一种脂肪组织的冻存方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种脂肪组织的冻存方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

自2001年科尔曼博士发表了首份自体脂肪移植的报告后，自体脂肪移植术在整形美容外科领域中已被广泛运用。目前自体脂肪移植主要可应用于面部和手部等部位年轻化、疤痕修复、乳房再造、增大以及其它部位大面积的改造等。除此之外，脂肪还可成为组织工程与再生医学方面完美的应用材料来源，例如糖尿病患者、类风湿关节炎、老年人或其他有慢性伤口和溃疡病的人群，可从该技术得到受益。到目前为止，自体脂肪移植后，影响软组织增强效果的主要障碍是移植后不可预估的长期效应，其主要原因是移植部位的吸收率过高所带来(高达原始移植体积的70％)。这种高吸收通常需要在矫正区域进行过度矫正或重复的脂肪移植操作，这样会引起病人不适，移植部位外观不理想，感染风险增加，并且还有随之而来的高昂医疗费用等问题。

目前脂肪抽吸物主要用于在抽脂术进行过程中的即刻自体脂肪填充，因此填充后剩余的脂肪抽吸物通常被丢弃。如果有更有效的脂肪储存手段，对医生和患者而言，更具有实际应用意义。例如将收集的脂肪抽吸物根据后期患者移植的需求，将脂肪组织分成不同体积进行冻存，这么做的益处是不仅降低患者经济成本，而且减少患者的不适、并发症等风险。除此之外，年轻的细胞、组织更健康、耐寒、活力更高，医生可选择性的收集脂肪组织冻存，随着患者年纪的增长，一方面作为未来身体各部位软组织填充或增强方面的应用材料；另一方面还可作为获取脂肪间充质干细胞的主要来源，以备基于细胞疗法的各种疾病的临床应用。

现代的冷冻保存技术允许长期储存各类活细胞以及某些组织，归纳组织冻存的主要程序如下：(1)冻存前根据组织的特性向组织中加入适合的冷冻保护剂；(2)以可控的速率将组织冷却至低温；(3)细胞长期储存至深冻环境。其中影响组织冻存的核心环节是冷冻保护剂的选择以及合理的温度控制。由于冷冻对于大多数生物体是致命的，冷冻可形成胞内胞外冰晶，导致细胞机械性损伤和渗透性损伤。因此为了提高脂肪组织后期的移植成活率、保证移植效果以及后期复融脂肪组织后的脂肪间充质干细胞得率和活率，脂肪组织的冻存环节需要进一步改良和控制。

2016年11月，陈海佳等人申请了相关专利(中国专利申请号：cn201611082588.5、cn201611087952.7)，专利主要对脂肪组织的冻存保护液进行创新，进一步降低冻存液对脂肪组织的毒副作用，提升复融后脂肪组织获取脂肪间充质干细胞的得率和活率。但在组织冻存过程中其他可能影响到组织复融活性的因素，因脂肪组织冻存和临床应用技术多在于科学研究中，还未进行大规模的商业化用途，因此目前涉及到全方面解决脂肪组织冻存复融后临床应用的规范化、标准化方法较少见，亦无国内专利涉及。因此本发明主要针对脂肪组织的各冷冻保存核心环节，提出可提高冻存脂肪组织活性的一种方法。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)在组织冻存过程中除了冻存保护液的因素外，还有其他可能影响到组织复融活性的因素，会造成脂肪以及脂肪间充质干细胞的得率和活率较低。

(2)目前常用的冻存保护液含有胎牛血清、培养基等成分，胎牛血清有免疫原性及病毒污染风险的可能，常用商用培养基中的不确定成分也可能带来一定的免疫原性，这些都会导致后期临床应用人体的不良反应。

(3)现有技术，没有在脂肪组织冻存过程中设计减少热应力对脂肪组织的损害、控制冷冻速率等环节，因此有可能造成冻存脂肪组织保存效果不稳定，不能有效提升复融后脂肪组织的活性，移植效果不理想等后果。

(4)现有的脂肪组织冻存技术由于操作过程的不可控性以及冻存效果的不稳定性，无法形成标准化的冻存方案，亦不能进行后期大规模的产业化生产。

针对以上问题，本发明主要解决的问题首先是尽可能的降低冻存保护液对临床人体应用带来的免疫原性和病毒污染等风险；第二是将热应力对冻存脂肪组织带来的损害通过特殊处理工艺进一步降低；最后是设置合理的脂肪组织冷冻曲线，通过程序可控的速率冷冻仪对脂肪组织进行冻存。本发明的意义在于，从脂肪组织冷冻保护液改良、热应力降低以及冻存速率控制等方面进行方案的设计，降低了脂肪组织冷冻和临床移植的风险性、不稳定性以及不良反应，提高后期临床应用的成功率和稳定性，最后，本发明能够为后期标准化、规范化的脂肪组织冻存提供一个具有参考意义的方案，推动该类产品的大规模产业化进程。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种脂肪组织的冻存方法。

本发明是这样实现的，一种脂肪组织的冻存方法，所述脂肪组织的冻存方法包括：

步骤一，脂肪组织冻存保护液的配置：冻存保护液的各成分按体积百分比由二甲基亚砜3～8％、低分子右旋糖酐1～5％、人血小板裂解物70～90％、海藻糖2～5％组成；

步骤二，脂肪抽吸物的处理：脂肪抽吸物加入生理盐水进行离心冲洗，于4℃条件下静置5～20min，待脂肪组织和肿胀液分层后弃去液体层；将收集的脂肪组织使用孔径为2.0～2.3mm的纳米脂肪转换器进行切割，随后再用孔径为1.5mm的纳米脂肪转换器再次对脂肪组织进行处理；将处理后的脂肪组织同步骤一配置好的冻存保护液以一定比例充分混匀后快速加入冻存管；

步骤三，脂肪组织冻存：将含有脂肪组织的冻存管于4℃平衡后，按照预控制的冷冻曲线进行冷冻，最后于-196℃条件下的液氮罐中长期储存。

进一步，步骤二中，脂肪抽吸物加入适量生理盐水进行离心冲洗，离心条件为4℃，1300r/min，5min，离心3次。

进一步，步骤二中，脂肪组织和冻存保护液的体积混合比例为3:2。

进一步，步骤三中，冷冻曲线为：

以-1～-2℃/min，降温时间2～4min，降至0℃，保持5～10min；

以-2℃/min，降温时间5min，降至-10℃；

随后从-10℃速降至-30℃，降温时间3～5sec，保持5～10min；

以-5～-10℃/min，降温时间7～10min，从-30℃降至-100℃。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述脂肪组织的冻存方法的脂肪组织的冻存设备。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明脂肪组织冷冻保护液的成分设计通过应用细胞膜渗透性保护剂二甲基亚砜(dmso)和非膜性渗透保护剂：低分子右旋糖酐、海藻糖等联合应用，一方面降低dmso应用浓度，减轻dmso对脂肪细胞毒性作用；另一方面也降低后期临床脂肪移植后残余dmso对人体带来的危害。除此之外，由于该发明可应用于人体临床应用，因此冷冻保护液禁止含有不确定成分以及异源性物质，包括胎牛血清、培养基等。本发明的脂肪组织冷冻保护液不含有任何不确定成分，且应用了人血小板裂解物替代胎牛血清，对脂肪组织进行营养支持，规避了免疫原性、动物源性病毒污染等风险，满足建立标准化临床应用的脂肪冷冻保存方案。

脂肪组织的热应力在组织复苏回温的过程中会导致组织的裂纹甚至断裂，影响最终存活率。热应力是由不均匀加热冻存物质所导致的一种机械力，由于组织的热导相对低，高比热，体积大等因素，传统加热方式会引起组织温度梯度大，热应力高，最终引起组织的断裂。本发明针对该问题在冷冻前对脂肪组织使用脂肪转换器进行两次切割处理，一方面适量减少冻存物体积；另一方面使用的脂肪转化器可以将脂肪组织切割为相对一致大小的体积，保证水浴完全加热时，各个切割组织的受热均一。这样做的益处在于减少热应力对组织的损伤，提升组织存活率。

脂肪组织冻存的另一重要环节是冷冻速率，这是影响组织后期复苏存活率的另一重要因素。组织降温过快,则随着细胞外冰晶的形成，细胞内水分渗出，引起细胞脱水性“溶质性损伤”，该损伤对细胞而言是致死性的；如果降温过慢，细胞内水不及外渗，则在细胞内形成小冰晶，亦可引起致死性的“冰晶性损伤”。而通过目前检索，国内关于脂肪组织冻存的速率控制还未有涉及，因此本专利根据脂肪组织的特性设计了冷冻曲线，在影响脂肪组织冷冻存活率两个关键温度：-10℃以及-30℃，进行了降温速率的程序性控制，目的是减少降温过程中细胞的“溶质性损伤”和“冰晶性损伤”。

本发明对于脂肪组织的处理以及程序性降温的控制，可对后期脂肪组织冻存标准化方案的建立起到促进作用，有利于临床应用效果的稳定性、安全性以及有效性。

附图说明

图1是本发明实施例提供的新鲜脂肪组织组和冻存3个月的脂肪组织组原代分离培养的脂肪间充质干细胞情况图；

图中：图a为新鲜脂肪组织原代分离10d后，p0代脂肪间充质干细胞情况；图b为冻存3个月的脂肪组织原代分离10d后，p0代脂肪间充质干细胞情况；可看到冻存组细胞数量明显多于新鲜脂肪组；图c为新鲜脂肪组织传代后的脂肪间充质干细胞情况；图d为冻存3个月脂肪组织传代后的脂肪间充质干细胞情况，可以看到两组脂肪间充质干细胞形态无差异，均保持了较高细胞增殖活性。

图2是本发明实施例提供的冻存3个月的脂肪组织组分离得到的脂肪间充质干细胞成脂诱导情况图；

图中：a图为冻存组的脂肪间充质干细胞成脂诱导14d后形成的大量脂滴结构；b图为脂滴的“oil-red”染色。说明脂肪组织冷冻3个月后，所获得的脂肪间充质干细胞依然可以正常分化为脂肪细胞。

图3是本发明实施例提供的新鲜脂肪组织组和冻存脂肪组织复融组的裸鼠移植实验图；

图中：a-d为脂肪组织冻存3个月后复融并移植小鼠1d，7d，28d及35d的情况；e-h为新鲜脂肪组织移植小鼠1d，7d，28d及35d的情况。

图4是本发明实施例提供的将两组取出的脂肪移植物进行切片和he染色图。

其中，图a为冻存脂肪组织组，图b为新鲜脂肪组织组，二者的组织细胞结构均清晰完整，冻存组与新鲜脂肪组形态上并无明显差异，可保存完整的脂肪结构。

图5是本发明实施例提供的脂肪组织的冻存方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明根据脂肪组织的特性和应用特点，主要通过脂肪组织冻存过程中，减少热应力对脂肪组织的损害、控制冷冻速率以及优选冷冻保护剂等方面，进一步提高冻存脂肪组织活性。本发明提供的冻存脂肪组织的方法，保存效果稳定，并可有效提升复融后脂肪组织的活性，移植效果较为理想。

下面结合具体分析对本发明的应用进一步描述。

图5，本发明实施例提供的脂肪组织的冻存方法，包括：

s101:脂肪组织冻存保护液的配置：所述冻存保护液的各成分比例均为体积百分比。二甲基亚砜3～8％、低分子右旋糖酐1～5％、人血小板裂解物70～90％、海藻糖2～5％，以上试剂均为临床应用或临床细胞治疗级别产品。

s102:脂肪抽吸物的处理：脂肪抽吸物加入生理盐水进行离心冲洗，于4℃条件下静置5～20min，待脂肪组织和肿胀液分层后弃去液体层。将收集的脂肪组织使用孔径为2.0～2.3mm的纳米脂肪转换器进行首次切割，随后再用孔径为1.5mm的纳米脂肪转换器再次对脂肪组织进行处理。将处理后的脂肪组织同步骤s101配置好的冻存保护液以一定比例充分混匀后快速加入冻存管。

s103:脂肪组织冻存：将含有脂肪组织的冻存管于4℃平衡后，置于程控速率冷冻仪中，按照预控制的冷冻曲线进行冷冻，最后于-196℃条件下的液氮罐中长期储存。

步骤s102中，脂肪抽吸物加入适量生理盐水进行离心冲洗，离心条件为4℃，1300r/min，5min，离心3次；

步骤s102中，脂肪组织和冻存保护液的混合比例为3:2。

步骤s103中，冷冻曲线为：以-1～-2℃/min，降温时间2～4min，降至0℃，保持5～10min；以-2℃/min，降温时间5min，降至-10℃；随后从-10℃速降至-30℃，降温时间3～5sec，保持5～10min；以-5～-10℃/min，降温时间7～10min，从-30℃降至-100℃。

下面结合具体实验分析对本发明的效果作进一步描述。

本发明实施例提供的脂肪组织的冻存方法，包括：

(一)脂肪组织冻存保护液的配置：冻存保护液的各成分比例均为体积百分比。具体成分比例如下：

二甲基亚砜5％、低分子右旋糖酐1％、人血小板裂解物90％、海藻糖4％，以上试剂均为临床应用或临床细胞治疗级别产品。冻存保护液配置好后于4℃保存。

(二)脂肪抽吸物的处理：脂肪抽吸物加入适量生理盐水进行离心冲洗，离心条件为4℃，1300r/min，5min，离心3次，4℃条件下静置10min，待脂肪组织和肿胀液分层后弃去液体层。将收集的脂肪组织使用孔径为2.0～2.3mm的纳米脂肪转换器进行首次切割，随后再用孔径为1.5mm的纳米脂肪转换器再次对脂肪组织进行切割处理。将处理后的脂肪组织同步骤一配置好的冻存保护液以脂肪组织和冻存保护液3:2的体积比例充分混匀，快速加入冻存管。

(三)脂肪组织冻存：将含有脂肪组织的冻存管于4℃平衡后，置于程控速率冷冻仪中，按照预控制的冷冻曲线进行冷冻，冷冻曲线为：-2℃/min，降温时间2min，降至0℃，保持10min；-2℃/min，降温时间5min，降至-10℃；随后从-10℃速降至-30℃，降温时间5sec，保持10min；以-10℃/min，降温时间7min，从-30℃降至-100℃，最后于-196℃条件下的液氮罐中长期储存。

(四)脂肪组织复苏及脂肪间充质干细胞的培养：液氮保存罐中取出冻存3个月的细胞冻存管，立即于37℃水浴锅中解冻，清洗离心收集组织，胶原酶震荡消化30min，消化后组织冲洗离心，间充质干细胞培养基重悬细胞，根据细胞数量进行接种，每三天半换液一次，待细胞融合度达80％进行传代。

同时取同一供体的新鲜脂肪组织，原代分离方法及细胞培养方法同上。

实验结果：如图1，图a为新鲜脂肪组织原代分离10d后，p0代脂肪间充质干细胞情况；图b为冻存3个月脂肪组织原代分离10d后，p0代脂肪间充质干细胞情况；实验结果显示：冻存组细胞数量明显多于新鲜脂肪组；图c为新鲜脂肪组织经传代后的细胞情况；图d为冻存3个月脂肪组织经传代后的细胞情况，可以看到两组细胞形态无差异，均保持较高的细胞增殖活性。

(五)脂肪间充质干细胞表型鉴定：取p3代脂肪组织冻存组细胞，调整好细胞浓度后，加入单抗cd105、cd166、cd90孵育，处理好后上机进行流式细胞仪检测。

实验结果：冻存组细胞的间充质干细胞标记物cd105、cd166、cd90均为阳性表达，证明冻存脂肪组织所分离培养的细胞符合isct针对间充干细胞的鉴定标准，为脂肪间充质干细胞。

(六)脂肪间充质干细胞分化能力鉴定：取p3代冻存组分离的脂肪间充质干细胞，更换培养基为成脂诱导培养基进行培养，每3d更换一次成脂诱导培养基，14d后镜下观察并进行“oil-red”染色。

实验结果：如图2，a图为冻存组的脂肪间充质干细胞成脂诱导14d后形成的大量脂滴结构；b图为脂滴的“oil-red”染色。说明脂肪组织冷冻3个月后，所获得的脂肪间充质干细胞依然可以正常分化为脂肪细胞。

(七)脂肪组织动物移植实验：取6周龄裸鼠，随机分成三组：新鲜脂肪组织组、冷冻脂肪组织组、空白对照组。将冻存3个月的脂肪组织和新鲜脂肪组织使用脂肪移植专用注射针头按照分组条件分别进行注射，注射体积200ul，观测35d后，处死小鼠，取脂肪组织进行病理切片和he染色并观察。

实验结果：如图3，a-d为脂肪组织冻存3个月后复融并移植小鼠1d，7d，28d及35d的情况；e-h为新鲜脂肪组织移植小鼠1d，7d，28d及35d的情况；取出移植物后，冻存脂肪组织组和新鲜脂肪组织组移植物的最终保留体积，可以看到冻存脂肪组织组略小于新鲜组织组；图4为将两组取出的脂肪移植物进行切片和he染色，图a为冻存脂肪组织组，图b为新鲜脂肪组织组，二者的组织细胞结构均清晰完整，冻存组与新鲜脂肪组形态上并无明显差异，可保存完整的脂肪结构。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。