本发明涉及澳洲坚果栽培
技术领域：
，具体涉及一种澳洲坚果不定芽诱导的方法。
背景技术：
：澳洲坚果(macadamiaternifoliaf.muell)是一种原产于澳洲的树生坚果，属于山龙眼科澳洲坚果属，又名夏威夷果、昆兰士果。因其果仁富含蛋白质、维生素和不饱和脂肪酸等，享有“干果之王”的美誉。澳洲坚果作为一种常绿乔木，其生态效益、经济效益具佳。目前，组织培养快速繁殖技术已在木本果树中广泛应用。在澳洲坚果快速繁育方面，研究者利用澳洲坚果的茎段进行组织培养，如专利号201510868889.x公开了一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，包括：从澳洲坚果成年树上截取4cm长含有芽的茎段为外植体，将外植体进行消毒处理；将得到的外植体进行诱导培养20-24天，温度为23-25℃，光照强度为2000-2200lux，每天光照13-15h；将培养出的新长腋芽苗在无菌条件下切成只带一个腋芽的茎段，接入生根培养基在温度为25-27℃培养，依次包括三个阶段：第一阶段，置于2200-2400lux每天光照14-16h培养12-14天；第二阶段，置于黑暗下培养8-10天；第三阶段，置于2800-3000lux每天光照18h培养直至生根；但其操作步骤繁琐、粪肥提取液成分复杂。又如专利号201710038704.1公开了一种澳洲坚果组培扩繁方法，通过对澳洲坚果当年生嫩茎处理、消毒，分别置于启动培养基、增殖培养基以及生根培养基中进行组培，以达到快速扩繁的目的；但其消毒处理时间较长。再如文献《澳洲坚果的组织培养研究_肖再云》公开了取haes800接穗嫩芽,切成带腋芽或顶芽的茎段，先将将材料在70％乙醇中浸15s后，转入0.1％hgcl2中浸8min，然后用无菌水冲洗5次，将haes800的茎段在(1)号茎段培养基中培养30d后,转入(2)号茎段培养基继续培养,至25d时,愈伤组织增殖及诱导畸胚培养基25～30d转1次,畸胚增殖培养30d转1次,畸胚诱芽培养45～60d转1次,芽增殖及伸长培养30～45d转1次,诱根培养60d，同时还公开了培养基配方；但其周期长、步骤繁杂。因此，周期长、步骤繁杂、操作困难、病害率、污染率高是目前澳洲坚果快速繁育亟待克服的技术难题及研究热点。技术实现要素：本发明为解决上述技术问题，提供了一种澳洲坚果不定芽诱导的方法。具体是通过以下技术方案来实现的：一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为20-30℃，水培时间≥15h；2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经tween-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。上述方法，步骤1)中水培时间为24h，培养温度为25℃。上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.3-0.8h，tween-20浸泡2-5min，酒精消毒时间15-45s，0.1％升汞浸泡时间8-12min，无菌水冲洗3次；优选的，步骤2)中水冲洗时间0.5h，tween-20浸泡3min，酒精消毒时间30s，0.1％升汞浸泡时间10min，无菌水冲洗3次。所述tween-20的质量浓度为0.1％。所述tween-20经120-124℃高压灭菌处理后备用。上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10～15d；不定芽诱导培养基为1/2ms+ga3(1.0-2.0)mg/l+6-ba(1.0-3.0)mg/l+naa(0.005-0.05)mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8-6.0；优选地，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10～15d；不定芽诱导培养基为1/2ms+ga31.5mg/l+6-ba2.0mg/l+naa0.005mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8。上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2ms+ga3(1.0-2.0)mg/l+6-ba(1.0-3.0)mg/l+naa(0.005-0.05)mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8-6.0；优选地，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2ms+ga31.5mg/l+6-ba1.0mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8。上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73％的无菌培养室中光照培养13-16h，光照强度1800-2000lux；优选地，无菌培养室的温度为26℃，相对湿度70％，光照培养16h，光照强度2000lux。上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73％的无菌培养室中光照培养15-20d，光照强度1800-2000lux；优选地，无菌培养室的温度为26℃，相对湿度70％，光照培养16h，光照强度2000lux。有益效果：(1)澳洲坚果在生长萌芽期时茎段具有幼年态特性，生长旺盛且带菌较少，再生芽诱导率较高，组织不容易坏死。(2)tween-20是一种亲水性强的非离子型去污剂，促进消毒液接触表面组织，吸附外植体内部的内生菌；本发明结合tween-20，对消毒剂处理的时间和浓度进行严格的筛选控制，通过tween-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗的组合消毒方式，将污染率控制在5％以下，且不影响不定芽的诱导和增殖，克服了消毒剂对不定芽诱导和增殖的不良影响。(3)萘乙酸(naa)作为一种植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根的作用；本发明在培养基中添加低浓度的naa后，不定芽形成的时间不仅缩短了7天，还确保了芽粗壮。采用本发明，外植体污染率为3％～5％，不定芽诱导率为97.5％。与现有技术相比，本发明具有如下优点：1.结合吐温20、酒精和升汞混合使用，使得消毒彻底，污染率降低；2.易获得无菌外植体；3.能够在短期内获得再生芽。本发明是在离体条件下进行澳洲坚果不定芽的诱导，不仅简化了消毒步骤，还获得了健壮、无菌的不定芽。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。实施例1一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为25℃，水培时间为24h；2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经tween-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.5h，tween-20浸泡3min，酒精消毒时间30s，0.1％升汞浸泡时间10min，无菌水冲洗3次，无菌水每次冲洗时间为2min；所述tween-20的质量浓度为0.1％，且经121℃高压灭菌30min后备用；上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10～15d；不定芽诱导培养基为1/2ms+ga31.5mg/l+6-ba2.0mg/l+naa0.005mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8；上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2ms+ga31.5mg/l+6-ba1.0mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8；上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为26℃、相对湿度70％的无菌培养室中光照培养16h，光照强度2000lux；上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为26℃、相对湿度70％的无菌培养室中光照培养16d，光照强度2000lux。实施例2一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为30℃，水培时间为15h；2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经tween-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.6h，tween-20浸泡4min，酒精消毒时间35s，0.1％升汞浸泡时间12min，无菌水冲洗3次；所述tween-20的质量浓度为0.1％，且经121℃高压灭菌30min后备用；上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10～15d；不定芽诱导培养基为1/2ms+ga31.5mg/l+6-ba1.0mg/l+naa0.007mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8-6.0；上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2ms+ga31.7mg/l+6-ba2.6mg/l+naa0.01mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8-6.0；上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为26℃、相对湿度为67％的无菌培养室中光照培养15h，光照强度1900lux；上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为26℃、相对湿度为67％的无菌培养室中光照培养20d，光照强度1900lux。实施例3一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为20℃，水培时间为15h；2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经tween-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.3h，tween-20浸泡2min，酒精消毒时间15s，0.1％升汞浸泡时间8min，无菌水冲洗3次；所述tween-20的质量浓度为0.1％，且经121℃高压灭菌30min后备用；上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10d；不定芽诱导培养基为1/2ms+ga31.0mg/l+6-ba1.0mg/l+naa0.005mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8；上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2ms+ga31.0mg/l+6-ba1.0mg/l+naa0.005mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8；上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为25℃、相对湿度为67％的无菌培养室中光照培养13h，光照强度1800lux；上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为25℃、相对湿度为67％的无菌培养室中光照培养15d，光照强度1800lux。实施例4一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为30℃，水培时间为24h；2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经tween-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.8h，tween-20浸泡5min，酒精消毒时间45s，0.1％升汞浸泡时间12min，无菌水冲洗3次；所述tween-20的质量浓度为0.1％，且经121℃高压灭菌30min后备用；上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为15d；不定芽诱导培养基为1/2ms+ga32.0mg/l+6-ba3.0mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8-6.0；上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2ms+ga32.0mg/l+6-ba3.0mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l，ph5.8-6.0；上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为27℃、相对湿度为73％的无菌培养室中光照培养16h，光照强度2000lux。上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为27℃、相对湿度为73％的无菌培养室中光照培养16d，光照强度2000lux。试验例1：嫩枝水培工艺筛选选取澳洲坚果品种h2为供试材料，采取澳洲坚果嫩枝带回后放在自来水中分别培养12h，24h和48h，以未处理的嫩枝为对照；其他步骤同实施例1，观察并记录不定芽的诱导情况及不定芽的生长状况，统计不定芽的出芽率和污染率，结果如表1所示：表1出芽率/％污染率/％12h97.33.724h98.73.048h95.82.9试验例2：外植体消毒工艺筛选1.1工艺模式筛选，设置多种灭菌方法具体为：方法1：实施例1方法2：75％酒精30s、0.1％升汞10min、无菌水冲洗5次方法3：1％洁儿灭消毒液10min、75％酒精30s、0.1％升汞10min、无菌水冲洗5次方法4：1％84消毒液+75％酒精30s、0.1％升汞12min、无菌水冲洗5次方法5：0.1％吐温20(未灭菌)、75％酒精30s、0.1％升汞8min、无菌水冲洗5次方法6：实施例1中吐温20替换为吐温40，其他条件相同将方法1-6处理后的外植体表面水分吸干，接种在实施例1的诱导培养基上，培养方式同实施例1；每组接种30个茎段，3次重复，30d统计污染率、出芽率、每个外植体产生的平均芽苗数、芽苗的平均长度，结果如表2所示：表21.2工艺参数筛选：利用0.1％吐温20、75％酒精、0.1％升汞、无菌水冲洗的模式进行灭菌处理，其中，0.1％tween-20浸泡时间设1min、3min和5min三个水平，酒精消毒时间设15、30和45s三个水平，升汞消毒时间设定为8、10和12min三个水平，完全组合设计，共27个处理，消毒完成后，用无菌水冲洗3次。将外植体表面水分吸干，接种在诱导培养基上。每处理接种30个茎段，3次重复，30d统计污染率、成活率及出芽率，筛选出最佳工艺为：tween-20浸泡3min，酒精消毒时间30s，0.1％升汞浸泡时间10min。试验例3诱导培养基筛选：采用实施例1的水培、消毒方式处理嫩枝后，接种在下述培养基上，每组处理接种30个茎段，3次重复，观察并记录不定芽的诱导情况及不定芽的生长状况，统计不定芽的出芽率、每个外植体产生的平均芽苗数、芽苗的平均长度，结果如表3所示：诱导培养基1：1/2ms+ga31.5mg/l+6-ba2.0mg/l+naa0.005mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l诱导培养基2：1/2ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l诱导培养基3:1/2ms+6-ba2.0mg/l+iba1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l诱导培养基4：1/2ms+6-ba0.3mg/l+ga30.3mg/l+维生素b10.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l诱导培养基5：1/2ms+ga31.5mg/l+naa0.005mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l表3试验例4增殖培养基的筛选：采用实施例1的水培、消毒、诱导培养方式处理后，将初代培养诱导出来的不定芽切割后，接种到下述不定芽增殖培养基上，每组处理接种30个外植体，3次重复，30d转瓶1次，观察并记录不定芽的生长状态，60d统计平均增殖数、差异性，结果如表4所示：增殖培养基1：1/2ms+ga31.5mg/l+6-ba1.0mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l增殖培养基2：1/2ms+iba1.0mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l增殖培养基3：1/2ms+6-ba0.3mg/l+peg0.3mg/l+维生素b10.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l增殖培养基4：1/2ms+ga31.5mg/l+6-ba1.0mg/l+peg0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8.0g/l表4试验例5取haes800接穗嫩芽,切成带腋芽或顶芽的茎段作为外植体，分别按照实施例1-4的方法进行培养，统计愈伤组织分化的畸胚率及芽的分化率，结果如表5所示：表5实施例1实施例2实施例3实施例4畸胚率(％)75.372.471.875.5分化率(芽/块·月)7656当前第1页12