本发明涉及一种植物组织培养方法，尤其涉及一种金丝梅组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
：：植物组织培养作为现代植物生物技术的一个必不可少的手段和重要组成部分，是指在无菌条件下，通过人为控制，利用人工培养基，对植物的组织、器官、胚胎、细胞、原生质体等进行离体培养，使其发育成完整植株的过程。金丝梅(hypericumpatulum)别名云南连翘、芒种花，为藤黄科(guttiferae)金丝桃属(hypericum)半常绿灌木。高0.3-1.5米，茎淡红至橙色，花蕾宽卵珠形，花瓣金黄色，无红晕，多少内弯，长圆状倒卵形至宽倒卵形，雄蕊多数，花期6-7月，其大部分品种有金黄的花朵及鲜艳的果色，在中国主要分布于陕西、四川、云南、贵州、江西、湖南、湖北、安徽、江苏、浙江及福建等省，在甘肃天水地区进行过引种栽培。金丝桃属(hypericum)植物大部分品种因其观赏价值，是良好的园林绿化品种和切花材料，在切花以及盆花市场上越来越受到消费者青睐。同时，对金丝桃属(hypericum)植物复杂多样的生物活性物质、药理作用等方向的深入研究更为对该属植物开发利用提供了科学依据。金丝桃属植物有广泛的应用前景，但传统的繁殖方法周期较长，繁殖系数低，不能满足工厂化生产及市场的需求，而组织培养的快繁技术可以弥补其不足。建立稳定高效的快繁体系，不仅可以有效保存种质资源，还可以通过脱毒技术防止物种退化，并为工厂化生产提供有力依据。目前，组织培养技术在金丝桃属植物的育种工作中应用广泛，利用茎段、幼根、幼叶、幼嫩子房等作为外植体进行快繁。邢震以多蕊金丝桃的茎段为外植体，以ms为基本培养基，在添加naa0.5mg/kg，ba1.0～4.0mg/kg时芽诱导率较高；在添加iba3.0mg/kg时，苗复壮效果最好。陈全战等以贯叶金丝桃的幼根、幼茎、幼叶为外植体进行试验，发现1/2ms+ba1.3～1.6mg/l+naa0.2mg/l有利于愈伤组织培养；1/2ms+ba1.3～1.6mg/l+naa0.15mg/l有利于不定芽的形成；1/2ms+iba0.5～0.8mg/l+3.0％蔗糖有利于不定根诱导；任继文等以金丝桃嫩茎为外植体，发现ms+ba3.0mg/l+naa0.1mg/l对金丝桃嫩茎切段的再生作用较为显著，ms+ba2.0mg/l+iba0.2mg/l+ga30.5mg/l上增殖效果好，增殖倍数为6-8倍，1/2ms+iaa0.2mg/l上生根效果最好。刘艳等研究发现，贵州金丝桃茎段为最适外植体，在1/4ms+tdz0.5mg/l+naa0.01mg/l上进行芽的诱导效果最好；在1/4ms+zt1.5mg/l+naa1.0mg/l上继代增殖效果最好；在1/4ms+zt0.1mg/l+naa1.0mg/l上生根最好。另外，植物组织培养技术在金丝桃属植物次生代谢产物的研究中也起着重要的作用。刘晓娜通过研究贯叶连翘和元宝草植物组织培养过程中金丝桃素(hypericin，hp)、假金丝桃素(pseudohypericin，php)和贯叶金丝桃素(hyperforin，hf)等活性成分的变化规律以及这些活性成分的代谢调控，对这些活性成分的生物合成途径进行了探索。目前，对金丝梅的研究还很少，只有少量国外的文献报道在金丝梅的组织培养技术以及愈伤组织中分离得到一系列戊二烯化的氧杂蒽酮类黄酮化合物及(-)表儿茶素、齐墩果酸、β-谷甾醇等。通过对金丝梅进行组织培养，一方面可以对金丝梅进行扩繁，满足其在北京地区引种的需求，为以后的商业化生产提供理论基础；另一方面，为以后金丝梅次生代谢产物的研究提供理论依据。现有技术中：1.在外植体消毒处理方法上，雷颖等将金丝梅茎段放入升汞溶液中进行振荡消毒处理，然而汞是一种毒性物质，可使蛋白质变性，皮肤接触无机汞化合物溶液可引起接触性皮炎，出现红斑、丘疹、水疱，容易继发感染，严重者可发生剥脱性皮炎。试验中使用升汞一方面会对操作人员的安全造成威胁，另一方面还会对环境造成污染，目前国内已禁止使用升贡作为消毒剂。2.在不定芽诱导阶段，雷颖等在培养基中加入ba和naa的基础上加入水解乳蛋白，无菌小茎段在分化培养基上20d后茎节处逐渐分化出丛芽，30d后芽长1～2.5cm。3.在生根与移栽阶段，雷颖等的处理使组培苗移栽成活率为93.6％。技术实现要素：本发明的目的是提供一种金丝梅组织培养快速繁殖方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明的金丝梅组织培养快速繁殖方法，以金丝梅茎段为外植体，进行组培快繁，包括步骤：外植体消毒处理：先用毛刷在洗洁精水中把枝条外部清洗干净，并流水冲洗2-3h，然后，在超净工作台进行外植体表面消毒灭菌，75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗1-2次，再用5％的次氯酸钠浸泡7-8min，无菌水冲洗3次，放于无菌滤纸晾干以备接种用；初代培养：适宜金丝梅初代培养的培养基配方为ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l；继代增殖：金丝梅继代增殖的最适培养基为ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+ga30.1mg/l；生根培养：金丝梅生根的最适培养基为1/2ms+iba0.5mg/l+活性炭0.1g/l；炼苗移栽：移栽前将生根苗从培养瓶内移出并用2％的多菌灵溶液洗净根上粘附的培养基，栽于事先准备好的草炭土∶珍珠岩＝2∶1的混合基质容器中，移栽后浇透水，再覆盖塑料薄膜10-20d保湿保温，适当遮荫。由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的金丝梅组织培养快速繁殖方法，利用组织培养的方法进行育种，对外植体消毒处理方法上，既可达到消毒的目的，对环境的危害也较小；在不定芽诱导阶段，对诱导增殖的培养基进行了优化，诱导率高，节省了成本；在生根与移栽阶段，植株生长良好，移栽后的成活率为100％。具体实施方式下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。本发明的金丝梅组织培养快速繁殖方法，其较佳的具体实施方式是：以金丝梅茎段为外植体，进行组培快繁，包括步骤：外植体消毒处理：先用毛刷在洗洁精水中把枝条外部清洗干净，并流水冲洗2-3h，然后，在超净工作台进行外植体表面消毒灭菌，75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗1-2次，再用5％的次氯酸钠浸泡7-8min，无菌水冲洗3次，放于无菌滤纸晾干以备接种用；初代培养：适宜金丝梅初代培养的培养基配方为ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l；继代增殖：金丝梅继代增殖的最适培养基为ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+ga30.1mg/l；生根培养：金丝梅生根的最适培养基为1/2ms+iba0.5mg/l+活性炭0.1g/l；炼苗移栽：移栽前将生根苗从培养瓶内移出并用2％的多菌灵溶液洗净根上粘附的培养基，栽于事先准备好的草炭土∶珍珠岩＝2∶1的混合基质容器中，移栽后浇透水，再覆盖塑料薄膜10-20d保湿保温，适当遮荫。所述金丝梅茎段取自云南带有休眠芽的茎段，选取金丝梅幼嫩未木质化的枝条，将枝条剪成2-3cm的小段作为外植体，并保证每个小段具1-2个腋芽。本发明的金丝梅组织培养快速繁殖方法，利用组织培养的方法进行育种已成为花卉育种的主要手段，为花卉育种提供了全新的思路，展现出广阔的前景。金丝梅具有较高的观赏价值，传统育种周期长，子代变异率高，而利用本发明的组织培养技术，可以弥补传统育种的不足，为金丝梅在北京地区的引种驯化提供一定的基础。同时，也为其药用价值的研究提供理论依据。本发明：在外植体消毒处理方法上，采用5％的次氯酸钠进行消毒处理，既可达到消毒的目的，对环境的危害也较小；在不定芽诱导阶段，在不加水解乳蛋白的情况下，也能达到相似的效果，且30d后丛芽长至2～3cm，诱导率为90％。节省了成本，对诱导增殖的培养基进行了优化；在生根与移栽阶段，在诱导生根的同时，植株生长良好，诱导30d后株高可达9.22cm，平均增高5～6cm，且移栽后的成活率为100％。具体实施例：1材料金丝梅(hypericumpatulum)带有休眠芽的茎段取自云南大理。2方法(1)外植体消毒处理试验选取金丝梅幼嫩未木质化的枝条，将枝条剪成2-3cm左右的小段作为外植体，并保证每个小段具1-2个腋芽。外植体消毒处理方法如下：先用毛刷在洗洁精水中把枝条外部清洗干净，并流水冲洗2-3h；然后在超净工作台进行外植体表面消毒灭菌，75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗1-2次；然后用5％的次氯酸钠浸泡7-8min，无菌水冲洗3次，放于无菌滤纸晾干以备接种用。在此处理条件下，污染率为67％。(2)初代培养将消毒处理后的茎段，接种到配方为ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l的培养基上，培养基ph5.8-6.0，121℃恒温灭菌21min。培养条件为温度24(±2)℃、光照强度1600-2000lx、光照时间为14h/d，30d后继代培养1次，60d后获得无菌试管苗。诱导率为90％。(3)继代培养将初代培养诱导出的长度大于1cm的不定芽进行继代，以ms为基本培养基，添加不同浓度的6-ba(0.5、1.0、2.0mg/l)、naa(0.1、0.2、0.3mg/l)，具体处理见表1。添加蔗糖20g/l，琼脂5g/l，调节ph5.8-6.0。每个处理接种20个，3次重复，30d后统计金丝梅的增殖倍数，并记录生长状况。表1不同浓度的6-ba、naa处理table1treatmentofdifferentconcentrationsof6-baandnaa(4)生根培养以1/2ms为基本培养基，添加不同浓度的naa或iba，探究不同浓度的naa、iba对生根的影响，具体处理见表2。从增殖诱导的丛生芽中，选取生长健壮，长势一致的芽苗，接入各培养基中，每个处理20个外植体，重复3次。接种30d后统计芽苗的生根率、平均生根数及生根长度并记录生长状况。表2不同浓度的naa、iba处理table2treatmentofdifferentconcentrationsofnaaoriba(5)炼苗移栽把生根良好的金丝梅试管苗进行炼苗移栽。移栽前将生根瓶苗移至温室炼苗7d左右，移栽前2d旋松瓶盖。移栽前将生根苗从培养瓶内移出并用2％的多菌灵溶液洗净根上粘附的培养基，栽于事先准备好的草炭土∶珍珠岩＝2∶1的混合基质容器中，移栽后浇透水，再覆盖塑料薄膜10-20d保湿保温，适当遮荫，以提高成活率。30d后统计移栽成活率。(6)数据处理利用excel软件、spss19.0软件对试验数据进行处理。增殖倍数＝培养30d后诱导出的丛生芽个数/接种芽数生根率(％)＝生根苗数/接种数×100％平均根数(条)＝根总条数/生根植株总数移栽成活率(％)＝移栽成活数/移栽植株总数×100％本发明技术方案带来的有益效果：1.不同激素处理对金丝梅茎段继代培养的影响将初代培养诱导的不定芽进行继代培养，试验结果如表3，可以看出，随着6-ba浓度的增加，增殖倍数先升高后降低，当浓度为1.0mg/l时，增殖倍数最高，为5.12，此时组培苗生长健壮，适宜下一步的生根处理。另外，随着naa浓度的增加，增殖倍数逐渐降低，表明高浓度的naa对金丝梅的增殖具有抑制作用。综合考虑，适宜金丝梅继代增殖的最佳培养基为ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+ga30.1mg/l。表3不同浓度的6-ba、naa对金丝梅增殖的影响table3theeffectof6-baandnaaonproliferationofhypericumpatulum2.不同浓度的naa与iba对生根的影响由表4、表5可知，naa或iba对金丝梅的生根均有促进作用。在添加naa时，平均生根条数在2-3条，生根数量较少组培苗的基部会出现大量的愈伤组织，在培养基接触空气的地方有白色毛状根出现，随着naa浓度的增加，毛状根的数量增加，植株长势一般；在添加iba时，平均生根条数在2-6条，生根率可达96.69％，在培养基接触空气的地方出现白色毛状根的数量较少，随着iba浓度的增加，植株的生根率、生根数量、平均株高等先升高后降低。本试验表明，激素对金丝梅生根状态有很大的影响。随着生长素浓度增加，暴露在空气中的组培苗的基部会有白色毛状根出现，且粗短，生长状况一般。附加naa的培养基中比附加iba的培养基更易产生白色毛状根。在低浓度iba的培养基中，诱导的根长势良好，毛状根少，长势旺盛。但随着浓度进一步增加，毛状根的数量也逐渐增多。在近培养基的上方嫩茎的周围产生的纤细的毛状根不仅使植株生长状态不佳，而且培养基下方的不定根质量较差。因而，毛状根产生是不利的。因此，选用低浓度的激素有较好的生根状态，对金丝梅不定根的诱导效果最好。本试验筛选出的最适生根培养基为1/2ms+iba0.5mg/l+活性炭0.1g/l。表4不同浓度naa对金丝梅生根的影响table4theeffectofnaaonexplantsrootingofhypericumpatulum表5不同浓度iba对金丝梅生根的影响table5theeffectofibaonexplantsrootingofhypericumpatulum3.试管苗炼苗移栽移栽后金丝梅试管苗成活率为100％。试管苗在温室移栽30d后，进行大田移栽试验，植株长势良好，茎干粗壮，叶片浓绿，在不遮阴的条件下，可以安全越夏，冬季稍加覆盖便可露地越冬。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
：的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。当前第1页12当前第1页12