一种适于多种植物玻璃化试管苗逆转的方法与流程

本发明属于植物组培技术领域，涉及一种适于多种植物玻璃化试管苗逆转的方法。

背景技术：

青蒿即中药黄花蒿全草(artemisiaannual.)为菊科1a生药用植物。从青蒿中提取的青蒿素(artemisinin)是低毒高效的抗疟疾药，青蒿素的生物合成成为人们研究的热点。随着青蒿素应用研究的开展，人工种植青蒿在近几年中逐渐形成规模。在种植过程中，青蒿素含量差别很大，采用组培技术选育青蒿素含量高的株系是解决青蒿素含量参差不齐的有效手段之一。然而，在对青蒿进行组培繁育的过程中玻璃化现象非常严重，频率高达60％～80％。

掌叶覆盆子(rubuschingiihu)又称华东覆盆子、大号角公、牛奶母、树莓，蔷薇科悬钩子属浆果植物。掌叶覆盆子具有较高的药用价值，是一种传统中药材，近成熟干燥果实为常用中药，具有补肾、固精、缩尿之功效，用于肾虚遗尿、小便频数、阳痿早泄、遗精滑精等症的治疗。成熟果实是新型高营养的野生或半野生果品，富含氨基酸、维生素e、维生素c、维生素b、维生素pp、超氧化物歧化酶、矿质元素和挥发性等成分，可用于食疗和保健。因含有丰富的营养物质，作为第三代新兴水果也已得到广泛认可，进行人工栽培将产生可观的经济和社会效益。因此，进行掌叶覆盆子组织培养是加快繁育进程的有效途径，然而，在对掌叶覆盆子进行组培繁育的过程中玻璃化现象非常严重,频率高达80％以上，导致试管苗不能正常生根，阻碍了掌叶覆盆子推广进程。

薰衣草(lavandulaangustifoliamill.)是唇形科薰衣草属多年生半灌木，有强烈芳香气味，原产于地中海。薰衣草油是从薰衣草的全草经提炼得到的，具有安宁镇静、洁净心身、清热解毒、散淤消肿、驱风发汗之效，广泛应用于医药、食品、陶瓷、电子和日用化工等方面。新疆是薰衣草的种植基地,其种植面积占全国的95％以上，但目前生产上栽培的都是20世纪60年代育成的老品种，退化严重，薰衣草油质量严重下降，影响了其国际竞争力。为了促进薰衣草种植业的发展，追求低成本、高品质和高效益，开发新的繁育方式，引进新的优良品种，已成为当今薰衣草市场发展的热点问题。运用细胞工程手段，通过植物组织培养方法快速繁殖薰衣草，可以固定杂种优势，保持品种特异性。然后在薰衣草工厂化种苗生产过程中，试管苗玻璃化现象严重影响了苗木生产质量及工厂化苗木生产效率。

玻璃化现象是组培快繁生产中三大问题之一。对植物组织培养中玻璃化的原因和防止措施的研究受到广泛关注。已有很多研究通过调控组织培养条件减少试管苗玻璃化现象的发生，如在培养基中降低激素浓度，添加ca²⁺、聚乙烯醇和agno3等物质，在培养过程中控制光质和温度等措施来防治玻璃化苗，但是单独采取任何一种处理方式都不能克服试管苗的玻璃化现象。然而，每个组培研究中心，研究对象都不会是单一品种，一般是两种或两种以上的主研产品，而且每种植物的玻璃化原因和程度都不相同，需花费大量的时间和精力去探索每种植物的玻璃化防止方法，尤其是玻璃化程度高的苗，无法逆转，这样大大增加了投入的人力和物力，直接影响工厂化生产成本。

基于上述原因，有必要开展青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草组织培养中试管苗玻璃化的系统研究，为青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草品种选育和工厂化育苗提供保障,为植物组织培养过程中试管苗出现玻璃化现象的发生机理和防止措施的研究提供依据。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种适于多种植物玻璃化试管苗逆转的方法，以达到室内大规模繁殖种苗，为规模化发展及时提供多种植物大批量优质种苗。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述适于多种植物玻璃化试管苗逆转的方法包括如下步骤：

（1）外植体的选择：选择青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草玻璃化的试管苗进行培养，得培养后的玻璃化苗；

（2）制备培养基：玻璃化苗逆转培养基配方为无激素添加物的ms基本培养基，增殖培养基配方为ms+6ba0.6～2.0mg/l+kt0.2～0.5mg/l，生根壮苗培养基配方为ms+ccc（矮壮素）0.5～2.0mg/l+pp333（多效唑）0.5～2.0mg/l；配制好上述培养基后高压灭菌，在暗培养条件下放置10～60d或在超净工作台中鼓风吹1～6h备用；优选地，所述步骤（2）中设置对照培养基，所述对照培养基为ms+6ba1.0mg/l+kt0.5mg/l，配制好对照培养基后高压灭菌，在暗培养条件下放置3d或在超净工作台中分装好即用；

（3）玻璃化苗逆转培养：将步骤（1）培养后的玻璃化苗直接转入玻璃化苗逆转培养基上培养30～35d，玻璃化试管苗能逆转成功的达到70%以上，重新诱导出无玻璃化状态的新芽；对照培养基上的试管苗玻璃化程度加重，几乎100%呈水渍状或褐化，无法再恢复正常；

（4）增殖培养：将步骤（3）所得新芽分成小芽丛接种在增殖培养基上培养30d，获得大量新增殖的试管苗；获得大量新增殖的试管苗，增殖系数达到7以上；

（5）生根壮苗培养：将步骤（4）获得的试管苗茎段接种在生根培养基上培养18～22d，获得健壮生根苗（长出新芽，芽健壮，且长出3-7条新根）；

（6）移栽管理：将步骤（5）获得的健壮生根苗，炼苗3d以上，取出清洗根部培养基，随后将幼苗有盖的移栽盆中吗，成活达到90%以上。

其中，所述玻璃化苗逆转培养、增殖培养、生根壮苗培养、对照培养的条件为：接种后移到培养室培养，培养室温度为24～26℃，培养室相对湿度为30～50％，每天光照10～12小时，光照强度为1000～2000lx。

所述玻璃化苗逆转培养基、增殖培养基、生根壮苗培养、对照培养基中含有蔗糖和琼脂，所述蔗糖的质量百分比含量为3～5%，所述琼脂的质量百分比含量为0.75％。

优选地，步骤（1）选择青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草已玻璃化的试管苗为外植体进行培养，茎段切成1.0～2.0cm备用；

步骤（3）中每瓶培养基接种5～20个外植体进行培养；

步骤（4）中每瓶培养基接种5～20个外植体进行培养；

步骤（5）中每瓶培养基接种10～20个外植体进行培养；

步骤（6）将步骤（5）获得的健壮生根苗，打开瓶盖炼苗至少3d，取出清洗根部培养基，随后将幼苗有盖的移栽盆中，7-10d喷一次水，30d左右长出新根即已成活，成活达到90%以上。

本发明最优选的方案如下：

a、外植体的选择：选用青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草已玻璃化的试管苗为外植体进行培养。

b、培养基的处理方法：培养基配制好高压灭菌后，在暗培养条件下放置10-60d，优选20-40d；或在超净工作台中鼓风吹1-6h，优选4-6h。季节不同，放置或吹的最佳时间不同，重点是培养基表面水分全部干燥为宜。

c、玻璃化苗逆转培养：试管苗玻璃化程度越低，恢复时间越短，恢复率越高；玻璃化程度严重的试管苗能逆转成功比率在70%左右，部分苗褐化死亡；对照培养基上的试管苗玻璃化程度不断加重。

d、增殖培养：玻璃化逆转成功的试管苗，转入增殖培养基中培养，恢复正常的增殖功能，增殖系数达到7以上；对照试管苗能增殖，但是试管苗玻璃化继续严重，直到试管苗全部呈水渍状或褐化。

e、生根壮苗培养：将玻璃化逆转成功的试管苗茎段，转入到生根壮苗培养基上，培养30天左右，100％同步获得新芽和根。

f、培养条件：接种后移到培养室培养，培养室温度为24～26℃，培养室相对湿度为30～50％，每天光照10～12小时，光照强度为1000～2000lx。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的方法适用于青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草玻璃化试管苗逆转。

2、本发明的方法简单易操作，不需花费大量的时间和精力去探索每种植物的玻璃化防止的方法，仅需将培养基中的水分含量降低。

3、本发明将玻璃化试管苗处理方法简单化，能单独采取一种处理方式就能逆转多种植物试管苗玻璃化的现象，不需花费大量的时间和精力去探索各类激素浓度，ca²⁺、聚乙烯醇和agno3等物质,以及在培养过程中控制光质和温度等措施来防治玻璃化苗的方法。

4、本发明的方法有两种备选方案，一是配制的培养基量多不急用，在暗培养室长期放置，水分自然干燥，污染少，且培养基中添加成分不受长期放置的影响，一直能保持较好的培养效果；二是量少急用，在超净工作台吹干后即可使用。

5、外植体茎段接种在生根壮苗培养基上能同步产生芽和根，苗健壮；本发明将增殖与生根壮苗培养程序简化为一步完成。

附图说明

图1为青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草（从左至右）玻璃化苗的生长情况；

图2为青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草（从左至右）玻璃化苗逆转后的增殖情况。

具体实施方式

实施例1组织培养快速繁殖青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草

一、培养基配制和灭菌

玻璃化苗逆转培养基：ms+3%蔗糖+0.75％琼脂。

增殖培养基：ms+6ba1.0mg/l+kt0.5mg/l+3%蔗糖+0.75％琼脂。

生根壮苗培养基：ms+ccc(矮壮素）0.5mg/l+pp333（多效唑）1.5mg/l+3%蔗糖+0.75％琼脂。以上培养基121℃下，灭菌20分钟。

二、培养基的处理方法

培养基配制好高压灭菌后，在暗培养条件下放置10d、15d、20d、25d、35d、40d、45d、50d、55d、60d；或在超净工作台中鼓风吹1h、2h、3h、4h、5h、6h。对照为ms+6ba1.0mg/l+kt0.5mg/l+3%蔗糖+0.75％琼脂，在暗培养条件下放置3d或在超净工作台中分装好即用。增殖培养基，配制好高压灭菌后，在暗培养条件下放置3d或在超净工作台中分装好即用。在暗培养条件下放置10-60d，优选20-40d；或在超净工作台中鼓风吹1-6h，优选4-6h。具体情况如下：培养基放置时间根据季节调整，夏季室温高，培养基放置20d或吹4h最佳；春秋季室温适宜，放置30d或吹5h最佳；冬季室温低，放置40d或吹6h最佳,重点是培养基表面水分全部干燥为宜。

三、玻璃化苗逆转培养

取3-5丛青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草已玻璃化的试管苗，玻璃化苗生长情况如图1所示。外植体接种在玻璃化苗逆转培养基上，培养30天左右，在适宜培养基上，试管苗玻璃化程度低，培养10-15d恢复正常，恢复率达到100％；玻璃化程度严重的试管苗能恢复70％左右，部分苗呈水渍状或褐化死亡；对照培养基上的试管苗玻璃化程度不断加重。培养室温度为24～26℃，培养室相对湿度为30～50％，每天光照10～12小时，光照强度为1000～2000lx。

四、增殖培养

取上述90个株系进行继代繁殖，具体方法如下：将步骤三青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草获得的试管苗芽丛转入增殖培养基上，培养30天左右，在适宜水分的培养基上，100％无玻璃化苗再次出现，恢复增殖能力，增值系数在7以上；对照培养基上的试管苗玻璃化程度继续加重，频率达到100％。每隔25～30d继代一次，每瓶培养基接种5～20个外植体进行培养。增殖苗生长情况如图2所示；培养条件同步骤三。

五、生根壮苗培养

取上述90个株系进行生根壮苗培养，具体方法如下：将步骤四青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草获得的试管苗茎段切成1.0～2.0cm，转入生根壮苗培养基上，培养30天左右，100％同步获得芽和根；每隔25～30d继代一次，每瓶培养基接种10～20个外植体进行培养。

本发明所提供的玻璃化苗逆转方法，适合青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草玻璃化试管苗的逆转，不仅恢复率高，且稳定性高。增殖培养阶段，不仅恢复增殖能力，增殖率高，且能长期保持无玻璃化状态；生根壮苗培养阶段，创造出一步成苗的方法，不仅简化了健康种苗生产程序，而且生产成本低，提高了生产效率。

实施例2组织培养快速繁殖青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草

一、培养基配制和灭菌

玻璃化苗逆转培养基：ms+3%蔗糖+0.75％琼脂。

增殖培养基：ms+6ba1.5mg/l+kt0.2mg/l+3%蔗糖+0.75％琼脂。

生根壮苗培养基：ms+ccc(矮壮素）1.5mg/l+pp333（多效唑）0.5mg/l+3%蔗糖+0.75％琼脂。以上培养基121℃下，灭菌20分钟。

取组织培养快速繁殖青蒿、掌叶覆盆子、薰衣草已玻璃化的试管苗，基本操作方法同实施例1一致；效果与实施例1相差不大。