一种植物杂交体系及应用的制作方法

本发明涉及一种植物杂交体系及应用。(二)
背景技术：
：杂交优势的利用给粮食的增产带来了一个飞跃式的发展。目前利用杂交优势的途径包括人工去雄杂交制种、化学去雄杂交制种、利用自交不亲合性杂交制种、利用雄性不育系。雄性不育系在现代杂交制种应用中极为普遍，一般采用三系两田法，即不育系、恢复系、保持系、亲本繁殖田、杂交制种田。而且制种手续简化，制种产量较高，从而降低了种子生产成本。目前应用的三系制种中的不育系主要是核质互作雄性不育，这种类型的不育性比较容易获得三系。现已在玉米、高梁、小麦、水稻等大田作物的杂交制种中广泛应用。然而，要获得具有应用价值的不育系、保持系及恢复系是一项极其繁琐、艰巨的工作。通过基因工程手段获得雄性不育系、恢复系不仅较传统的多代选育省时、省力，而且易于保持亲本的优良性状，有着巨大的应用前景。1990年，mariani(mariani,debeuckeleeretal.1990)等利用ta29-barnase嵌合基因的转化，首次在世界上获得了转基因的不育烟草和油菜；1992年，他们又通过ta29-barstar基因的转化获得了上述不育烟草和油菜的恢复系(marianic,gosselev,debeuckeleerm,etal.1992.)。此后，reynaerts(reynaertsa,vandewieleh,desutterg,etal.scientiahorticulturae,1993,55(1):125-139.)等又相继获得了转基因的不育椰菜、莴苣等。美国先锋公司发明了一种雄性不育系统(tss)。这种不育技术基于花药特异性启动子介导dna腺嘌呤甲基化酶基因(dam)在植物中表达，扰乱正常花粉的发育，导致雄性不育。dam基因的表达框与筛选标记pat(膦酸丝氨酸乙酰转移酶)基因表达框紧密连锁。pat基因赋予植物耐受草铵膦的特性。当想同背景的tss转基因不育系与非转基因植株杂交时，收获的种子中50％是转基因的雄性不育系，50％是非转基因的可育系。在生产杂交种时，可以通过喷施草铵膦，杀灭50％的非转基因可育系，这样留下来的都是转基因不育系，可以与父本杂交获得杂交种。上述杂交种中同样50％是非转基因，50％是转基因。但是在大田种植时50％的非转基因植株产生的花粉足够为所有的植株提供花粉。上述基于barnase基因的方法和tss方法都需要较大的增加成本，而且生产上应用也非常复杂，比如基于barnase基因的方法需要分别对不同的父母本进行回交转育，而且最终产品中含有barnase和barstar两种外源蛋白，需要进行大量安全评价工作；而tss方法生产获得的最终产品中一半是转基因种子，一半是非转基因种子。因此，无论是tss还是基于barnase的方法都没有再商品化杂交玉米种子生产中大量应用。大概十年前，美国先锋公司研发了一种种子生产技术(seedproductiontechnology/spt)。这个技术基于玉米自身的核雄性不育基因ms45和颜色标记技术，即在ms45突变不育系中导入一个3个表达框紧密连锁的dna片段，3个表达框分别是胚乳中特异性表达红色蛋白的表达框、恢复育性的正常ms45基因表达框和杀灭含有上述两个表达框的花粉的表达框。上述含有spt片段的玉米植株产生非转基因花粉，获得的种子中50％是红色，可育的，50％是正常颜色，雄性不育的。因此，不育系种子可以用来繁殖不育系种子或者用来生产杂交种，而红色的spt种子可以用来繁殖spt种子或者用来为不育系提供花粉，生产不育系种子。上述方法的优点是可以利用spt方法来生产非转基因玉米，缺点是通过机器筛选红色的种子会有一定的概率漏筛，这样不育系种子中就可能混入spt种子，导致生产出不纯的杂交种，给大规模生产带来重大潜在风险。正是由于这个风险，导致了spt方法没有大规模的应用。选择性杀灭技术是最近几年开发的套转基因作物安全控制方法。在水稻中表达耐受草甘膦的epsps基因，并对水稻本身耐受苯达松的基因cyp81a6进行rnai，这样转基因作物可以被苯达松杀灭，同时可以通过喷施草甘膦去除不耐受草甘膦的植株(lin,c.,etal."abuilt-instrategyforcontainmentoftransgenicplants:creationofselectivelyterminabletransgenicrice."plosone3.3(2008):e1818.)。在玉米中表达耐受草甘膦的epsps基因，并对其耐受烟嘧磺隆的基因cyp81a9进行rnai，这样的转基因作物可以被烟嘧磺隆杀灭，同时可以利用草甘膦除杂(li,jing,etal.，2013，plosone8(12):e81645.)。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种植物杂交体系及其应用，该体系结合了种子的颜色或者形状标记技术和除草剂选择性杀灭技术，解决了一个杂交育种体系中最大的问题，即制种体系的稳定性问题。单独使用颜色或者形状标记，在机器选择过程中会有一个出错率，导致不育系中混入可育的种子，从而导致制种不纯。而结合本发明的选择性杀灭技术，可以通过喷施常规除草剂杀灭可能混入的可育植株，从而消除污染。单独使用选择性杀灭技术，而不使用颜色或者形状标记，在造成种子的浪费的同时也存在污染的风险。因此，本发明提供了一种颜色或形状标记和除草剂选择性杀灭相结合的双重控制技术，可以最大限度的确保杂交制种体系的高纯度和稳定性(制种纯度从95％提高到98％)。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种植物杂交体系，所述植物杂交体系由不育系、保持系和恢复系组成；所述不育系为细胞核基因突变获得，该细胞核基因是植物形成可育花粉所必须的；所述保持系含有twsd载体，所述twsd载体至少同时含有5个紧密连锁的表达框：(1)除草剂抗性基因表达框，由“组成型启动子-抗除草剂基因-终止子”构成；(2)植物内源抗除草剂基因的沉默或敲除表达框，由“组成型启动子-发夹rna-终止子”构成；(3)不育系育性恢复表达框，由“启动子-恢复不育系育性的基因-终止子”构成；(4)使得保持系种子与不育系种子相比具有肉眼可见的颜色或者形状上的显著差异的表达框，由“特异性启动子-导致颜色或者形状差异的基因-终止子”构成；(5)导致含有上述表达框的花粉不育的表达框，由“花粉特异性启动子-花粉不育基因-终止子”构成，同时上述保持系可以用来繁殖不育系和保持系；所述恢复系为任意一种跟不育系配合力良好的自交系。进一步的，所述保持系具有一种或多种非转基因植物自身不耐受的除草剂(以下简称“除草剂a”)抗性同时能被非转基因植物自身耐受的除草剂(以下简称“除草剂b”)杀灭，保持系种子与不育系种子相比具有肉眼可见的颜色或者性状上的显著差异；所述恢复系为任意一种跟不育系配合力良好的自交系。本发明所述不育系发生突变后导致不育的基因是生殖组织特异性表达基因，最可能是花药或者花粉特异性表达基因。本发明中提供了发生突变后导致不育的基因包括玉米的ms45(ungere,ciganam,trimnellm,etal.,2002,transgenicresearch,11(5):455-465)、玉米zm13(hamiltonda,roym,ruedaj,etal.,1992,plantmolecularbiology,18(2):211-218)、水稻的ps1(zoujt,zhanxy,wuhm,etal.,1994,americanjournalofbotany,552-561)以及具有类似功能的基因。本发明所述除草剂抗性基因表达框赋予保持系一种或多种除草剂a抗性，通过导入一个耐除草剂基因来实现，由“组成型启动子-抗除草剂基因-终止子”构成，组成型启动子可以是花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子p35s(odell,joant.,ferencnagy,andnam-haichua,1985,nature,810-812)、水稻的actin1启动子pact1(mcelroyd,zhangw,caoj,etal.,1990,theplantcell,2(2):163-171.)、玉米ubiquitin启动子pubi(christensenah,sharrockra,quailph,1992,plantmolecularbiology,18(4):675-689)及其具有类似表达模式的启动子；抗除草剂基因可以是抗草甘膦基因cp4-epsps(孟山都公司)、g1174(中国专利：2011100093290)，抗草丁膦基因bar(thompsoncj,movvanr,tizardr,etal,1987，theembojournal,6(9):2519.)及其具有类似功能的基因。优选除草剂抗性基因表达框为草铵膦耐受基因bar表达框dna片段pubi-bar-ter，序列如seqidno.2所示。本发明所述植物内源抗除草剂基因的沉默或敲除表达框为rna干扰表达框，赋予保持系被除草剂b杀灭的功能，通过沉默或敲除植物内源耐除草剂基因来实现，由“组成型启动子-发夹rna-终止子”构成，优选cyp81a9基因rnai片段(核苷酸序列如seqidno.1所示)或cyp81a6基因rnai片段(核苷酸序列如seqidno.7所示)。本发明所述不育系育性恢复表达框由“启动子-恢复不育系育性的基因-终止子”构成，通过导入一个可育基因来实现，突变后导致不育的基因包括玉米的ms45、zm13、水稻的ps1以及具有类似功能的基因(reemakhurana,sanjaykapoor,andakhileshk.tyagi.2012，criticalreviewsinplantsciences31(5):359-390.)。启动子可以为恢复不育系育性的基因自身的启动子，也可以是其它雄性组织特异性表达启动子，优选玉米的p5126，不育系育性恢复表达框优选p5126-ms45-ter，序列如seqidno.3所示。本发明所述使花粉不育的表达框由“花粉特异性启动子-花粉不育基因-终止子”构成，通过导入一个使花粉失活的基因来实现。花粉特异性启动子包括玉米的5126启动子(美国专利：us8257930b2)、zm13启动子(hamiltonda,roym,ruedaj,etal.,1992,plantmolecularbiology,18(2):211-218)，水稻的ps1启动子(zoujt,zhanxy,wuhm,etal.,1994,americanjournalofbotany,552-561)，烟草的ta29启动子(koltunowam,truettnerj,coxkh,etal.,1990,theplantcell,1990,2(12):1201-1224)、ntp303启动子(weteringsk,schrauwenj,wullemsg,etal.,1995,theplantjournal,8(1):55-63)等(reemakhurana,sanjaykapoor,andakhileshk.tyagi."anthologyofanther/pollen-specificpromotersandtranscriptionfactors."criticalreviewsinplantsciences31.5(2012):359-390.)。花粉不育基因包括任何阻止或破坏花粉发育从而致使花粉发育受阻、发育不良或发生歧化，进而使花粉不具有育性的基因。这些基因包括淀粉酶基因、蛋白酶基因、rna酶基因等。优选使含有twsd片段的花粉失活的玉米淀粉酶特异性表达框ppg47-aai-ter，序列如seqidno.4所示。本发明所述使得保持系种子与不育系种子相比具有肉眼可见的颜色或者性状上的显著差异的表达框，通过导入外源基因或者调控植物内源基因的表达来实现，包括使种子变成红色的红色荧光蛋白基因表达框e35s-ltp2-dsred-ter，序列如seqidno.5所示；以及利用干扰玉米中细胞壁结合转化酶2(incw2)导致玉米种子变小的(taliercio,e.w,etal.1999，journalofplantphysiology155(2):197-204.)表达框incw2-rnai，序列如seqidno.6所示。本发明所述恢复系优选为玉米昌72或水稻9311。本发明还提供一种植物杂交体系的应用方法，即通过本发明提供的不育系、保持系和恢复系，三系配套来配制杂交种，杂交种为可育的不含有twsd片段的非转基因种子，具体如下：(1)保持系的扩繁：播种含twsd片段的保持系，进行自花授粉，由于twsd片段中含有导致花粉不育的表达框，因此保持系产生的50％含有twsd片段的花粉是不育的，另外50％为不含twsd片段的可育花粉，通过转基因种子特殊的颜色或者形状来区分twsd转基因种子和非转基因种子；其中，twsd转基因种子可以用于继续扩繁保持系，也可以用于扩繁不育系种子；非转基因种子为不育系，可以用于不育系的扩繁或者杂交种的制备；非转基因种子中可能混入的twsd转基因种子，可以通过田间正常使用除草剂b时除掉，收获含twsd片段的保持系。(2)不育系的扩繁：将不育系和含twsd片段的保持系以适合比例(优选5:2的种子量或行数)间隔种植，保持系产生两种花粉，一半含有令花粉失活表达框的twsd片段，不育；另一半不含twsd片段的花粉，可育；通过对不育系喷施除草剂b除草的同时去除可能混入的twsd种子，然后让保持系给不育系植株授粉后，不育系植株上产生的种子都是非转基因不育系，获得不含twsd片段的不育系种子；(3)制备杂交种：步骤(2)不含twsd片段的不育系和恢复系间隔种植，不育系中可能存在的极为个别的含有twsd片段的保持系植株可以在v3-v5期喷施选择性除草剂杀灭杂草的同时被杀灭；恢复系给不含twsd片段的不育系授粉，收获的种子即为不含twsd片段的可育的杂交种。本发明中的植物杂交体系可以用于单子叶植物，包括玉米、水稻、小麦、大麦和高粱等和双子叶植物，包括大豆、油菜、棉花和烟草等。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：种子的纯度直接影响作物的最终产量，所以提高杂交种子的纯度非常关键。与目前已有的杂交体系相比，本发明杂交体系最大的改进是，通过结合颜色或者形状标记技术、除草剂选择性杀灭技术和转基因花粉致死技术，极大的确保整个杂交体系的可靠性和稳定性，多重技术确保杂交种子的纯度，平均纯度从95％提高到98％。(四)附图说明图1：twsd载体的t-dna结构示意图。cyp81基因rnai表示玉米cyp81a9或者cyp81a6基因rnai框；除草剂耐受基因表示草甘膦耐受基因cp4、草铵膦耐受基因bar或者啶嘧磺隆耐受基因3x-1等基因表达框；育性恢复基因是指ms45和rts等可以恢复由于植物自身基因突变导致的雄性不育的育性的基因表达框；花粉致死基因表示在花粉中特异性表达淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和rna酶等基因从而导致花粉败育的表达框；颜色基因是指在种子胚乳中特异性表达红色荧光蛋白或者其他便于识别的颜色的表达框。rb为右边界，lb为左边界。图2：twsds载体的t-dna结构示意图。cyp81基因rnai表示玉米cyp81a9或者cyp81a6基因rnai框；除草剂耐受基因表示草甘膦耐受基因cp4、草铵膦耐受基因bar或者啶嘧磺隆耐受基因3x-1等基因表达框；育性恢复基因是指ms45和rts等可以恢复由于植物自身基因突变导致的雄性不育的育性的基因表达框；花粉致死基因表示在花粉中特异性表达淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和rna酶等基因从而导致花粉败育的表达框；incw2基因rnai表示incw2基因rnai表达框。rb为右边界，lb为左边界。图3：保持系转育的路线图。ms:ms表示纯合不育系。图4：保持系扩繁的示意图。图5：自交系扩繁的示意图。图6：杂交种制备的示意图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换均属于本发明的范围。实施例1、twsd载体构建为了构建玉米twsd载体，分别合成以下dna片段：1、cyp81a9基因rnai片段(即植物内源抗除草剂基因的沉默或敲除表达框)，核苷酸序列如seqidno.1所示，序列两边分布设置xhoi限制性内切酶位点；2、草铵膦耐受基因bar表达框(即除草剂抗性基因表达框)dna片段pubi-bar-ter，核苷酸序列如seqidno.2所示，序列两端分别设置kpni位点；3、育性相关基因ms45的表达框(即不育系育性恢复表达框)p5126-ms45-ter，序列如seqidno.3所示，序列两端分别设置hpai位点；4、使含有twsd片段的花粉失活的玉米淀粉酶特异性表达框(即导致含有上述表达框的花粉不育的表达框)ppg47-aai-ter，序列如seqidno.4所示，序列5’端和3’端分别设置ecori和hindiii位点；5、使玉米种子变成红色的红色荧光蛋白基因表达框(即使得保持系种子与不育系种子相比具有肉眼可见的颜色上的显著差异的表达框)e35s-ltp2-dsred-ter，序列如seqidno.5所示，序列两端分别设置hindiii位点；6、使玉米种子变小的incw2基因rnai表达框(即使得保持系种子与不育系种子相比具有肉眼可见的形状上的显著差异的表达框)incw2-rnai，序列如seqidno.6所示，序列两端分别设置hindiii位点。同时，为了构建水稻的twsd载体，合成cyp81a6基因rnai片段，序列如seqidno.7所示，序列两边分布设置xhoi限制性内切酶位点。为了获得使保持系种子变成红色的twsd载体，以双元载体pcambia1300为基础，如上所述，把其中的抗潮霉素基因hptii置换为cyp81a9基因rnai片段。获得pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai的载体。然后利用酶切位点kpni把人工合成的pubi-bar-ter克隆到pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai中，获得载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar。再利用酶切位点hpai把p5126-ms45-ter片段连入载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar中，获得载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar-p5126-ms45。然后，利用ecori和hindii，把ppg47-aai-ter片段连入载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar-p5126-ms45中，获得载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar-p5126-ms45-ppg47-zm-aai载体。最后，通过hindii，把人工合成的e35s-ltp2-dsred-ter连入载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar-p5126-ms45-ppg47-zm-aai中，获得载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar-p5126-ms45-ppg47-zm-aai-e35s-ltp2-dsred，这个载体命名为：zmtwsd，该载体中的t-dna序列的结构如图1所示。为了获得使保持系种子变小的twsd载体，将载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar-p5126-ms45-ppg47-zm-aai-e35s-ltp2-dsred中的e35s-ltp2-dsred-ter片段替换成人工合成的incw2-rnai片段即可。最终获得载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar-p5126-ms45-ppg47-zm-aai-pincw2-incw2rnai-ter，这个载体命名为zmtwsds。该载体中的t-dna序列的结构如图2所示。使保持系种子变成红色的水稻twsd载体构建方法与其在玉米上的方法类似，唯一的区别是把第一步中xhoi酶切位点中间的cyp81a9rnai片段替换为cyp81a6rnai片段。最终获得的载体为pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar-prts-rts-ppg47-zm-aai-e35s-ltp2-dsred-ter，这个载体命名为：ostwsd，该载体中的t-dna序列的结构如图1所示。最后，通过电转的方法把上述t-dna质粒转入农杆菌lb4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/ml的卡那霉素的yep固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。实施例2、玉米转化玉米的转化方法已经比较成熟，例如frame等描述了利用农杆菌转化玉米的方法(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22)。分别取含载体zmtwsd和zmtwsds的农杆菌(即含t-dna载体的农杆菌)划板，挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。取授粉后8-10天的ms45基因功能缺失突变体hi-ii玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将含有t-dna载体的农杆菌与未成熟胚共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(培养基中含有200mg/l的timentin，用于杀灭农杆菌，参照(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22))，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有终浓度2mm草铵膦的筛选培养基上(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22)，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含终浓度2mm草铵膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22)，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22)，26℃光照培养直到根发育完全，然后移植到温室中单株培养，检测转基因玉米的抗除草剂能力。用稀释200倍的拜耳的18％的草铵膦水剂喷洒，7天后叶片发黄，枯死的为阴性；和喷清水对照长势一样的为阳性植株，分别获得含载体zmtwsd和zmtwsds转基因玉米品系，记为zmtwsd和zmtwsds，作为保持系。实施例3、玉米twsd品系的筛选1、通过回交转育获得核基因突变的不育系(参考中国专利申请，申请号：201610748791.5)。我们获得了商业化品种“郑丹958”的母本“郑58”(z58)和商业化品种先玉335母本(ph6wc)的ms45基因突变不育系。2、将实施例2获得的含转化载体zmtwsd的转基因玉米品系(zmtwsd)自交，将获得的218个zmtwsd转基因t0代植株移栽到温室中，用这些花粉分别对步骤1的z58不育系进行授粉，收获t0代种子，约50％为含有zmtwsd片段的z58不育系转基因种子，另外约50％为不含有zmtwsd片段的z58不育系非转基因种子。然后以含zmtwsd片段的z58不育系为母本进行5-6代连续回交，挑选出zmtwsd转基因品系的z58不育系背景的近等位基因系，从中筛选出85个大约50％的花粉可育，50％的花粉不育的胚乳为红色的单拷贝、插入位点稳定，清晰、目的蛋白表达量合适的品系。再对这些近等位基因系的草铵膦抗性和烟嘧磺隆抗性进行比较分析，我们从上述85个zmtwsd植株中筛选到35个草铵膦抗性良好且对烟嘧磺隆敏感的植株。最后，根据对株高、生长势、产量、生育期、生长周期，结实率等性状的统计分析结果，筛选出5个z58不育系背景的保持系，用于产业化研究。3、将实施例2方法获得含转化载体zmtwsds的转基因玉米品系(zmtwsds)自交，将获得的193个zmtwsds转基因t0代植株移栽到温室中，用这些花粉分别对步骤1的z58不育系进行授粉，收获t0代种子，约50％为含有zmtwsds片段的z58不育系转基因种子，另外约50％为不含有zmtwsds片段的z58不育系非转基因种子。然后以含zmtwsds的z58不育系为母本进行5-6代连续回交，挑选出zmtwsds转基因品系的z58不育系背景的近等位基因系。从上述品系中筛选出69个大约50％的花粉可育，50％的花粉不育的单拷贝、插入位点稳定，清晰、目的蛋白表达量合适的品系。再对这些近等位基因系的草铵膦抗性和烟嘧磺隆抗性进行比较分析，我们从上述69个zmtwsds植株中筛选到30个草铵膦抗性良好且对烟嘧磺隆敏感的植株。最后，根据对株高、生长势、产量、生育期、生长周期，结实率等性状的统计分析结果，筛选出5个z58不育系背景的保持系，用于产业化研究。实施例4、玉米保持系的转育为了把twsd片段转育到其它不育系中，需要把保持系与ph6wc不育系进行回交转育。以ph6wc不育系为母本，实施例3筛选的z58不育系背景的保持系为父本进行4-6代后回交，通过高密度分子标记确认转育已经完成后进行两次自交，最终获得稳定的ph6wc不育系背景的twsd保持系(图3)。实施例5、玉米保持系的扩繁播种实施例3中制备的z58背景的保持系种子，每孔播种3-4粒种子，然后对v3期的保持系植株喷施1:200稀释的保试达(拜耳公司)，杀灭可能混入的不含twsd片段的非转基因植株，让保持系植株自交，收获保持系种子。收获的这些保持系种子中有50％的转基因种子和50％的非转基因种子。如果是twsd载体品系，含有twsd片段的种子为红色，不含twsd片段的种子为正常玉米颜色，其中红色的转基因种子可以用于保持系扩繁或者不育系扩繁，正常颜色的非转基因种子为不育系种子，可以用于不育系的扩繁或者杂交种制备(图4)。如果是twsds载体品系，含有twsd片段的种子胚乳变小导致种子变小，不含twsd片段的种子的大小正常，其中小种子的转基因种子可以用于保持系扩繁或者不育系扩繁，正常大小的非转基因种子为不育系种子，可以用于不育系的扩繁或者杂交种制备(图4)。实施例6、玉米不育系的扩繁把实施例3方法获得的z58背景的保持系种子和z58不育系种子以2:5的比例混匀后播种或者以2:5的行数比播种，收获的种子中不育系植株上的全部为不育系种子，而z58背景的保持系种子中有一半是不育系种子，另一半是twsd种子。如果保持系和不育植株上的种子混收的话，最终6/7为不育系种子，1/7为twsd种子(图5)。如果是twsd载体品系，含有twsd片段的种子为红色，不含twsd片段的种子为正常玉米颜色，1/7的twsd种子可以通过颜色辨别和筛选出来。如果是twsds载体品系，含有twsd片段的种子胚乳变小导致种子变小，不含twsd片段的种子的大小正常，1/7的twsd种子可以通过大小辨别和筛选出来。如果保持系和不育植株上的种子分开收获的话，收获的种子中不育系植株上的全部为不育系种子，而twsd保持系种子中有一半是不育系种子，另一半是twsd种子。实施例7、玉米杂交体系的应用把实施例6制备的z58背景的不育系种子为母本和z58的父本-昌72或者其他配合力高的父本以5:2的行数比播种。然后，对v3-v5期的不育系植株喷施40g/ha的烟嘧磺隆除草，同时还可以起到除杂的作用，杀灭不育系中可能混入的别含有twsd片段的转基因植株。父母本杂交后，母本上的种子即为杂交种，这些杂交种子为可育的不含有twsd片段的非转基因种子，可以用于后期销售和大田生产(图6)。实施例8、水稻转化：通过回交转育获得核基因突变的不育系(参考中国专利，申请号：201610748791.5)。我们获得了商业化品种“秀水134”和“9311”的rts基因突变不育系。转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的rts基因功能缺失突变体“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取ostwsd农杆菌划板。挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入od为0.6左右的农杆菌菌液中(农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种至培养基，培养至od为0.6左右；培养基组成：3g/lk2hpo4、1g/lnah2po4、1g/lnh4cl、0.3g/lmgso4·7h2o、0.15g/lkcl、0.01g/lcacl2、0.0025g/lfeso4·7h2o、5g/l蔗糖、20mg/l乙酰丁香酮，溶剂为水，ph＝5.8)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(ms+2mg/l2,4-d+30g/l葡萄糖+30g/l蔗糖+3g/l琼脂(sigma7921)+20mg/l乙酰丁香酮)中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(ms+2mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+3g/l琼脂(sigma7921)+20mg/l乙酰丁香酮+2mm草铵膦(sigma))上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(ms+0.1g/l肌醇+5mg/laba+1mg/lnaa+5mg/l6-ba+20g/l山梨醇+30g/l蔗糖+2.5g/lgelrite)上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2ms+0.2mg/lnaa+20g/l蔗糖+2.5g/lgelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。分别获得含上述转化载体和只含有筛选标记基因epsps的空载体的转基因水稻植株。实施例9、ostwsd品系的筛选将实施例8获得的含转化载体ostwsd的转基因水稻植株(命名为ostwsd)种植，将获得的356个ostwsd转基因t0代植株移栽到转基因试验田中，收获t0代种子。然后，播种t0代种子，从中筛选出129个大约50％的花粉可育，50％的花粉不育的单拷贝、插入位点稳定，清晰、目的蛋白表达量合适的品系。对上述品系的草铵膦抗性和苯达松抗性进行比较分析，我们从筛选到62个草铵膦抗性良好且对苯达松敏感的植株。最后，根据对株高、生长势、分蘖、产量、生育期、生长周期，结实率等性状的统计分析结果，筛选出5个“秀水-134”背景的保持系，用于产业化研究。实施例10、水稻保持系的转育为了把twsd片段转育到其它不育系中，需要把实施例9获得的“秀水-134”背景的保持系与水稻品系9311不育系进行杂交和回交。以9311不育系为母本，回交4-6代后，通过高密度分子标记确认转育已经完成后进行两次自交，最终获得稳定的9311不育系背景的twsd保持系(图3)。实施例11、水稻保持系的扩繁播种实施例9“秀水-134”背景的保持系种子，然后对播种后约20天，即两叶一心期的保持系植株喷施1:200稀释的保试达(拜耳公司)，杀灭可能混入的不含twsd片段的非转基因植株，再让保持系植株自交，收获保持系种子。收获的保持系种子中有50％的转基因种子和50％的非转基因种子。含有twsd片段的转基因种子为红色，不含twsd片段的种子为正常水稻颜色，其中红色的转基因种子可以用于保持系扩繁或者不育系扩繁，正常颜色的非转基因种子为不育系种子，可以用于不育系的扩繁或者杂交种制备(图4)。实施例12、水稻不育系的扩繁把“秀水-134”背景的保持系种子和“秀水-134”不育系种子以2:5的行数比间隔种植。让保持系植株产生花粉给不育系植株授粉。收获不育系植株的种子，这些种子都是不育系种子，可用于杂交种的制备和不育系的扩繁(图5)。实施例13、水稻杂交体系及其应用播种实施例12“秀水-134”背景的不育系种子和“9311”种子。然后对播种后约20天，即两叶一心期的秧苗喷施田间正常使用浓度的选择性除草剂苯达松用于除草，同时还可以起到除杂的作用，杀灭可能混入的含有twsd片段的转基因植株。把“秀水-134”背景的不育系种子和“9311”以5:2的比例间隔种植。让“9311”植株产生花粉给不育系植株授粉，收获不育系植株的种子，即为杂交种(图6)。实施例14、twsd杂交体系比没有选择性杀灭技术的杂交体系的制种纯度更高作为对照，如实施例1中所述的方法，我们构建了没有选择性杀灭技术的载体pcambia1300-pubi-bar-p5126-ms45-ppg47-zm-aai-e35s-ltp2-dsred，并获得了相应的保持系植株。我们对没有选择性杀灭技术的杂交体系与本发明中的twsd杂交体系的制种纯度进行了比较。杂交体系制种纯度twsd技术98.57±3.36ck195.27±2.77ck1为只有颜色识别而没有选择性杀灭技术的杂交体系。纯度为3年测试结果的平均值±标准差。每年测试面积为667m2，玉米田间种植密度为5000株/亩。实施例15、twsd杂交体系比没有颜色或者形状标记的杂交体系的制种纯度更高作为对照，如实施例1中所述的方法，我们构建了没有选择性杀灭技术的载体pcambia1300-p35s-cyp81a9rnai-pubi-bar-p5126-ms45-ppg47-zm-aai-e35s，并获得了相应的保持系植株。我们对没有选择性杀灭技术的杂交体系与本发明中的twsd杂交体系的制种纯度进行了比较。杂交体系制种纯度twsd技术98.57±3.36ck296.61±2.91ck2为只有选择性杀灭技术而没有颜色或者形状标识技术的杂交体系。纯度为3年测试结果的平均值±标准差。每年测试面积为667m2，玉米田间种植密度为5000株/亩。序列表<110>浙江大学<120>一种植物杂交体系及应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>672<212>dna<213>未知(unknown)<400>1ctcgagaaccaccaactcgcgatccatcgatttgcagaacaccacccaacagccagacca60tcactcgatcggtagacatggataaggcctacatcgccgccctctccgccgccgccctct120tcttgctccactacctcctgggccgccgggccggcggcgagggcaaggccaaggccaagg180gctcgcggcggcggctcccgccgagccctccggcgatcccgttcctgggccacctccacc240tcgtcaaggccccgttccacggggcgctggcccgcctcgcggcgcgccacggcccggtgt300tctccatgcgcctggggacccggcgcgccgtggtcgtgtcgtcgccggactgcgccaggg360agtgcttggagaacaccgggccgtggcgcgccgcgaggcgggccagcgccccgtggaacg420gggccttgacgaggtggaggtggcccaggaacgggatcgccggagggctcggcgggagcc480gccgccgcgagcccttggccttggccttgccctcgccgccggcccggcggcccaggaggt540agtggagcaagaagagggcggcggcggagagggcggcgatgtaggccttatccatgtcta600ccgatcgagtgatggtctggctgttgggtggtgttctgcaaatcgatggatcgcgagttg660gtggttctcgag672<210>2<211>2952<212>dna<213>未知(unknown)<400>2ggtaccgttaaccgcccgggcgtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataat60gag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