冻存细胞数量多，有利于细胞大规模冻存，极大地方便了细胞冻存技术在临床上的应用。本发明还提供一种所述细胞冻存复苏方法在冻存干细胞中的应用。本发明还提供一种所述细胞冻存复苏方法在冻存免疫细胞细胞中的应用。具体实施方式除非另作定义，本发明权利要求书和说明书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属
技术领域：
内具有一般技能的人士所理解的通常意义。为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对本发明要求保护的范围不起任何限定作用。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例中的酰基化ε-多聚赖氨酸是两性化合物，偏中性溶液中极易吸水，与水分子形成稳定氢键。在合适浓度下，由于形成高渗溶液，细胞内水渗出，能够有效避免冷冻时水在细胞内形成冰晶损伤细胞。同时，酰基化ε-多聚赖氨酸是非渗透性冷冻保护剂，冷冻细胞时，能抑制细胞外的水形成冰晶，从而保护细胞免受损伤。本发明实施例中的多元醇属于透入性低温保护剂，这类保护剂属低分子量的中性物质，在溶液中能够强烈地结合水分子，发生水合作用，减弱水的固化过程；另外还可稀释细胞外保存液溶质(电解质)的浓度，因此在冷却时，能透入到细胞内的电解质数量大大减少，而由保护剂替代透入，当细胞外冻结时，可减轻细胞皱缩程度及减缓细胞皱缩的速度。这类保护剂容易透入或透出细胞，所以在复温解冻时，也可以减低渗透肿胀，从而减轻了冻融对细胞的伤害。试剂：甘露糖醇为西格玛(sigma)公司生产，产品编号为：m4125；左旋抗坏血酸为西格玛-奥德里奇(sigma-aldrich)公司生产，产品编号为：a4544；谷胱甘肽为sigma公司生产，产品编号为：g6013；n-乙酰-l-半胱氨酸为sigma公司生产，产品编号为：a9165；叔丁基对苯二酚为sigma公司生产，产品编号为：112941；组氨酸为sigma公司生产，产品编号为：h6034；谷氨酸为sigma公司生产，产品编号为：g5667；α-酮戊二酸为sigma公司生产，产品编号为：k1128；腺苷为sigma公司生产，产品编号为：a9251；25％ε-多聚赖氨酸水溶液为日本的捷恩智(jnc)公司生产；丁二酸酐为aldrich公司生产，产品编号为：239690；葡萄糖为sigma-aldrich公司生产，产品编号为：v900392；甘油为sigma公司生产，产品编号为：g9012；dmso为sigma公司生产，产品编号为：34869；人血白蛋白静脉输注溶液为瑞士杰特贝林生物制品有限公司生产；胎牛血清为以色列的生物科技(biologicalindustries，bi)公司生产，产品编号为：04-001-1acs；台盼蓝染色液为碧云天生物公司生产，产品编号为：c0011；cd3/cd28为加拿大的干细胞科技(stemcelltechnologies)公司生产，产品编号为：10971；丙二醇为sigma公司生产，产品编号为：134368；il-2因子为北京同立海源生物公司生产，产品编号为：tl-104；针对现有技术存在的问题，提供一种细胞冻存液，所述细胞冻存液包含酰基化ε-多聚赖氨酸、多元醇和平衡缓冲液。本发明的一些实施例中，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为10～200mg/ml，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为1％～20％，余量为所述平衡缓冲液。所述酰基化ε-多聚赖氨酸选自丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸、戊二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸或乙二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸中的至少一种；所述多元醇选自丙二醇或甘油。一些具体实施例中，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、115mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、160mg/ml、180mg/ml或200mg/ml中的任意一种。一些具体实施例中，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％、12％、15％、18％或20％中的任意一种。本发明的一些实施例中，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为80～130mg/ml，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为10％～20％。本发明的一些实施例中，所述细胞冻存液还包含糖类，所述糖类含量为2～40mm，所述糖类包括葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、海藻糖或棉子糖中的至少一种。一些具体实施例中，所述糖类的含量为1％、2％、3％、4％、6％、8％、10％、12％、15％、18％或20％中的任意一种。本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液包括可溶性钠盐、可溶性钾盐、可溶性镁盐和可溶性钙盐，所述平衡缓冲液中，所述可溶性钠盐含量为10～120mm，所述可溶性钾盐含量为10～120mm，所述可溶性镁盐含量为5～15mm，所述可溶性钙盐含量为0.1～1mm。一些具体实施例中，所述可溶性钠盐的含量为10mm、40mm、60mm、80mm、100mm或120mm中的任意一种。一些具体实施例中，所述可溶性钾盐的含量为20mm、40mm、60mm、80mm、100mm或120mm中的任意一种。一些具体实施例中，所述可溶性镁盐的含量为5mm、6mm、8mm、10mm、12mm或15mm中的任意一种。一些具体实施例中，所述可溶性钙盐的含量为0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.8mm或1mm中的任意一种。本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液还包括渗透压稳定剂、还原剂、氨基酸和活性代谢中间产物，所述平衡缓冲液中，所述渗透压稳定剂含量为0.01～40mm，所述还原剂含量为0.002～5mm，所述氨基酸含量为15～50mm，所述活性代谢中间产物的含量为1～10mm。所述渗透压稳定剂选自甘露糖醇、羟乙基淀粉、羧甲基纤维素钠、右旋糖酐-40或山梨醇中的至少一种；所述还原剂选自维生素c、维生素e、谷胱甘肽、n-乙酰-l-半胱氨酸或叔丁基对苯二酚中的至少一种；所述氨基酸选自组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸中的至少一种；所述活性代谢中间产物选自α-酮戊二酸或腺苷。一些具体实施例中，所述渗透压稳定剂的含量为0.01mm、0.5mm、1mm、5mm、20mm、25mm、30mm、35mm或40mm中的任意一种。一些具体实施例中，所述还原剂的含量为0.002mm、0.005mm、0.01mm、0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm或5.0mm中的任意一种。一些具体实施例中，所述活性代谢中间产物的含量为1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm中的任意一种。本发明的一些实施例中，所述还原剂包含维生素c、n-乙酰-l-半胱氨酸和叔丁基对苯二酚。所述维生素c含量为0.5～2mm，所述n-乙酰-l-半胱氨酸含量为1～5mm，所述叔丁基对苯二酚含量为2～5μm。一些具体实施例中，所述维生素c的含量为0.5mm、1.0mm、1.5mm、或2.0mm中的任意一种。一些具体实施例中，所述n-乙酰-l-半胱氨酸的含量为1mm、1.5mm、2.0mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm或5mm中的任意一种。一些具体实施例中，所述叔丁基对苯二酚的含量为2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm或5.0μm中的任意一种。本发明的一些实施例中，所述氨基酸为组氨酸和谷氨酸。所述组氨酸含量为20～50mm，所述谷氨酸含量为15～30mm。本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液组分还包括人血清白蛋白，所述平衡缓冲液中，所述人血清白蛋白的质量浓度为2～20mg/ml。一些具体实施例中，所述人血清白蛋白的质量浓度为2mg/ml、5mg/ml、5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、18mg/ml或20mg/ml中的任意一种。本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液的ph为7.0～7.6。本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液为基础培养基，所述基础培养基选自mem培养基、dmem培养基、dmem/f12培养基或rpmi160培养基中的至少一种。本发明实施例提供了利用所述细胞冻存液冻存复苏细胞的方法，包含以下步骤：s1:取待冻存细胞悬液，离心收集细胞，用所述细胞冻存液对离心收集到的所述细胞进行重悬并调整所述细胞的浓度，获得细胞悬液；s2:吸取所述细胞悬液分装于冻存管或冻存袋中，然后将所述冻存管或冻存袋冻存；s3:取出所述冻存管或冻存袋，利用水浴的方式解冻，得到复苏后的细胞。在所述步骤s1中，所述细胞悬液的浓度为1×106～100×106个/ml。一些具体的实施例中，所述细胞浓度为1×106个/ml、2×106个/ml、4×106个/ml、6×106个/ml、8×106个/ml、1×107个/ml、2×107个/ml、5×107个/ml或1×108个/ml中的任意一种。在所述步骤s2中，每个所述冻存管中装入0.2～1ml所述细胞悬液或者每个所述冻存袋中装入10～50ml所述细胞悬液。一些具体实施例中，每个所述冻存管中装入细胞悬液的体积为0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.8ml或1.0ml中的任意一种。一些具体实施例中，每个所述冻存袋中装入细胞悬液的体积为10ml、12ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、401ml、45ml或50ml中的任意一种。在所述步骤s2中，将所述冻存管或冻存袋置于-82℃～-78℃中冻存。本发明的一些实施例中，在所述步骤s2中，将所述冻存管置于-82℃～-78℃中冻存至少3小时后移入液氮中冻存。本发明实施例提供了所述细胞冻存复苏方法在冻存干细胞中的应用。本发明实施例提供了所述细胞冻存复苏方法在冻存免疫细胞中的应用。以下结合具体的实施例对本发明加以详细描述。实施例1本实施例子的细胞冻存液以及其制备方法，包含：平衡缓冲液的配制、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制，以及平衡缓冲液与酰基化ε-多聚赖氨酸溶液为主的细胞冻存液配制，容后详述。1、平衡缓冲液的配制，包括如下步骤：向超纯水中依次加入nacl100mmol，kcl10mmol，mgcl213mmol，cacl20.25mmol，将上述所有物质溶解完全后，用10mol/l的naoh水溶液调整以上溶液的ph至7.0～7.6；然后用超纯水定容至1l。2、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制步骤：称量13g丁二酸酐倒入100ml质量浓度为0.25g/ml的ε-多聚赖氨酸水溶液中，放入50℃水中进行水浴，水浴2小时后得到反应液；用10mol/l的naoh水溶液调整所述反应液的ph至7.2～7.4，得到丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸溶液。3、细胞冻存液1的配制步骤：取30ml所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液，与5ml甘油混合均匀；用所述平衡缓冲液定容至100ml；然后将上述溶液用0.22μm过滤膜过滤，得到所述细胞冻存液1。其中，所述细胞冻存液1中含有所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为114mg/ml。利用本实施例所述细胞冻存液1冻存复苏干细胞的方法，本实施中，所述干细胞为间充质干细胞，包括如下步骤：1)间充质干细胞的获取：取待冻存的间充质干细胞，放入培养基中培养，观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞汇合率达到75％～80％后，将细胞消化为单个细胞的悬液，以180g的离心力离心上述悬液10分钟，获得细胞沉淀；2)冻存：取所述细胞沉淀，用所述细胞冻存液1重悬细胞，并调整细胞浓度为2×106个/ml，获得细胞悬液；吸取所述细胞悬液0.5ml装入冻存管中，将所述冻存管放入-80℃冷冻1天后转移至液氮保存；3)复苏：将所述冻存管从液氮中取出，将所述冻存管浸入37℃水中水浴解冻，待融化完全后取出，得到复苏后的间充质干细胞。实施例2本实施例子的细胞冻存液以及其制备方法，包含：平衡缓冲液的配制、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制，以及平衡缓冲液与酰基化ε-多聚赖氨酸溶液为主的细胞冻存液配制，容后详述。1、平衡缓冲液的配制，包括如下步骤：步骤a：向超纯水中依次加入nano315mmol，kno310mmol，mg(no3)210mmol，ca(no3)20.5mmol，将上述所有物质溶解完全；步骤b：再行依次加入所述甘露糖醇15mmol、所述维生素c1mmol、所述谷胱甘肽3mmol、所述n-乙酰-l-半胱氨酸2mmol、所述叔丁基对苯二酚2μmol、所述组氨酸20mmol、所述谷氨酸14mmol、所述α-酮戊二酸1mmol、所述腺苷5mmol，待所有物质溶解完全；步骤c：然后用8mol/l的naoh水溶液调整上述反应液的ph至7.0～7.6；步骤d：用超纯水定容至1l。2、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制步骤：称量13g戊二酸酐倒入100ml质量浓度为0.25g/ml的ε-多聚赖氨酸水溶液中，放入50℃水中进行水浴，水浴2小时后得到反应液；用8mol/l的naoh水溶液调整所述反应液的ph至7.2～7.4，得到戊二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸溶液。3、细胞冻存液2的配制步骤：取28ml所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液，与10ml丙二醇混合均匀；用所述平衡缓冲液定容至100ml；然后将上述溶液用0.22μm过滤膜过滤，得到所述细胞冻存液2。利用本实施例所述细胞冻存液2冻存复苏干细胞的方法，本实施中，所述干细胞为间充质干细胞，包括如下步骤：1)间充质干细胞的获取：取待冻存的间充质干细胞，放入培养基中培养，观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞汇合率达到75％～80％后，将细胞消化为单个细胞的悬液，以180g的离心力离心上述悬液15分钟，获得细胞沉淀；2)冻存：取所述细胞沉淀，用所述细胞冻存液2重悬细胞，并调整细胞浓度为1×106个/ml，获得细胞悬液；吸取所述细胞悬液1.0ml装入冻存管，将所述冻存管放入-78℃冷冻6小时后转移至液氮保存；3)复苏：将所述冻存管从液氮中取出，将所述冻存管浸入36℃水中水浴解冻，待融化完全后取出，得到复苏后的间充质干细胞。实施例3本实施例子的细胞冻存液以及其制备方法，包含：平衡缓冲液的配制、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制，以及平衡缓冲液与酰基化ε-多聚赖氨酸溶液为主的细胞冻存液配制，容后详述。1、平衡缓冲液的配制，包括如下步骤：步骤a1：向超纯水中依次加入所述nacl100mmol、所述kcl10mmol、所述mgcl213mmol、所述cacl20.25mmol，将上述所有物质溶解完全；步骤b1：再行依次加入所述甘露糖醇10mmol、所述维生素c0.5mmol、所述谷胱甘肽2mmol、所述n-乙酰-l-半胱氨酸5mmol、所述叔丁基对苯二酚5μmol、所述组氨酸24.5mmol、所述谷氨酸16.3mmol、所述α-酮戊二酸0.5mmol、所述腺苷3mmol及人血清白蛋白15g，待所有物质溶解完全；步骤c1：然后用12mol/l的naoh水溶液调整上述反应液的ph至7.0～7.6；步骤d1：用超纯水定容至1l。2、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制步骤：称量13g乙二酸酐倒入100ml质量浓度为0.25g/ml的ε-多聚赖氨酸水溶液中，放入50℃水中进行水浴，水浴2小时后得到反应液；用12mol/l的naoh水溶液调整所述反应液的ph至7.2～7.4，得到乙二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸溶液。3、细胞冻存液3的配制步骤：取28ml所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液，与10ml甘油混合均匀；用所述平衡缓冲液定容至100ml；然后将上述溶液用0.22μm过滤膜过滤，得到所述细胞冻存液3。利用本实施例所述细胞冻存液3冻存复苏干细胞的方法，本实施中，所述干细胞为间充质干细胞，包括如下步骤：1)间充质干细胞的获取：取待冻存的间充质干细胞，放入培养基中培养，观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞汇合率达到75％～80％后，将细胞消化为单个细胞的悬液，以350g的离心力离心上述悬液5分钟，获得细胞沉淀；2)冻存：取所述细胞沉淀，用所述细胞冻存液3重悬细胞，并调整细胞浓度为1×107个/ml，获得细胞悬液；吸取所述细胞悬液0.8ml装入冻存管，将所述冻存管放入-82℃冷冻2天后转移至液氮保存；3)复苏：将所述冻存管从液氮中取出，将所述冻存管浸入39℃水中水浴解冻，待融化完全后取出，得到复苏后的间充质干细胞。实施例4本实施例子的细胞冻存液以及其制备方法，包含：平衡缓冲液的配制、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制，以及平衡缓冲液与酰基化ε-多聚赖氨酸溶液为主的细胞冻存液配制，容后详述。1、平衡缓冲液的配制，包括如下步骤：步骤a2：向超纯水中依次加入所述nacl100mmol、所述kcl10mmol、所述mgcl213mmol、所述cacl20.25mmol，将上述所有物质溶解完全；步骤b2：再行依次加入所述甘露糖醇15mmol、维生素c1mmol、所述谷胱甘肽3mmol、所述n-乙酰-l-半胱氨酸5mmol、所述叔丁基对苯二酚5μmol、所述组氨酸24.5mmol、所述谷氨酸16.3mmol、所述α-酮戊二酸1mmol、所述腺苷5mmol及所述人血清白蛋白15g，待所有物质溶解完全；步骤c2：然后用10mol/l的naoh水溶液调整上述反应液的ph至7.0～7.6；步骤d2：用超纯水定容至1l。2、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制步骤：称量13g丁二酸酐倒入100ml质量浓度为0.25g/ml的ε-多聚赖氨酸水溶液中，放入50℃水中进行水浴，水浴2小时后得到反应液；用10mol/l的naoh水溶液调整所述反应液的ph至7.2～7.4，得到丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸溶液。3、细胞冻存液4的配制步骤：取30ml所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液，与5ml甘油混合均匀；然后加入2mmol葡萄糖，待所述葡萄糖溶解完全；再行用所述平衡缓冲液定容至100ml；将上述溶液用0.22μm过滤膜过滤，得到所述细胞冻存液4。其中，所述细胞冻存液中4含有所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为114mg/ml。利用本实施例所述细胞冻存液4冻存复苏干细胞的方法，本实施中，所述干细胞为间充质干细胞，包括如下步骤：1)间充质干细胞的获取：取待冻存的间充质干细胞，放入培养基中培养，观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞汇合率达到75％～80％后，将细胞消化为单个细胞的悬液，以180g的离心力离心上述悬液10分钟，获得细胞沉淀；2)冻存：取所述细胞沉淀，用所述细胞冻存液4重悬细胞，并调整细胞浓度为2×106个/ml，获得细胞悬液；吸取所述细胞悬液0.5ml分装至冻存管，将所述冻存管放入-80℃冷冻1天后转移至液氮保存；3)复苏：将所述冻存管从液氮中取出，将所述冻存管浸入37℃水中水浴解冻，待融化完全后取出，得到复苏后的间充质干细胞。实施例5本实施例子的细胞冻存液以及其制备方法，包含：平衡缓冲液的配制、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制，以及平衡缓冲液与酰基化ε-多聚赖氨酸溶液为主的细胞冻存液配制，容后详述。1、平衡缓冲液的配制，包括如下步骤：步骤a3：向超纯水中依次加入所述nacl100mmol、所述kcl10mmol、所述mgcl213mmol、所述cacl20.25mmol，将上述所有物质溶解完全；步骤b3：再行依次加入所述甘露糖醇15mmol、维生素c1mmol、所述谷胱甘肽3mmol、所述n-乙酰-l-半胱氨酸5mmol、所述叔丁基对苯二酚5μmol、所述组氨酸24.5mmol、所述谷氨酸16.3mmol、所述α-酮戊二酸1mmol、所述腺苷5mmol及所述人血清白蛋白15g，待所有物质溶解完全；步骤c3：然后用10mol/l的naoh水溶液调整上述反应液的ph至7.0～7.6；步骤d3：用超纯水定容至1l。2、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制步骤：称量13g丁二酸酐倒入100ml质量浓度为0.25g/ml的ε-多聚赖氨酸水溶液中，放入50℃水中进行水浴，水浴2小时后得到反应液；用10mol/l的naoh水溶液调整所述反应液的ph为7.2～7.4，得到丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸溶液。3、细胞冻存液5的配制步骤：取30ml所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液，与10ml甘油混合均匀；然后加入2mmol葡萄糖，待所述葡萄糖溶解完全；用所述平衡缓冲液定容至100ml；然后将上述溶液用0.22μm过滤膜过滤，得到所述细胞冻存液5。利用本实施例所述细胞冻存液5冻存复苏干细胞的方法，本实施中，所述干细胞为间充质干细胞，包括如下步骤：1)间充质干细胞的获取：取待冻存的间充质干细胞，放入培养基中培养，观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞汇合率达到75％～80％后，将细胞消化为单个细胞的悬液，以180g的离心力离心上述悬液10分钟，获得细胞沉淀；2)冻存：取所述细胞沉淀，用所述细胞冻存液5重悬细胞，并调整细胞浓度为2×106个/ml，获得细胞悬液；吸取所述细胞悬液0.5ml装入冻存管，将所述冻存管放入-80℃冷冻1天后转移至液氮保存；3)复苏：将所述冻存管从液氮中取出，将所述冻存管浸入37℃水中水浴解冻，待融化完全后取出，得到复苏后的间充质干细胞。实施例6本实施例子的细胞冻存液以及其制备方法，包含：平衡缓冲液的配制、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制，以及平衡缓冲液与酰基化ε-多聚赖氨酸溶液为主的细胞冻存液配制，容后详述。1、平衡缓冲液的配制，包括如下步骤：步骤a4：向超纯水中依次加入所述nacl100mmol、所述kcl10mmol、所述mgcl213mmol、所述cacl20.25mmol，将上述所有物质溶解完全；步骤b4：再行依次加入所述甘露糖醇15mmol、维生素c1mmol、所述谷胱甘肽3mmol、所述n-乙酰-l-半胱氨酸5mmol、所述叔丁基对苯二酚5μmol、所述组氨酸24.5mmol、所述谷氨酸16.3mmol、所述α-酮戊二酸1mmol、所述腺苷5mmol及所述人血清白蛋白15g，待所有物质溶解完全；步骤c4：然后用10mol/l的naoh水溶液调整上述反应液的ph至7.0～7.6；步骤d4：用超纯水定容至1l。2、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制步骤：称量13g丁二酸酐倒入100ml质量浓度为0.25g/ml的ε-多聚赖氨酸水溶液中，放入50℃的水中进行水浴，水浴2小时后得到反应液；然后用10mol/l的naoh水溶液调整所述反应液的ph至7.2～7.4，得到丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸溶液。3、细胞冻存液6的配制步骤：取30ml所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液，与5ml丙二醇混合均匀；然后加入2mmol葡萄糖，待所述葡萄糖溶解完全后，用所述平衡缓冲液定容至100ml；将上述溶液用0.22μm过滤膜过滤，得到所述细胞冻存液6。其中，所述细胞冻存液6中含有所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为114mg/ml。利用本实施例所述细胞冻存液6冻存复苏干细胞的方法，本实施中，所述干细胞为间充质干细胞，包括如下步骤：1)间充质干细胞的获取：取待冻存的间充质干细胞，放入培养基中培养，观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞汇合率达到75％～80％后，将细胞消化为单个细胞的悬液，以180g的离心力离心上述悬液10分钟，获得细胞沉淀；2)冻存：取所述细胞沉淀，用所述细胞冻存液6重悬细胞，并调整细胞浓度为2×106个/ml，获得细胞悬液；吸取所述细胞悬液0.5ml装入冻存管，将所述冻存管放入-80℃冷冻3天后转移至液氮保存；3)复苏：将所述冻存管从液氮中取出，将所述冻存管浸入37℃水中水浴解冻，待融化完全后取出，得到复苏后的间充质干细胞。实施例7细胞冻存液7的配制步骤：参照细胞冻存液4的配制步骤配制。利用本实施例所述细胞冻存液7冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例4所述细胞冻存复苏方法复苏所述细胞，不同之处在于步骤2)中调整所述细胞悬液的浓度为3×106个/ml。实施例8细胞冻存液8的配制步骤：参照细胞冻存液4的配制步骤配制。利用本实施例所述细胞冻存液8冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例4所述细胞冻存复苏方法复苏所述细胞，不同之处在于步骤2)中调整所述细胞悬液的浓度为1×106个/ml。实施例9细胞冻存液9的配制步骤：参照细胞冻存液4的配制步骤配制。利用本实施例所述细胞冻存液9冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例4所述细胞冻存复苏方法复苏所述细胞，不同之处在于步骤2)中调整所述细胞悬液的浓度为4×106个/ml。实施例101、平衡缓冲液的配制，包括如下步骤：步骤a5：向超纯水中依次加入所述nacl100mmol、所述kcl10mmol、所述mgcl213mmol、所述cacl20.25mmol，将上述所有物质溶解完全；步骤b6：再行依次加入所述甘露糖醇15mmol、所述维生素c1mmol、所述谷胱甘肽3mmol、所述n-乙酰-l-半胱氨酸5mmol、所述叔丁基对苯二酚5μmol、所述组氨酸24.5mmol、所述谷氨酸16.3mmol、所述α-酮戊二酸1mmol、所述腺苷5mmol及所述人血清白蛋白15g，待所有物质溶解完全；步骤c6：然后用10mol/l的naoh水溶液调整上述反应液的ph至7.0～7.6；步骤d6：用超纯水定容至1l。2、酰基化ε-多聚赖氨酸溶液的配制步骤：称量13g丁二酸酐倒入100ml质量浓度为0.25g/ml的ε-多聚赖氨酸水溶液中，放入50℃水中进行水浴，水浴2小时后得到反应液；然后用10mol/lnaoh水溶液调整所述反应液的ph至7.2～7.4，得到丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸溶液。3、细胞冻存液10的配制步骤：取30ml所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液，与5ml甘油混合均匀；然后加入2mmol葡萄糖，待所述葡萄糖溶解完全后，用所述平衡缓冲液定容至100ml；将上述溶液用0.22μm过滤膜过滤，得到所述细胞冻存液10。其中，所述细胞冻存液10中含有所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为114mg/ml。利用本实施例所述细胞冻存液10冻存复苏免疫细胞的方法，本实施中，所述免疫细胞为t细胞，包括如下步骤：1)t细胞的获取：从外周血中分离得到单核细胞，用cd3/cd28抗体和il-2因子共培养所述单核细胞19天，得到细胞的悬液，然后以180g的离心力离心上述悬液10分钟，获得细胞沉淀；2)冻存：取所述细胞沉淀，用所述细胞冻存液10重悬细胞，并调整细胞浓度为2×107个/ml，获得细胞悬液；吸取所述细胞悬液0.5ml装入冻存管，将所述冻存管放入-80℃冷冻2天后转移至液氮保存；3)复苏：将所述冻存管从液氮中取出，将所述冻存管浸入37℃水中水浴解冻，待融化完全后取出，得到复苏后的t细胞。用以下实验例说明本发明有益效果：实验例1本发明实施例4～9中所述冻存复苏干细胞的方法，将所述冻存管分别转移至液氮中保存2天、4天、6天、30天和120天后，用实施例4～9所述复苏方法复苏细胞，得到复苏后的间充质干细胞。实验例2本发明实施例10中所述冻存复苏免疫细胞的方法，将所述冻存管转移至液氮中保存10天后，用实施例10中所述复苏方法复苏细胞，得到复苏后的t细胞。对比例1对比液1的配制步骤：参照本发明实施例4中所述细胞冻存液4的配制步骤配制，不同之处在于所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液中与0ml多元醇混合均匀，即对比液1中不含有多元醇。利用本对比例所述对比液1冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例4中的所述细胞冻存复苏方法，不同之处在于步骤2)中用所述对比液1重悬细胞，将所述冻存管转移至液氮中保存6天和120天后复苏，得到复苏后的间充质干细胞。对比例2对比液2的配制步骤：参照本发明实施例7中所述细胞冻存液7的配制步骤配制，不同之处在于所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液中与0ml多元醇混合均匀，即对比液2中不含有多元醇。利用本对比例所述对比液2冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例7中的所述细胞冻存复苏方法，不同之处在于步骤2)中用所述对比液2重悬细胞，所述冻存管转移至液氮中保存4天和120天后复苏，得到复苏后的间充质干细胞。对比例3对比液3的配制步骤：参照本发明实施例8中所述细胞冻存液8的配制步骤配制，不同之处在于所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液中与0ml多元醇混合均匀，即对比液3中不含有多元醇。利用本对比例所述对比液3冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例8中的所述细胞冻存复苏方法，不同之处在于步骤2)中用所述对比液3重悬细胞，所述细胞冻存管在液氮中冻存4天和120天后复苏，得到复苏后的间充质干细胞。对比例4对比液4的配制步骤：参照本发明实施例9中所述细胞冻存液9的配制步骤配制，不同之处在于所述酰基化ε-多聚赖氨酸溶液中与0ml多元醇混合均匀，即对比液4中不含有多元醇。利用本对比例所述对比液4冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例9中的所述细胞冻存复苏方法，不同之处在于步骤2)中用所述对比液4重悬细胞，所述细胞冻存管在液氮中冻存4天和120天后复苏，得到复苏后的间充质干细胞。对比例5对比液5的配制步骤：向10mldmso中加入2g人血清白蛋白，混合均匀，然后加入所述平衡缓冲液定容至100ml。利用本对比例所述对比液5冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例4中的冻存复苏方法，不同之处有两处，其一在于步骤2)中用所述对比液5重悬细胞，其二在于步骤2)中采用程序降温，先将所述冻存管放入程序降温盒，再移入-80℃冰箱，12小时后转移入液氮中，在液氮中保存6天和120天后复苏，得到复苏后的间充质干细胞。对比例6对比液6的配制步骤：向10mldmso中加入2g人血清白蛋白，混合均匀，然后加入所述平衡缓冲液定容至100ml。利用本对比例所述对比液6冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例8中的冻存复苏方法，不同之处有两处，其一在于步骤2)中用所述对比液6重悬细胞，其二在于步骤2)中采用程序降温，先将所述冻存管放入程序降温盒，再移入-80℃冰箱，12小时后转移入液氮中，在液氮中保存4天和120天后复苏，得到复苏后的间充质干细胞。对比例7对比液7的配制步骤：向10mldmso中加入2g人血清白蛋白，混合均匀，然后加入所述平衡缓冲液定容至100ml。利用本对比例所述对比液7冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例7中的冻存复苏方法，不同之处有两处，其一在于步骤2)中用所述对比液7重悬细胞，其二在于步骤2)中采用程序降温，先将所述冻存管放入程序降温盒，再移入-80℃冰箱，12小时后转移入液氮中，在液氮中保存4天和120天后复苏，得到复苏后的间充质干细胞。对比例8对比液8的配制步骤：向10mldmso中加入2g人血清白蛋白，混合均匀，然后加入所述平衡缓冲液定容至100ml。利用本对比例所述对比液8冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例9中的冻存复苏方法，不同之处有两处，其一在于步骤2)中用所述对比液8重悬细胞，其二在于步骤2)中采用程序降温，先将所述冻存管放入程序降温盒，再移入-80℃冰箱，12小时后转移入液氮中，在液氮中保存4天和120天后复苏，得到复苏后的间充质干细胞。对比例9对比液9的配制步骤：向10mldmso中加入2g胎牛血清，混合均匀，然后加入所述平衡缓冲液定容至100ml。利用本对比例所述对比液9冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例7中的冻存复苏方法，不同之处有两处，其一在于步骤2)中用所述对比液9重悬细胞，其二在于步骤2)中采用程序降温，先将所述冻存管放入程序降温盒，再移入-80℃冰箱，12小时后转移入液氮中，在液氮中保存2天和30天后复苏，得到复苏后的间充质干细胞。对比例10对比液10：采用的是美国的生物科技(biolifesolutions)公司生产的、编号为210373的cs10即用型细胞冻存液。利用本对比例所述对比液10冻存复苏间充质干细胞的方法：参照实施例10中的冻存复苏方法，不同之处有两处，其一在于步骤2)中用所述对比液10重悬细胞，其二在于步骤2)中采用程序降温，先将冻存管放入程序降温盒，再移入-80℃冰箱，12小时后转移入液氮中，在液氮中冻存10天后复苏。结果如下：将实验例1、对比例1及对比例5所述复苏后的间充质干细胞用台盼蓝染色，并计数观察活细胞数量，计算细胞活率。结果如表1所示，本发明所述细胞冻存液4与所述对比液1相比，细胞冻存液4对细胞的冻存保护效果明显高于对比液1对细胞的冻存保护效果，表明多元醇甘油的加入能够有效减少细胞冻存复苏过程中细胞的损伤程度。本发明所述细胞冻存液4与所述细胞冻存液5相比，细胞冻存液4冻存复苏后的细胞存活率比细胞冻存液5略高，表明多元醇甘油的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为5％时，对细胞的冻存保护效果较好。利用本发明所述细胞冻存液4冻存细胞的效果与所述对比液5冻存细胞的效果相近，几乎能达到同样的效果。以上结果表明，本发明所述包含多元醇甘油的细胞冻存液具有良好的冻存效果，在冻存过程中能很好的保护细胞，减少细胞损伤，提高细胞存活率。并且本发明所述细胞内冻存复苏方法不需要程序降温，简化了操作步骤，提高了细胞冻存效率。细胞存活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％；所述表中示出的是同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞存活率平均值。表1中所述标准差是指基于同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞存活率平均值的方差分析所获得的数值。表1样品细胞浓度冻存时间/天3次实验细胞存活率平均值标准差对比液12x106个/ml686.43％0.34％细胞冻存液42x106个/ml692.29％0.56％细胞冻存液52x106个/ml691.07％1.77％对比液52x106个/ml689.37％0.42％对比液12x106个/ml12070.61％0.85％细胞冻存液42x106个/ml12080.96％0.41％细胞冻存液52x106个/ml12084.07％0.55％对比液52x106个/ml12090.91％0.97％将实验例1及对比例9所述复苏后的间充质干细胞用台盼蓝染色，并计数观察活细胞数量，计算细胞活率。结果如表2所示，本发明所述细胞冻存液7与所述对比液9相比较，前者的细胞存活率明显高于后者，表明本发明所述细胞冻存液的冻存保护效果明显高于传统的dmso，能够有效的减少细胞在冻存复苏过程中的损伤，提高细胞存活率。细胞存活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％；所述表中示出的是同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞存活率平均值。表2中所述标准差是指基于同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞存活率平均值的方差分析所获得的数值。表2样品细胞浓度冻存时间/天3次实验细胞存活率平均值标准差对比液93x106个/ml286.70％0.89％细胞冻存液73x106个/ml287.60％1.45％对比液93x106个/ml3076.44％2.45％细胞冻存液73x106个/ml3087.65％0.48％将实验例1及对比例1～8所述复苏后的间充质干细胞用台盼蓝染色，并计数观察活细胞数量，计算细胞活率。结果如表3所示，不同冻存液在不同浓度下冻存复苏同一细胞4天和120天后对细胞存活率的影响。由表3可知，含有甘油的细胞冻存液不但能有效的减少细胞冻存复苏过程中对细胞的损伤，提高细胞存活率，而且还能够用于长期保存细胞，并且能保持较高的细胞存活率。同时，在这个浓度范围内，随着冻存细胞浓度变高，细胞存活率也变高，表明本发明所述冻存复苏方法能够一次性冻存大量细胞，有利于细胞大规模冻存，极大地方便了细胞冻存技术在临床上的应用。细胞存活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％；所述表中示出的是同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞存活率平均值。表3中所述标准差是指基于同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞存活率平均值的方差分析所获得的数值。表3样品细胞浓度冻存时间/天3次实验细胞存活率平均值标准差对比液31x106个/ml487.79％2.38％细胞冻存液81x106个/ml488.00％1.12％对比液61x106个/ml497.28％0.82％对比液12x106个/ml482.27％3.65％细胞冻存液42x106个/ml493.28％1.14％对比液52x106个/ml495.76％0.03％对比液23x106个/ml487.64％0.43％细胞冻存液73x106个/ml496.23％0.62％对比液73x106个/ml496.39％0.92％对比液44x106个/ml484.33％1.09％细胞冻存液94x106个/ml493.71％0.58％对比液84x106个/ml494.21％1.31％对比液31x106个/ml12071.62％1.99％细胞冻存液81x106个/ml12079.88％1.07％对比液61x106个/ml12094.34％0.62％对比液12x106个/ml12077.51％0.88％细胞冻存液42x106个/ml12088.68％1.02％对比液52x106个/ml12091.24％0.26％对比液23x106个/ml12071.00％1.28％细胞冻存液73x106个/ml12091.30％1.45％对比液73x106个/ml12094.17％0.24％对比液44x106个/ml12071.59％1.46％细胞冻存液94x106个/ml12095.26％0.70％对比液84x106个/ml12086.33％0.35％将实验例1中所述实施例4复苏得到的间充质干细胞及所述实施例6复苏得到的间充质干细胞，分别移入35mm细胞培养皿中，将所述细胞培养皿置于二氧化碳培养箱中培养；培养19小时后，用胰酶消化所述细胞培养皿中的贴壁细胞，然后用血细胞计数板计数贴壁的细胞数量，并计算细胞得率。结果如表4所示，本发明所述细胞冻存液4与所述细胞冻存液6相比较，结果表明加入同等体积甘油与丙二醇的细胞冻存液相比较，加入甘油的细胞冻存液对细胞的冻存保护效果更优。细胞得率＝(贴壁细胞数量/(1×106))×100％；所述表中示出的是同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞得率平均值。表4中所述标准差是指基于同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞得率平均值的方差分析所获得的数值。表4样品细胞浓度冻存时间/天3次实验细胞得率平均值标准差细胞冻存液42x106个/ml370.00％0.045％细胞冻存液62x106个/ml356.65％0.078％将实验例2及对比例10所述复苏后的t细胞用台盼蓝染色，并计数观察活细胞数量，计算细胞活率。结果如表5所示，结果表明本发明所述细胞冻存液10与所述对比液10相比，利用两种细胞冻存液对t细胞冻存后得到的细胞存活率相当，表明本发明所述细胞冻存液10对t细胞也有较好的冷冻保护效果。细胞存活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％；所述表中示出的是同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞存活率平均值。表5中所述标准差是指基于同一样品在同一细胞浓度以及相同冻存时间条件下进行的3次重复实验获得的细胞存活率平均值的方差分析所获得的数值。表5样品对应细胞浓度冻存时间/天3次实验细胞存活率平均值标准差细胞冻存液102x107个/ml1091.4％0.34％对比液102x107个/ml1089.6％0.23％以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。上面对本发明的各种实施方式的描述以描述的目的提供给本领域技术人员。其不旨在是穷举的、或者不旨在将本发明限制于单个公开的实施方式。如上所述，本发明的各种替代和变化对于上述技术所属领域技术人员而言将是显而易见的。因此，虽然已经具体讨论了一些另选的实施方式，但是其它实施方式将是显而易见的，或者本领域技术人员相对容易得出。本发明旨在包括在此已经讨论过的本发明的所有替代、修改、和变化，以及落在上述申请的精神和范围内的其它实施方式。虽然通过实施方式描绘了本发明，本领域普通技术人员知道，本发明有许多变形和变化而不脱离本发明的精神，希望所附的权利要求包括这些变形和变化而不脱离本发明的精神。当前第1页12