一种快速分离葡萄串状青鳉受精卵为单个受精卵并清理受精卵卵膜表面的方法与流程

本发明涉及一种鱼类人工精卵护理、处理的方法。

背景技术：

日本青鳉(oryziaslatipes)是一种淡水青鳉科鱼类，广泛分布于日本、朝鲜、中国东部、东南和东南亚等国家和地区。因青鳉个体小，性别容易区分、世代周期短、产卵率高、饲养繁育简单，基因组信息清楚，这使得其成为一种优秀的用于鱼类解剖学、胚胎学、生理学、基因功能验证的模式生物。此外，青鳉鱼是国际标准组织(iso)推荐为毒性试验的标准用鱼之一，被广泛的用于环境毒理学领域。

在实验室中由青鳉的受精卵培育出幼体和成体及达到性成熟，是实施一系列生物实验的基础和关键。现有文献对青鳉受精卵的早期护理、清理、分离和收集过程叙述比较简单。青鳉卵膜上具有长、短两类丝状物，其中短丝数目多，均匀地分布在整个卵膜上，长丝15～24余根，集中在一个地方，形成一束。青鳉雌鱼产卵(20～42粒/尾)时长丝不会完全产出，一头联在卵巢膜上，另一头仍附着在卵膜上；产卵后卵粒成簇如葡萄串挂在雌性的生殖孔后面。在实际操作中，用柔软的小抄网将雌鱼捞入鱼网(规格：60*100mm)中，使用毛笔的毛端将鱼卵从身体上剥离出来，用自来水轻轻冲洗，用手指从网外轻轻揉搓渔网，直至胚胎分离，然后将分离的胚胎转移至培养液中(liuetal.,scientificreports.2016；kinoshitam.,muratak.,narusek.,tanakam.,medaka:biology,management,andexperimentalprotocols.,2009)，这种处理有利于将所收集的卵团分离成单个卵。kinoshita等(2009)还总结了使用其它两种方法，第一种，手指剥离法，在培养皿中使用食指分离鱼卵；第二种方法，镊子分离法，使用镊子撕断细丝，分离卵粒。幺宗利等(2009)使用接种环对青鳉受精卵进行了收集和分离(申请号：200910047280.0)。按照上述方法实际操作发现这些方法收集的鱼卵，由于卵膜上的丝状物依旧存在，多粒鱼卵很容易粘附在一起；而且容易导致部分受精卵破裂。被分离后的受精卵仍旧极易粘附在一起，降低细胞的呼吸；丝状物还粘附未清理干净的食物残渣、亲本粪便、导致水霉生长，降低孵化率；部分被撕断的长丝簇干扰胚胎发育的观察；基因工程实施过程中，卵膜表面的丝状物干扰显微操作注射外源基因。

我们认为这三种方法存一些共同缺点，分离后的受精卵仍旧很容易粘附在一起，降低细胞的呼吸；丝状物可粘附未清理干净的食物残渣、亲本粪便，导致水霉生长，降低孵化率；部分被撕断的长丝簇干扰胚胎发育的观察；基因工程实施过程中，卵膜表面的丝状物干扰显微操作注射外源基因。因此如何清理青鳉的受精卵/胚胎卵膜上的丝状物，已成为实验过程中面临的难题。因此本发明的目的就是提出了一种清理受精卵/胚胎卵膜表面丝状物的方法，促进青鳉受精卵的孵化率和实验可操作性，利于青鳉相关的生物学实验开展。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够快速分离葡萄串状青鳉受精卵为单个受精卵，同时清理受精卵(或早期胚胎)卵膜表面丝状物的方法。

本发明一种快速分离葡萄串状青鳉受精卵为单个受精卵并清理受精卵卵膜表面的方法：

一、将青鳉受精卵从雌性生殖孔剥离，转入培养液或者曝气自来水中；

二、用镊子或者接种环将成簇的受精卵分离成n块，每块中受精卵卵粒个数≤6；

三、在培养皿底部铺上砂纸，磨砂面朝上，再加入培养液或者曝气自来水浸没砂纸，且液面距砂纸上表面距离≤1mm；

四、将步骤二分离的受精卵放在步骤三湿润的砂纸上面，用揉滚受精卵≥30次，即实现葡萄串状受精卵分离为单个受精卵和表面丝状物的清除；

其中，步骤三中砂纸的目数≥200目。

本发明方法步骤三中揉滚受精卵的力度为令受精卵(或早期胚胎)在砂纸上滚动即可，一般实验人员揉滚10～20次既可以熟练掌握，并保证受精卵(或早期胚胎)不破裂。

本发明方法能够有效的实现葡萄串状青鳉受精卵分离为单个受精卵，去除受精卵卵膜表面丝状物，获得的青鳉胚胎卵膜表面干净、清洁，便于胚胎发育时期的观察和其它与之相关的实验。

本发明方法获得的青鳉受精卵可快速实现葡萄串状分离为单个受精卵，去除了卵膜表面丝状物，大幅提高了胚胎孵化率，而且该方法安全可靠，饲养至成鱼未发现有畸形存在。此外，本发明方法可以批量、迅速处理青鳉受精卵，达到快速分离簇快状的受精卵簇为单个受精卵，高效，省时，省力。

附图说明

图1是实施例1中刚刚从雌性生殖孔剥离成簇的青鳉受精卵观察图。

图2是实施例1步骤二中使用镊子或者接种环分离后的单个受精卵卵粒观察图。

图3是实施例1中2粒使用镊子或者接种环分离为单独的受精卵卵粒在培养皿挪动之后重新粘附在一起的观察图。

图4是实施例1中在砂纸上揉滚50次的青鳉受精卵观察图。

图5是实施例1中在砂纸上揉滚50次的青鳉受精卵静置培养9h后的观察图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式一种快速分离葡萄串状青鳉受精卵为单个受精卵并清理受精卵卵膜表面的方法：

一、将青鳉受精卵从雌性生殖孔剥离，转入培养液或者曝气自来水中；

二、用镊子或者接种环将成簇的受精卵分离成n块，每块中受精卵卵粒个数≤6；

三、在培养皿底部铺上砂纸，磨砂面朝上，再加入培养液或者曝气自来水浸没砂纸，且液面距砂纸上表面距离≤1mm；

四、将步骤二分离的受精卵放在步骤三湿润的砂纸上面，揉滚受精卵≥30次，即实现葡萄串状受精卵分离为单个受精卵和表面丝状物的清除；

其中，步骤三中砂纸的目数≥200目。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中用毛笔或者软刷子将青鳉受精卵从雌性生殖孔剥离。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤三中培养液中含有1g/lnacl、0.03g/lkcl、0.04g/lcacl2·2h2o和0.16g/lmgso4·7h2o。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点是：步骤四中用吸管吸取受精卵。其它步骤及参数与实施方式一、二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一、二、三或四的不同点是：步骤四中揉滚受精卵的次数为50～70次。其它步骤及参数与实施方式一、二、三或四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一、二、三、四或五的不同点是：步骤三中的砂纸为防水砂纸。其它步骤及参数与实施方式一、二、三、四或五相同。

具体实施方式七：本实施方式快速分离葡萄串状为单个受精卵并清理青鳉受精卵卵膜表面的方法：

一、将青鳉受精卵从雌性生殖孔剥离，转入培养液或者曝气自来水中；

二、在培养皿底部铺上砂纸，磨砂面朝上，再加入培养液或者曝气自来水浸没砂纸，且液面距砂纸上表面距离≤1mm；

三、将青鳉受精卵放在步骤二湿润的砂纸上面，揉滚受精卵≥30次，即实现表面丝状物的清除；

其中，步骤二中砂纸的目数≥200目。

实施例1

一、用毛笔将青鳉受精卵从雌性生殖孔剥离，转入培养液中(如图1所示)；

二、用镊子将成簇的受精卵分离成n块，每块中受精卵卵粒个数≤6(n也可以为1，即为整簇受精卵)；

三、在培养皿底部铺上2000cw防水砂纸，磨砂面朝上，再加入培养液，培养液浸没砂纸，且培养液液面距砂纸上表面距离≤1mm；

四、用吸管将步骤二分离的受精卵放在步骤三湿润的砂纸上面，揉滚受精卵30～70次，即实现表面丝状物的清除；

培养液中含有1g/lnacl、0.03g/lkcl、0.04g/lcacl2·2h2o和0.16g/lmgso4·7h2o。

本实施例步骤二中使用镊子分离为单个的2粒受精卵卵粒在培养皿挪动之后重新粘附在一起，如图3所示。

观察发现本实施例中揉滚30次可以处理掉部分的丝状物；揉滚50次即基本上可以处理掉绝大部分的丝状物，如图4所示；

揉滚50次后静置培养9h的受精卵如图5所示，与未经砂纸揉滚处理的胚胎发育时期相同。

按照本实施例方法获得的120粒青鳉胚胎分别置于孵化液和曝气自来水中进行孵化，水温26℃、经过12天开始孵化。置于孵化液和曝气自来水中孵化的胚胎孵化率分别为70％和52％。

对比组采用接种环将青鳉受精卵收集和分离(申请号：200910047280.0)120粒青鳉胚胎分别置于孵化液和曝气自来水中进行孵化，水温26℃、经过12天开始孵化。置于孵化液和曝气自来水中孵化的胚胎孵化率分别为61％和40％。

本实施例方法获得的青鳉胚胎卵膜表面干净、清洁，可以用于胚胎发育时期的观察和其它与之相关的实验。

和现有的镊子分离法、手指分离法、接种环分离法等方法相比，本发明方法具备高效、节省时间等优点，可以快速地处理大批待收集分离的青鳉亲鱼受精卵。在需要批量分离的成簇受精卵处理中，采用本发明方法对成串20～42粒/尾的成簇受精卵分离成单个受精卵需要1～2分钟即可分离，而使用现有其他方法分离需要3～5分钟。本实施例分离后的受精卵没有观察到受精卵重新粘附在一起，孵化过程水霉病发病率低于5～8％；而使用现有其他方法分离的受精卵有15～28％的受精卵又重新粘附(2个粘附，或者3～4个粘附)在一起，粘附在一起的受精卵水霉发病率为15～28％；使用曝气自来水孵化过程中，更容易发生水霉病，发病率为25-45％。

本实施例方法获得的青鳉胚胎经过4-5个月饲养，鱼苗生长为成鱼，未发现有畸形存在。