一种圆锥铁线莲的组织培养方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及圆锥铁线莲的组织培养方法。

背景技术：

铁线莲属(clematisl.)为毛茛科(ranunculaceae)，是一种观赏价值高、抗逆性强的藤本植物，全球约有230-355种，广泛分布于全球各大洲(南极洲除外)，每种植物的性状特征、用途不尽相同。铁线莲属植物大多数为多年生木质或草质藤本，少数为直立灌木或草本。各种铁线莲花期不同，四季均有花开，多数为6-8月。该属植物花型新颖独特，颜色丰富，花期较长，具有较强的耐寒、耐贫瘠性。因其观赏价值高，用途十分广泛。由于铁线莲属植物的攀岩性较好，可以作为垂直绿化材料，应用于围墙、栅栏、棚架等地方。同时，常种植于假山或岩石园中，大部分植物园公园和家庭花园都能见到它们绚丽多彩的身影。此外，铁线莲属多种植物具有很高的药用价值，如威灵仙、圆锥铁线莲、川木通、女萎等。中国原产的铁线莲属植物大约有85种具有药用价值。

圆锥铁线莲(clematisternifloradc.)为木质藤本，小叶片狭卵形至宽卵形，有时卵状披针形，圆锥花序，花小而繁，开花时节花繁叶茂，在园林上有较高的应用价值，且为广布种，在其开发利用方面有较大优势，亦是进行铁线莲属植物育种的好材料。另外，圆锥铁线莲有很高的药用价值，对用咽喉炎、扁桃体炎、肺瘤及风湿和类风湿性关节义等等疾病有较好的治疗作用。圆锥铁线莲地上部分(茎叶部分)在浙江北部地区广泛使用，主要用于呼巧系统和泌尿系统炎症及肿瘤的治疗。

目前，关于圆锥铁线莲的研究多集中于药学研究，对栽培繁殖、园林应用方面研究几乎未见报道。圆锥铁线莲不仅药用价值高且花色花型独特，应用前景十分广泛。由于圆锥铁线莲目前全是野生种，因药用价值显著，观赏价值高，狂采滥挖现象严重，分布范围逐渐减小，不利于资源的保护。铁线莲植物存在种子萌发时间长且萌发率低的问题，利用组织培养，加快繁殖速度势在必行。

目前，没有针对圆锥铁线莲这种植物的具体的组培方法，而圆锥铁线莲作为花色花型独特可爱的藤本植物，园林中应用广泛。在药用方面有着很高的价值，对用咽喉炎、扁桃体炎、肺瘤及风湿和类风湿性关节义等等疾病有较好的治疗作用。但是目前，圆锥铁线莲采取常规繁殖方法，无法满足市场需要，因而需要采取适应方法的组培培养。

专利申请号为201010193123的发明专利涉及一种组织培养总统铁线莲的方法,摘取铁线莲‘总统’嫩芽为原材料,经过无菌处理、嫩芽的分化和增殖、不定芽的壮苗培养、根系的生根培养、植株炼苗与移栽等步骤后,获得铁线莲‘总统’植株。与现有技术相比，该发明通过组培技术,提高苗木繁殖速度和苗的整齐度,且更好地保持原有的母本性状,实现育苗工厂化,但是该发明提供的方法并不适合对圆锥铁线莲进行组织培养。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种圆锥铁线莲的组织培养方法，对圆锥铁线莲的组织快繁开展研究，了解外植体、培养基及其他条件对其组培影响，揭示铁线莲离体培养和植株再生的规律，探索高频率再生植株的形态发生途径和离体培养条件，同时建立有效组织培养体系，为圆锥铁线莲的快速推广应用提供技术支持，充分体现其景观和经济价值。本发明提供的方法，诱导率较高，生根率达到63％，为圆锥铁线莲的大规模无性繁殖提供的良好的基础。

本发明提供一种圆锥铁线莲的组织培养方法，利用圆锥铁线莲的当年生枝条为外植体，具体包括以下步骤：

(1)取材；

(2)外植体的选择与灭菌；

(3)诱导培养：将消毒后的外植体接种到培养基中诱导培养；

(4)增殖培养：将无菌芽苗接种于添加增殖培养基中增殖培养；

(5)生根培养：将无菌芽苗切下后接种在生根培养基中；

(6)瓶苗移栽。

优选的是，所述步骤(1)中取材时间在春季4月份，选择天气晴朗的上午十点左右取材。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2)外植体的选择与灭菌包括以下步骤：

(2.1)采取具有优良性状，饱满而未萌发的腋芽当年生健壮幼枝枝条，保留茎段；

(2.2)去除外植体上的绒毛，用洗衣粉水浸泡后，在流水下冲洗；

(2.3)在无菌条件下，材料用酒精浸泡，再经升汞分别处理，然后用无菌水冲洗多次。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2.2)中用酒精脱脂棉轻轻擦洗去除外植体上的绒毛。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2.2)中用洗衣粉水浸泡15min后，在流水下冲洗1-2h。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2.3)中将材料放入灭菌过的三角瓶中，用75％酒精浸泡30s，再经0.1％升汞分别处理5min，然后用无菌水冲洗6～8次，每次2～3min。

上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中接种时每瓶接种两个茎段，每个处理10瓶，重复3次。

上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中诱导培养条件为：25℃光照下培养，以改良1/2ms，1/2ms，ms，wpm、b5为基本培养基，添加低浓度植物生产激素、蔗糖、琼脂培养基，ph5.8。

上述任一方案优选的是，所述蔗糖添加量为30g/l，琼脂培养基添加量为5.8g/l上

上述任一方案优选的是，所述低浓度植物生产激素包括6-ba和iba。

上述任一方案优选的是，所述6-ba浓度为0.6mg/l，iba浓度为0.15mg/l。

上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中将带芽茎段初代培养腋芽分化出的无菌芽苗接种于增殖培养基中，ph5.8，25℃光照下培养。

上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中增殖培养30天，增殖系数为4.16。

上述任一方案优选的是，所述步骤(4)增殖培养基为ms+kt+naa+sucrose。

上述任一方案优选的是，所述步骤(4)增殖培养基为ms+0.3mg/lkt+0.05mg/lnaa+30.0g/lsucrose。

上述任一方案优选的是，所述步骤(5)将具有1-2对新生叶片的无菌芽苗切下后接种在生根培养基中，25℃光照下培养30d。

上述任一方案优选的是，所述步骤(5)中接种时，每瓶1棵，每种培养基接种10个芽。

上述任一方案优选的是，所述步骤(5)生根培养基为ms+naa，ph5.8。

上述任一方案优选的是，所述步骤(5)生根培养基为1/2ms+0.05mg/lnaa，ph5.8。

上述任一方案优选的是，所述步骤(6)的具体操作为:将生根苗取出，洗净幼苗根系，移栽到基质中。

上述任一方案优选的是，所述基质采用以下配比原料制成，营养土：珍珠岩：蛭石＝1:1:2。

上述任一方案优选的是，所述步骤(6)移栽前要对基质进行消毒处理，基质要疏松通气。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明提供一种圆锥铁线莲的组织培养方法，以当年生枝条带芽茎段为外植体建立圆锥铁线莲再生体系，具体包括以下步骤：(1)取材时间：春季4月份左右，污染率仅为6.9％，出芽率达到了92.7％；(2)外植体的选择与灭菌：选用幼嫩茎段为外植体，表面灭菌以0.1％hgcl2，灭菌5min为宜，成活率可达80％；(3)诱导培养：培养基为ms+0.6mg/l6-ba+0.15mg/liba，30g/l蔗糖，5.8g/l琼脂，ph5.8；(4)增殖培养：腋芽增殖的较适培养基ms+0.3mg/lkt+0.05mg/lnaa+30.0g/lsucrose，增殖系数为4.16；(5)生根培养：适宜的生根培养基是1/2ms+0.05mg/lnaa，生根率达66％；(6)瓶苗移栽：瓶苗移栽春季最佳，经过5-7天的开瓶炼苗，以营养土：珍珠岩：蛭石＝1：1：2为基质，其移栽成活率达81.6％。本发明成功的建立圆锥铁线莲的组织快繁体系，可以快速繁殖大量幼苗，为圆锥铁线莲的大规模应用推广提供了基础。

附图说明

图1为采用本发明组织培养方法培养的的圆锥铁线莲的腋芽增殖实物图；

图2为采用本发明组织培养方法培养的的圆锥铁线莲的伸长生长实物图；

图3a为采用本发明组织培养方法培养的的圆锥铁线莲的生根植株实物图；

图3b为采用本发明组织培养方法培养的的圆锥铁线莲的生根植株实物图；

图4为采用本发明组织培养方法培养的的圆锥铁线莲的瓶苗移栽时采用的不同基质实物图；其中图4a为珍珠岩:蛭石1:2，图4b为珍珠岩蛭石1:3,图4c为珍珠岩蛭石1:5，图4d为营养土：珍珠岩：蛭石＝1:1:2，图4e为营养土:珍珠岩:泥炭土1:2:3。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

实施例1

本发明提供一种圆锥铁线莲的组织快速繁殖的方法，利用圆锥铁线莲的当年生枝条为外植体，依次进行以下步骤：

1)取材时间：分别在四月上旬，七月上旬、十月上旬，天气晴朗的上午，四月上旬的采样材料组中污染率只有6.9％，萌发率达到了92.7％。七月上旬污染率为52.5％，萌发率仅30.1％。十月上旬污染率为30.3％，萌发率仅20.5％。

2)外植体的选择与灭菌：采取具有优良性状，饱满而未萌发的腋芽当年生健壮幼枝枝条，除掉多余的叶片，只保留茎段，用酒精脱脂棉轻轻擦洗去除外植体上的绒毛，用洗衣粉水，洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质)浸泡15min后，在流水下冲洗1-2h。在无菌条件下，将材料放入灭菌过的三角瓶中，用75％酒精浸泡30s，再经0.1％升汞分别处理3min、5min、7min、10min，然后用无菌水冲洗6～8次，每次2～3min。每种接种30个，统计污染率％、玻璃化率％，枯死率％，发现灭菌3分钟，污染率％为44.2％，玻璃化率和枯死率为0％；灭菌5分钟，污染率为10.0％，玻璃化率为0％，枯死率为3.9％；灭菌7分钟，污染率为3.3％，玻璃化率为27.3％，枯死率为24.6％；灭菌10分钟，污染率为0.0％，玻璃化率为40.9％，枯死率为32.8％。综上，5分钟为比较合适的灭菌时间。

3)诱导培养：基本培养基的选择，以改良1/2ms，1/2ms，ms，wpm、b5为基本培养基，均附加+0.4mg/l6-ba+0.05mg/liba，来诱导圆锥铁线莲。将消毒后的外植体接种到培养基上，每瓶接种两个茎段，每个处理10瓶，重复3次。25℃光照下培养，进行单因子对比试验。20d后统计诱导的腋芽数，并计算诱导率。每种培养基附加30g/l蔗糖，5.8g/l琼脂，ph值5.8。圆锥铁线莲在ms培养基(附加低浓度的6-ba和iba)为最适合的培养基，第5天芽开始萌动，9天后开始抽出侧芽，幼芽生长较快。诱导率达80.0％，如图2所示。

4)增殖培养：将带芽茎段初代培养腋芽分化出的无菌芽苗接种于添加增殖培养基，以ms为基本培养基，分别选用kt、naa、蔗糖，进行l9(3⁴)正交试验如表1所示，试验均设3次重复。25℃光照下培养，增殖培养30天。

表1圆锥铁线莲正交设计试验结果

kt、naa和蔗糖组合均可促进圆锥铁线莲的增殖，但各处理间芽的增殖系数差异很大。增殖系数随kt、naa浓度的升高增殖系数逐渐下降，适宜的浓度分别为0.3mg/l、0.05mg/l，此时苗生长健壮，叶片翠绿，生长速度较快。当kt、naa的浓度为1.5mg/l、0.1mg/l时，增殖系数降为1.25，且苗黄绿色，瘦弱，长势差，渐趋死亡。可见高浓度kt或naa对试管苗的生长都有一定抑制作用，不利于不定芽的生长。ms+0.3mg/lkt+0.05mg/lna+30.0g/lsucrose，ph5.8为最合适的培养基，增殖系数最高为4.16。

5)生根培养：本试验以1/2ms、改良1/2ms、ms为基本培养基，均附加0.05mg/lnaa，如表2所示，用来选择适宜的圆锥铁线莲生根的基本培养基。每种培养基均附加30g/l蔗糖，7.0g/l琼脂，ph5.8。

表2不同生根基本培养基对铁线莲‘乌托邦’生根的影响

表2试验结果显示，1/2ms基本培养基的生根率最高，平均达到60％，根的数目最多，生根快，粗壮，移栽成活率高，而其它培养基的生根率低，且根细弱短小。通过有方差分析和多重比较可以看出，各处理间存在显著差异，因此1/2ms基本培养基为圆锥铁线莲适宜生根基本培养基。

将增殖苗，具有1-2对新生叶片的无菌芽苗切下后接种在生根培养基中，如表3所示，每瓶1棵，每种培养基接种10个芽，30d后统计生根率。

不同的生长素配比对铁线莲的生根培养基影响很大，如表3所示，以1/2ms为基本培养基，处理3生根较快生，根率达66％，根较多且粗壮，栽植成活率高，如图3a和图3b所示。铁线莲生根率随着naa浓度的升高先上升后下降，当naa的浓度达到0.3mg/l时，处理6的生根率最小，且根较纤细。其它浓度及其各类生长素的添加也均诱导了根的形成，但诱导率不高。

表3不同培养基对圆锥铁线莲生根的影响

同时方差分析结果表明，不同的生根培养基对圆锥铁线莲生根影响的差异具有显著性。因此，1/2ms+0.05mg/lnaa是适宜的生根培养基。

6)瓶苗移栽：圆锥铁线莲生根培养两个月后，挑选生长健壮、根系发达的生根苗，在自然环境下炼苗5～7d后，用0.1％的多菌灵蘸根处理，移植于已经消毒处理的基质中，期间喷洒1/10ms大量元素营养液和稀释1000倍的多菌灵，20d后统计试管苗移栽成活率。

移栽前要对基质进行消毒处理，基质要疏松通气，保湿性好。将生根苗取出，清水中轻轻漂洗粘附的培养基，洗净幼苗根系，移栽到不同基质中，基质实物图如图4所示，不同基质对圆锥铁线莲移苗成活率的影响，其中图4a为珍珠岩:蛭石1:2，图4b为珍珠岩蛭石1:3,图4c为珍珠岩蛭石1:5，图4d为营养土：珍珠岩：蛭石＝1:1:2，图4e为营养土:珍珠岩:泥炭土1:2:3，移栽后浇一次透水，注意光照的调节及保湿。一周以后，可逐步水肥常规管理，几种基质对移苗成活率的影晌如表4所示，营养土：珍珠岩：蛭石＝1:1:2的成活率较高，移苗成活率在80％以上。

表4几种基质对移苗成活率的影晌

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。