脐带组织的冻存复苏方法和间充质干细胞的制备方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及脐带组织的冻存复苏方法和间充质干细胞的制备方法。
背景技术：
：脐带是连接胎儿与胎盘之间的重要物质，为管状结构，外面为羊膜结构，里面为两条动脉和一条静脉，在血管的间隙充满疏松的胶状结缔组织即华通胶。脐带间充质干细胞可以应用于多种疾病治疗，其来源于新生儿，因其对捐赠者完全无害，本身曾是医疗废弃物，获取难度低，供体来源充足，且不涉及敏感的伦理问题等优势，已成为现今干细胞研究的焦点，并为未来将干细胞研究应用于再生医学、临床医学和组织工程学奠定了良好的物质基础。但是常用的获得间充质干细胞的方法是先从新鲜的脐带中分离出间充质干细胞，然后冻存细胞，待需要干细胞的时候再解冻。在这一过程中，新鲜的脐带如果不能立即处理掉，很容易腐烂掉，然后浪费并且舍弃掉。因此，需要直接将脐带保存起来的方法，然后等到需要的时候再复苏脐带组织，进而分离间充质干细胞。公开号为cn108251361a的中国发明专利申请公开了一种脐带组织冻存的方法，该专利所述的脐带组织冻存方法是采用无血清冻存液对脐带组织碎块进行冻存，对脐带组织的冻存起到有效的保护作用。使用该方法得到的脐带组织块的组织完整性不佳，不利于临床治疗中对大块片状组织的需求，例如关节损伤、跟腱损伤等运动医学方面的治疗、糖尿病足等慢性创伤的治疗。因此，有必要提供一种新的脐带组织冻存复苏方法以解决现有技术存在的上述问题。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种脐带组织的冻存复苏方法，实现大块片状组织的冻存，提高所需冻存脐带组织的完整性，有效保持组织中细胞的活性。本发明的所述脐带组织的冻存复苏方法，包括如下步骤：s11：将所述脐带组织剪成剪切为若干组织片，所述组织片的长度为2～4cm，所述组织片的宽度为2～6cm，所述组织片的厚度为0.1～5mm；s12：将所述组织片和冻存液加入到冻存容器中，然后将所述冻存容器置于2～6℃温度下冷藏0.5～1小时后，转移到-25～-15℃温度下冷冻1-2小时，再转移到-85℃～-75℃温度下进行冻存处理；s13：取出所述冻存容器，置于35～39℃温度下复苏所述组织片，得到复苏组织片；其中，所述冻存液包含渗透性保护剂、糖类物质及缓冲液，所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜、甘油或丙二醇中的至少一种，所述糖类物质包括蔗糖、葡萄糖或海藻糖中的至少一种。本发明所述脐带组织冻存复苏方法，其有益效果在于：所述脐带组织的冻存复苏方法将所述脐带组织剪切为长度为2～4cm，宽度为2～6cm，厚度为0.1～5mm的所述组织片，所述组织片为大块片状组织，有利于在后续的冻存复苏过程中有效保持脐带组织结构的完整性，以满足临床治疗中对大块片状组织的需求，例如关节损伤、跟腱损伤等运动医学方面的治疗、糖尿病足等慢性创伤的治疗；同时，结合依次在2～6℃、-25～-15℃和-85～-75℃的温度下进行不同时间的冻存处理，进一步减少了冻存复苏过程中对所述组织的损伤，有利于有效保持组织中细胞的活性。进一步地，所述步骤s12中，进行8～12小时的所述冻存处理后，将装有所述组织片和所述冻存液的所述冻存容器转移至液氮中冻存。其有益效果在于：进行冻存处理后再转入液氮中冻存，可以有效减少冻存过程中冰晶的形成，保持组织中细胞的活性。进一步地，所述渗透性保护剂的体积占所述冻存液体积的百分比为2％～20％，所述糖类物质的含量为0～0.2m。其有益效果在于：所述冻存液不含有动物源物质，降低了安全隐患，同时与含有人血清白蛋白或ksr血清替代物的冻存液相比较，本发明所述冻存液成本较低。进一步地，所述渗透性保护剂的体积占所述冻存液体积的百分比为2.5％～10％，所述糖类物质的含量为0.2m。进一步地，所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜。进一步地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、生理盐水、dmem培养基、mem培养基、dmem/f12培养基或rpmi160培养基中的至少一种。进一步地，所述冻存液还包含维生素c或叔丁基对苯二酚中的至少一种，所述维生素c的含量为0～5mm，所述叔丁基对苯二酚的含量为0～5μm。其有益效果在于：在所述冻存液中添加了安全的抗氧化剂维生素c或叔丁基对苯二酚，能够有效稳定脐带组织的结构形态，更好地保持脐带组织的活性。本发明还提供一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：s21：采用所述冻存复苏方法获得复苏组织片，将所述复苏组织片剪碎，得到组织碎块，所述组织碎块的体积大小为2～3mm3；s22：将所述组织碎块用清洗液清洗，所述清洗液为含有双抗的磷酸盐缓冲液；s23：向所述组织碎块中加入细胞培养基，在二氧化碳培养箱中培养15～20天后，利用酶或所述细胞培养基进行消化处理；s24：收集细胞，得到间充质干细胞。本发明所述间充质干细胞的制备方法，其有益效果在于：所述步骤s23将所述组织碎块直接培养为间充质干细胞，所述方法简单易行，同时能够有效保持细胞活性，提高细胞存活率。进一步地，在所述步骤s23中，将所述组织碎块用胶原酶进行消化处理，将消化后的组织碎块过滤，收集过滤液离心处理得到细胞混合沉淀，将所述细胞混合沉淀用所述细胞培养基进行重悬，得到细胞混合悬液，将所述细胞混合悬液接种到培养皿中培养。进一步地，向所述离心管中加入所述胶原酶后，将所述离心管在10～20r/min的振动频率下振动15～25小时。进一步地，所述双抗的体积占所述清洗液体积的百分比为1％～3％。进一步地，所述细胞培养基包含胎牛血清、双抗、l-丙胺酰-谷氨酰胺及mem培养基，所述胎牛血清的体积占所述细胞培养基体积的百分比为10％～25％，所述双抗的体积占所述细胞培养基体积的百分比为0.5％～2％，所述l-丙胺酰-谷氨酰胺的体积占所述细胞培养基体积的百分比为0.5％～2％，余量为所述mem培养基。附图说明图1为本发明的脐带组织的冻存复苏方法流程图；图2为本发明的间充质干细胞的制备方法流程图。具体实施方式除非另作定义，本发明权利要求书和说明书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属
技术领域：
内具有一般技能的人士所理解的通常意义。为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对本发明要求保护的范围不起任何限定作用。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。完成本发明的实验条件除明确注明的试剂进行实验时，其余采用常规条件的实验方法及试剂进行实验。其中本发明明确注明的试剂为：蔗糖为西格玛(sigma)公司生产，产品编号为：v900116-500g；葡萄糖为sigma公司生产，产品编号为：v900392-1kg；二甲基亚砜为sigma公司生产，产品编号为：34869-4l；l-丙胺酰-谷氨酰胺溶液为上海源培生物科技股份有限公司生产，产品编号为：s240jv；双抗指包含青霉素和链霉素的混合液，所述混合液由上海源培生物科技股份有限公司生产，产品编号为：s110jv；磷酸盐缓冲液为杜氏磷酸盐缓冲液(dulbecco'sphosphatebufferedsaline，dpbs)，由上海源培生物科技股份有限公司生产，产品编号为：b260kj；mem培养基为上海源培生物科技股份有限公司生产，产品编号为：l560kj。本发明实施例提供了一种脐带组织的冻存复苏方法，请参阅图1，具有如下步骤：s11：将脐带组织剪切为若干组织片，所述组织片的长度为2～4cm，所述组织片的宽度为2～6cm，所述组织片的厚度为0.1～5mm；s12：将所述组织片和冻存液加入到冻存容器中，然后将所述冻存容器置于2～6℃温度下冷藏0.5～1小时后，转移到-25～-15℃温度下冷冻1～2小时，再转移到-85℃～-75℃温度下进行冻存处理；s13：在35～39℃下对装有所述组织片和所述冻存液的所述冻存容器进行复苏处理，得到复苏组织片。本发明实施例中，所述冻存液由渗透性保护剂、糖类物质及缓冲液组成，所述渗透性保护剂为二甲基亚砜、甘油、丙二醇中的至少一种，所述糖类物质为蔗糖、葡萄糖或海藻糖中的至少一种。本发明一些实施例中，所述步骤s11还包括用含有所述双抗的所述磷酸盐缓冲液对所述组织片进行洗涤处理。本发明的一些实施例中，所述步骤s12中，进行8～12小时的所述冻存处理后，将装有所述组织片和所述冻存液的所述冻存容器转移至液氮中冻存。本发明的一些实施例中，所述渗透性保护剂的体积占所述冻存液体积的百分比为2％～20％，所述糖类物质的含量为0～0.2m。一些具体实施例中，所述渗透性保护剂的体积占所述冻存液体积的百分比为2％，4％，6％，8％，10％，12％，14％，16％，18％或20％中的任意一种。一些具体实施例中，所述糖类的含量为0m，0.01，0.02m，0.04m，0.06m，0.08m，0.1m，1.2m，1.4m，1.6m，1.8m或2.0m中的任意一种。本发明的一些实施例中，所述缓冲液包含磷酸盐缓冲液、生理盐水、dmem培养基、培养基、dmem/f12培养基或rpmi160培养基中的至少一种。本发明的一些实施例中，所述冻存液还包含维生素c或叔丁基对苯二酚中的至少一种，所述维生素c的含量为0～5mm，所述叔丁基对苯二酚的含量为0～5μm。一些具体实施例中，所述维生素c的含量为0mm，1mm，2mm，3mm，4mm或5mm中的任意一种。一些具体实施例中，所述叔丁基对苯二酚的含量为0μm，1μm，2μm，3μm，4μm或5μm中的任意一种。本发明实施例提供了一种间充质干细胞的制备方法，请参阅图2，具有以下步骤：s21：采用所述冻存复苏方法获得复苏组织片，将所述复苏组织片剪碎，得到组织碎块，所述组织碎块的体积大小为2～3mm3；s22：将所述组织碎块用清洗液清洗，所述清洗液为含有双抗的磷酸盐缓冲液；s23：向所述组织碎块中加入细胞培养基，在二氧化碳培养箱中培养15～20天后，利用酶或所述细胞培养基进行消化处理。s24：收集细胞，得到间充质干细胞。在所述步骤s23中，将所述组织碎块用胶原酶进行消化处理，将消化后的组织碎块过滤，收集过滤液离心处理得到细胞混合沉淀，将所述细胞混合沉淀用所述细胞培养基进行重悬，得到细胞混合悬液，将所述细胞混合悬液接种到培养皿中培养。本发明的一些实施例中，向所述离心管中加入所述胶原酶后，将所述离心管在10～20r/min的振动频率下振动15～25小时。本发明的一些实施例中，所述双抗的体积占所述清洗液体积的百分比为1％～3％。一些具体实施例中，所述双抗的体积占所述清洗液的体积百分比为1％，1.5％，2.0％，2.5％或3.0％中的任意一种。本发明的一些实施例中，所述细胞培养基由胎牛血清、双抗、l-丙胺酰-谷氨酰胺及mem培养基组成，所述胎牛血清的体积占所述细胞培养基体积的百分比为10％～25％，所述双抗的体积占所述细胞培养基体积的百分比为0.5％～2％，所述l-丙胺酰-谷氨酰胺的体积占所述细胞培养基体积的百分比为0.5％～2％，余量为mem培养基。一些具体实施例中，所述胎牛血清的体积占所述细胞培养基体积的百分比为10％，12％，15％，18％，20％，22％或25％中的任意一种。一些具体实施例中，所述双抗的体积占所述细胞培养基体积的百分比为0.5％，0.8％，1.0％，1.2％，1.4％，1.6％，1.8％或2.0％中的任意一种。一些具体实施例中，所述l-丙胺酰-谷氨酰胺的体积占所述细胞培养基体积的百分比为0.5％，0.8％，1.0％，1.2％，1.4％，1.6％，1.8％或2.0％中的任意一种。以下结合具体的实施例对本发明加以详细描述。实施例1本实施例提供了脐带组织的冻存复苏方法和间充质干细胞的制备方法，包含：冻存液1的配制，脐带组织的冻存复苏方法1，以及间充质干细胞的制备方法1。所述冻存液1的配制方法：向20ml磷酸盐缓冲液中加入20mmol蔗糖，摇晃使所述蔗糖溶解完全，然后加入10ml二甲基亚砜，混合均匀后，用所述磷酸盐缓冲液定容至100ml，最后用微孔过滤器过滤得到冻存液1，所述微孔过滤器中的滤膜的平均孔径为0.22μm。所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：向10mldpbs溶液中加入90ml无菌水，混合均匀。所述冻存复苏方法1，具有如下步骤：s11：将脐带组织剪切为若干组织片a，然后用含有所述双抗的所述磷酸盐缓冲液对所述组织片a进行洗涤处理，得到组织片a，其中所述组织片a的长度为2～4cm，所述组织片的宽度为2～6cm，所述组织片a的厚度为0.1～5mm；具体的,将脐带放在10cm无菌平皿中，用手术刀将其剪切为若干长度为2.5～3.5cm的脐带组织段，然后用手术刀把所述脐带组织段纵向剖开，得到若干所述组织片a，其中所述组织片a的长度为2～4cm，所述组织片a的宽度为2～6cm，所述组织片a的厚度为0.1～5mm。然后用含有双抗的磷酸盐缓冲液冲洗所述组织片a3～4遍，洗至所述组织片a无明显血液残留，小心剔除所述组织片a中的2条脐动脉和1条脐静脉，再用所述含有双抗的磷酸盐缓冲液冲洗所述组织片3～4遍，以完成所述洗涤处理，得到所述组织片a，所述双抗的体积占所述磷酸盐缓冲液体积的百分比为2％。s12：将所述组织片a和冻存液加入到冻存容器中，然后将所述冻存容器置于2～6℃温度下冷藏0.5～1小时后，转移到-25～-15℃温度下冷冻1～2小时，再转移到-85℃～-75℃温度下进行冻存处理；具体的，将所述组织片a转移至10ml冻存管中，向所述冻存管中加入5.5ml所述冻存液1，将所述冻存管置于4℃的冰箱中放置40min后，转移到-20℃温度下放置80min；最后再转移到-80℃低温冰箱中冻存7天，以进行所述冻存处理。步骤s13：在35～39℃下对装有所述组织片a和所述冻存液的所述冻存容器进行复苏处理，得到复苏组织片1；具体的，从-80℃低温冰箱中取出所述冻存管后，将所述冻存管快速放入37℃水浴箱中进行所述复苏处理，所述复苏处理的时间为5～10分钟，得到所述复苏组织片1。所述间充质干细胞的制备方法1，具有以下步骤：s21：采用所述冻存复苏方法1获得复苏组织片1，将所述复苏组织片1剪碎，得到组织碎块，所述组织碎块的体积大小为2～3mm3。具体的，取所述复苏组织片1，用磷酸盐缓冲液重洗所述复苏组织片1，然后将所述复苏组织片1切成所述组织碎块，所述组织碎块的体积大小为2～3mm3。s22：将所述组织碎块用所述含有双抗的磷酸盐缓冲液涤洗。s23：向所述组织碎块中加入细胞培养基，在二氧化碳培养箱中培养15～20天后，利用酶或所述细胞培养基进行消化处理。具体的，称量所述组织碎块的重量，然后将所述组织碎片以2mm间隔均匀铺到100mm细胞培养皿中，向所述培养皿中加入所述细胞培养基；然后将所述培养皿放置在二氧化碳培养箱中培养3天后，将所述培养皿中的所述细胞培养基更换为新鲜的所述细胞培养基，之后更换频率为每两天更换一次；所述组织碎块在所述二氧化碳培养箱中培养15天后，去除所述培养皿中的上清液，向所述培养皿中加入2ml的所述磷酸盐缓冲液清洗细胞，然向所述培养皿中加入1ml胰酶消化液，4分钟后再向所述培养皿中加入3ml所述细胞培养基，以完成所述消化处理。其中，所述细胞培养基的配制方法为：向78ml的mem培养基中依次加入20ml胎牛血清、1ml双抗、1mll-丙胺酰-谷氨酰胺，混合均匀以使上述物质溶解完全，得到所述细胞培养基；s24：收集细胞，得到间充质干细胞1。具体的，吹打所述培养皿得到细胞悬液，将所述细胞悬液加入到15ml的离心管中，将所述离心管放入离心机，在离心力为1500r/min的条件下离心5分钟，以收集所述细胞，获得间充质干细胞1。实施例2本实施例提供了脐带组织的冻存复苏方法和间充质干细胞的制备方法2。所述脐带组织的冻存复苏方法参照实施例1中所述的脐带组织冻存复苏方法1。所述间充质干细胞的制备方法2与所述间充质干细胞制备方法1的区别在于：所述步骤s23中，利用胶原酶iv对所述组织碎块进行所述消化处理后，将消化后的组织碎块过滤，收集过滤液离心处理得到细胞混合沉淀，将所述细胞混合沉淀用所述细胞培养基进行重悬，得到细胞混合悬液，将所述细胞混合悬液接种到培养皿中培养。具体的，将所述组织碎块转移至15ml的第一离心管中，向所述第一离心管中加入质量浓度为1mg/ml的胶原酶iv，所述胶原酶iv的体积为所述组织碎块体积的2倍，然后将所述第一离心管置于转速为15r/min的摇床上进行20小时的所述消化处理，所述消化处理的温度为37℃；将消化后的所述组织碎块转移到50ml的第二离心管中，向所述第二离心管中加入所述磷酸盐缓冲液并混合均匀，所述磷酸盐缓冲液的体积为所述胶原酶iv体积的4倍，用纱布对所述第二离心管中的混合物进行过滤，收集过滤液，将所述过滤液以2000r/min的离心力离心20分钟，得到细胞混合沉淀；用1ml细胞培养基对所述细胞混合沉淀进行重悬，得到细胞混合悬液；将所述细胞混合悬液接种到直径为60mm细胞培养皿中，将所述培养皿放入二氧化碳培养箱中进行所述培养。实施例3参照所述冻存液1的配制方法以及所述间充质干细胞的制备方法2制备间充质干细胞3，与所述冻存液1的配制方法的不同之处在于将加入20mmol蔗糖替换为加入20mmol海藻糖，得到冻存液2。实施例4参照所述冻存液1的配制方法以及所述间充质干细胞的制备方法2制备间充质干细胞4，与所述冻存液1的的配制方法的不同之处在于将加入20mmol蔗糖替换为加入20mmol所述蔗糖及10mmol葡萄糖，得到冻存液3。对比例1新鲜脐带组织制备间充质干细胞的方法，包括如下步骤：参照实施例1中所述步骤s11的方法获得组织片a；然后参照实施例2中所述间充质干细胞的制备方法2制备间充质干细胞a；与所述间充质干细胞的制备方法2的不同之处在于，将取复苏组织碎片替换为取所述组织片a。对比例2参照所述冻存液1的配制方法以及所述间充质干细胞的制备方法2制备间充质干细胞b，与所述冻存液1的配制方法的不同之处在于将加入20mmol蔗糖替换为加入10ml人血清白蛋白，得到对比液2。实施例2～4及对比例1～2制备得到的间充质干细胞2～4及间充质干细胞a～b，用1ml所述细胞培养基重悬细胞沉淀，得到间充质干细胞的悬液；对所述间充质干细胞悬液中的细胞进行台盼蓝染色，用上海睿钰生物科技有限公司生产的型号为countstaric1000的自动细胞计数仪计算所述间充质干细胞的活细胞总数量，根据所述活细胞总数量和所述组织碎块的重量计算细胞活率和单位活细胞数。结果如表1所示，由表1可知，本发明实施例所述脐带组织冻存复苏方法能够有效减小脐带组织冻存过程对脐带间充质干细胞的损伤，有效提高细胞活率，保持单位活细胞的数量。所述表1中示出的是实施例1～3及对比例1～2制备得到的间充质干细胞2～4及间充质干细胞a～b的活细胞总数量、细胞活率、组织重量及单位活细胞数量，其中，所述组织重量是指实施例中所述组织碎块的重量。细胞活率＝活细胞总数/细胞总数×100％；单位活细胞数＝总的活细胞数/组织重量×100％。表1实施例5参照所述冻存液1的配制方法以及所述间充质干细胞的制备方法1制备间充质干细胞5，与所述冻存液1的的配制方法的不同之处在于将加入20mmol蔗糖替换为加入20mmol海藻糖，得到冻存液5。实施例6参照所述冻存液1的配制方法以及所述间充质干细胞的制备方法1制备间充质干细胞6，本实施例与所述冻存液1的配制方法的不同之处有两处，其一为将加入20mmol蔗糖替换为加入20mmol所述蔗糖及10mmol葡萄糖；其二在于将所述磷酸盐缓冲液替换为0.9％的生理盐水，得到细胞冻存液6。对比例3新鲜脐带组织制备间充质干细胞，具体如下步骤：参照实施例1中所述步骤s11的方法获得组织片a；然后参照实施例1中所述脐带间充质干细胞的制备方法1制备间充质干细胞c；与所述间充质干细胞的制备方法1的不同之处在于，将取复苏组织碎片1替换为取所述组织片a。实施例1、实施例5、实施例6及对比例3制备得到的间充质干细胞1、间充质干细胞5、间充质干细胞6及间充质干细胞c，用1ml所述细胞培养基重悬细胞沉淀，得到间充质干细胞悬液；对所述间充质干细胞悬液中的细胞进行台盼蓝染色，用所述自动细胞计数仪计算所述间充质干细胞的活细胞总数量，根据所述活细胞总数量和所述组织碎块的重量计算细胞活率和单位活细胞数。结果如表2所示，由表2可知，本发明实施例所述脐带组织冻存复苏方法能够有效减小脐带组织冻存过程对脐带间充质干细胞的损伤，有效提高细胞活率，保持单位活细胞的数量。所述表2中示出的是实施例1、实施例5、实施例6及对比例3制备得到的间充质干细胞1、间充质干细胞5、间充质干细胞6及间充质干细胞c的活细胞总数量、细胞活率、组织重量及单位活细胞数量，其中，所述组织重量是指实施例1中所述组织碎块的重量。细胞活率＝活细胞总数/细胞总数×100％；单位活细胞数＝活细胞总数/组织重量×100％。表2实施例7参照实施例1中所述冻存液1的配制方法、所述冻存复苏方法1以及所述间充质干细胞的制备方法1制备间充质干细胞7，不同之处在于所述冻存液1的配制步骤中，将加入10ml二甲基亚砜替换为加入7.5ml二甲基亚砜，得到细胞冻存液7。实施例8参照实施例1中所述冻存液1的配制方法、所述冻存复苏方法1以及所述间充质干细胞的制备方法1制备间充质干细胞8，不同之处在于所述冻存液1的配制步骤中，将加入10ml二甲基亚砜替换为加入5ml二甲基亚砜，得到细胞冻存液8。实施例9参照实施例1中所述冻存液1的配制方法、所述冻存复苏方法1以及所述间充质干细胞的制备方法1制备间充质干细胞9，不同之处在于所述冻存液1的配制步骤中，将加入10ml二甲基亚砜替换为加入2.5ml二甲基亚砜，得到细胞冻存液9。对比例3新鲜脐带组织制备间充质干细胞，具体如下步骤：参照实施例1中所述步骤s11的方法获得组织片a；然后参照实施例1中所述脐带间充质干细胞的制备方法1制备间充质干细胞c；与所述间充质干细胞的制备方法1的不同之处在于，将取复苏组织碎片1替换为取所述组织片a。实施例1、实施例7～9及对比例3制备得到的间充质干细胞1、间充质干细胞7～9及间充质干细胞c，用1ml所述细胞培养基重悬细胞沉淀，得到间充质干细胞悬液；对所述间充质干细胞悬液中的细胞进行台盼蓝染色，用所述自动细胞计数仪计算所述间充质干细胞的活细胞总数量，根据所述活细胞总数量和所述碎块组织的重量计算细胞活率和单位活细胞数。结果如表3所示，由表3可知，本发明实施例所述冻存液能够有效减少冻存复苏过程中对所述组织的损伤程度，保持组织中细胞的活性。表3中统计的是实施例1、实施例7～9及对比例3制备得到的间充质干细胞1、间充质干细胞7～9及间充质干细胞c的活细胞总数量、细胞活率、组织重量及单位活细胞数量，其中，所述组织重量是指实施例中所述组织碎块的重量。细胞活率＝活细胞总数/细胞总数×100％；单位活细胞数＝总的活细胞数/组织重量×100％。表3本发明一些实施例中，对通过所述冻存复苏方法1得到的所述复苏组织片1及通过所述实施例1中的所述步骤s11获得的所述组织片a进行了力学性能测试，使用拉压力试验机在拉伸速率为10mm/min的条件下进行力学性能测试，所述拉压力试验机为上海恒驭仪器有限公司生产的型号为hy-940fs的电脑式拉压力试验机。表4中统计了所述复苏组织片1和所述组织片a的拉伸强度和能够承受的最大受力值。由表4可知，利用本发明实施例所述冻存复苏方法得到的复苏组织片与新鲜的组织片的力学性能差异很小，表明利用本发明实施例所述冻存复苏方法得到的复苏组织片有很好的力学性能，能够作为生物补片来使用，满足关节损伤、跟腱损伤等运动医学领域和糖尿病足等慢性创伤领域临床治疗中对大块片状组织的需求。表4样品最大受力值(n)拉伸强度(mpa)组织片a9.3650.276复苏组织片19.1600.382以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。上面对本发明的各种实施方式的描述以描述的目的提供给本领域技术人员。其不旨在是穷举的、或者不旨在将本发明限制于单个公开的实施方式。如上所述，本发明的各种替代和变化对于上述技术所属领域技术人员而言将是显而易见的。因此，虽然已经具体讨论了一些另选的实施方式，但是其它实施方式将是显而易见的，或者本领域技术人员相对容易得出。本发明旨在包括在此已经讨论过的本发明的所有替代、修改、和变化，以及落在上述申请的精神和范围内的其它实施方式。虽然通过实施方式描绘了本发明，本领域普通技术人员知道，本发明有许多变形和变化而不脱离本发明的精神，希望所附的权利要求包括这些变形和变化而不脱离本发明的精神。当前第1页12