富含瑞鲍迪苷M的甜菊植物的制作方法

本发明涉及一种瑞鲍迪苷m的含量高的甜菊植物。

背景技术：

为了应对多样化的消费者需求，各种各样的饮料被开发销售。蔗糖等糖类是由于给予甜味等目的而极普通地向饮料中调配的成分，然而因过度摄取对健康造成的影响被指出，对于更低热量且来自于天然的甜味剂的需求逐渐提高。例如专利文献1中公开有含有维生素、高甜度甜味剂及甜味改善组合物的功能性甜味剂组合物。

瑞鲍迪苷(rebaudioside，以下也称“reb”)作为甜菊萃取物中所含的甜味成分被熟知。甜菊萃取物为从甜菊的叶萃取、提纯而得的物质。甜菊为以南美巴拉圭为产地的菊科多年生植物，学名称作steviarebaudianabertoni。由于甜菊含有具有砂糖的约300倍以上的甜味的成分，因此为了萃取该甜味成分作为天然甜味剂使用而被栽培。作为reb，报告有reba、rebb、rebc、rebd、rebe、rebm等各种各样的糖苷的存在(日本特表2012-504552)。在各种各样的reb中，例如reba被评价为具有高甜度和优质甜味的甜味剂而被广泛使用。关于其他的reb，也不断地明确其特有的甜味及附带的味道。

在这样的情况下，已知有分别以每干燥叶0.38重量％、3.28重量％而含有瑞鲍迪苷m及d的甜菊植物体(专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2009-517043号说明书

专利文献2：日本特表2016-515814号说明书

专利文献3：us2016/0057955a1

技术实现要素：

瑞鲍迪苷m被认为在甜菊醇糖苷中具有良好的味道，然而却无法从天然的甜菊植物体中多得，其入手成为问题。

本发明提供一种与野生型甜菊种相比以高含量含有瑞鲍迪苷m的瑞鲍迪苷m富含型非转基因甜菊植物体及该植物体的生产方法及筛选方法。

具体而言，本发明提供以下内容。

[1-1]一种甜菊植物体，为富含瑞鲍迪苷m的非转基因甜菊植物体，其特征在于，相对于叶中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m。

[1-2]根据[1-1]所述的甜菊植物体，其特征在于，相对于叶中所含的总甜菊醇糖苷量进一步含有9.5％以上的瑞鲍迪苷d。

[1-3]根据[1-1]或[1-2]所述的甜菊植物体，其特征在于，具有以下的(1)～(5)的至少1种的遗传性状，

(1)就与序列号35的44位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性，

(2)就与序列号37的40位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性，

(3)就与序列号39的41位相当的位置的碱基为c的等位基因而言为同型接合性，

(4)就与序列号42的55～72位相当的部分缺失的等位基因而言为同型接合性，

(5)就与序列号43的50位相当的位置的碱基为a的等位基因而言为同型接合性。

[1-4]根据[1-1]～[1-3]中任一项所述的甜菊植物体，其特征在于，就选自p01～p05中的至少一种的多态性标记而言为阳性。

[1-5]一种植物体的种子、组织、组织培养物或植物培养细胞，其特征在于，为[1-1]～[1-4]中任一项所述的植物体的种子、组织、组织培养物或植物培养细胞。

[1-6]根据[1-5]所述的植物体的种子、组织、组织培养物或植物培养细胞，其特征在于，为胚、分裂组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织。

[1-7]一种生产富含瑞鲍迪苷m的甜菊植物体的方法，其特征在于，包含使[1-1]～[1-4]中任一项所述的甜菊植物体与第2甜菊植物体杂交的工序，所述富含瑞鲍迪苷m的甜菊植物体相对于叶中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m。

[1-8]根据[1-7]所述的方法，其特征在于，第2植物体为[1-1]～[1-4]中任一项所述的甜菊植物体。

[1-9]一种萃取物，其特征在于，为[1-1]～[1-4]中任一项所述的甜菊植物体的萃取物或[1-5]所述的植物体的种子、组织、组织培养物或细胞的萃取物。

[1-10]一种饮食品、甜味组合物、香料或医药品，其特征在于，含有[1-9]所述的萃取物。

[1-11]一种含有瑞鲍迪苷m的萃取物的制造方法，其特征在于，包含由[1-1]～[1-4]中任一项所述的植物体、[1-5]所述的种子、组织、组织培养物或细胞获得萃取物的工序。

[1-12]一种瑞鲍迪苷m的制造方法，其特征在于，包含从[1-11]所述的含有瑞鲍迪苷m的萃取物中提纯瑞鲍迪苷m的工序。

[1-13]一种饮食品、甜味组合物、香料或医药品的制造方法，其特征在于，包含将根据[1-11]所述的方法而得的萃取物及/或根据[1-12]所述的方法而得的瑞鲍迪苷m与其他成分混合的工序。

[1-14]一种筛选方法，为瑞鲍迪苷m富含型甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，包含从被实验植物的基因组中检测以下的(1)～(5)的至少1种的遗传性状的存在及/或不存在的工序，

(1)就与序列号35的44位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性，

(2)就与序列号37的40位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性，

(3)就与序列号39的41位相当的位置的碱基为c的等位基因而言为同型接合性，

(4)就与序列号42的55～72位相当的部分缺失的等位基因而言为同型接合性，

(5)就与序列号43的50位相当的位置的碱基为a的等位基因而言为同型接合性。

[1-15]根据[1-14]所述的筛选方法，其特征在于，包含从被实验植物的基因组中检测选自p01～p05中的至少一种多态性标记的工序。

[1-16]根据[1-14]或[1-15]所述的筛选方法，其特征在于，进一步包含测定叶组织的瑞鲍迪苷m的含量的工序。

[1-17]一种引物集，为选自下述引物集中的任一种以上的引物集，

(1)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号1中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号2中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

(2)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号3中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号4中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

(3)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号5中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号6中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

(4)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号7中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号8中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

或(5)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号9中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号10中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

其特征在于，所述任意的连续的15碱基以上的序列位于各引物的3’末端。

[1-18]一种试剂盒，为含有[1-17]所述的引物集，以及根据情况含有限制酶的试剂盒，其特征在于，

所述引物集包含具有或含有序列号1中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物时，含有限制酶xbai，

所述引物集包含具有或含有序列号3中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物时，含有限制酶kpni，

所述引物集包含具有或含有序列号5中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物时，含有限制酶aflii，

所述引物集包含具有或含有序列号9中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物时，含有限制酶pvui。

[1-19]一种探针，其特征在于，可与可以检测的标记结合，含有序列号55～64中任一个所示的碱基序列。

[1-20]根据[1-19]所述的探针，其特征在于，具有荧光标记、色素或结合部分。

[1-21]一种筛选方法，为富含瑞鲍迪苷m的非转基因甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，包含：以检测选自p01～p05中的至少一种多态性标记为目的而使用[1-17]所述的引物集对被实验植物的基因组dna进行pcr扩增的工序；及当所述多态性标记为选自p01～p03及p05中的至少一种时，以限制酶对通过所述pcr扩增而得的pcr产物进行处理，并检测限制酶处理产物的工序。

[1-22]根据[1-21]所述的筛选方法，其特征在于，所述限制酶为选自xbai、kpni、aflii及pvui中的至少一种。

[1-23]根据[1-21]所述的筛选方法，其特征在于，所述多态性标记包含p02及p05。

[1-24]根据[1-23]所述的筛选方法，其特征在于，所述限制酶包含kpni及pvui。

[1-25]根据[1-21]～[1-24]中任一项所述的筛选方法，其特征在于，通过筛选而得的植物体相对于叶中所含总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m。

本发明还提供以下内容。

[2-1]一种甜菊植物体，为富含瑞鲍迪苷m的非转基因甜菊植物体，其特征在于，相对于干燥叶中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m。

[2-2]根据上述[2-1]所述的甜菊植物体，其特征在于，相对于干燥叶中所含的总甜菊醇糖苷量进一步含有9.5％以上的瑞鲍迪苷d。

[2-3]根据上述[2-1]或[2-2]所述的甜菊植物体，其特征在于，就选自p01、p02、p03、p04及p05中的至少一种的多态性标记而言为阳性。

[2-4]一种植物体的种子，其特征在于，为上述[2-1]～[2-3]中任一项所述的植物体的种子。

[2-5]一种植物体的干燥叶，其特征在于，为上述[2-1]～[2-3]中任一项所述的植物体的干燥叶。

[2-6]一种植物体的组织培养物或植物培养细胞，其特征在于，为上述[2-1]～[2-3]中任一项所述的植物体的组织培养物或植物培养细胞。

[2-7]根据上述[2-6]所述的植物体的组织培养物或植物培养细胞，其特征在于，为胚、分裂组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织。

[2-8]一种生产富含瑞鲍迪苷m的甜菊植物体的方法，其特征在于，包含使上述[2-1]～[2-3]中任一项所述的甜菊植物体与第2甜菊植物体杂交的工序，所述富含瑞鲍迪苷m的甜菊植物体相对于干燥叶中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m。

[2-9]根据上述[2-8]所述的方法，其特征在于，第2植物体为上述[2-1]～[2-3]中任一项所述的甜菊植物体。

[2-10]一种萃取物，其特征在于，为上述[2-1]～[2-3]中任一项所述的甜菊植物体的萃取物或上述[2-4]所述的植物体的种子或上述[2-5]所述的干燥叶的萃取物。

[2-11]一种饮食品、甜味组合物、香料或医药品，其特征在于，含有上述[2-10]所述的萃取物。

[2-12]一种含有瑞鲍迪苷m的萃取物的制造方法，其特征在于，包含从上述[2-1]～[2-3]中任一项所述的植物体、上述[2-4]所述的种子或上述[2-5]所述的干燥叶中获得萃取物的工序。

[2-13]一种瑞鲍迪苷m的制造方法，其特征在于，包含从上述[2-12]所述的含有瑞鲍迪苷m的萃取物中提纯瑞鲍迪苷m的工序。

[2-14]一种饮食品、甜味组合物、香料或医药品的制造方法，其特征在于，包含将根据上述[2-12]所述的方法而得的萃取物及/或根据上述[2-13]所述的方法而得的瑞鲍迪苷m与其他成分混合的工序。

[2-15]一种筛选方法，为瑞鲍迪苷m富含型甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，包含从被实验植物的基因组中检测选自p01、p02、p03、p04及p05中的至少一种的多态性标记的工序。

[2-16]根据上述[2-15]所述的筛选方法，其特征在于，进一步包含测定叶组织的瑞鲍迪苷m的含量的工序。

[2-17]一种引物集，为选自下述引物集中的任一种以上的引物集，

(1)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号1中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号2中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

(2)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号3中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号4中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

(3)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号5中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号6中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

(4)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号7中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号8中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

或(5)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号9中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号10中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

其特征在于，所述任意的连续的15碱基以上的序列位于各引物的3’末端。

[2-18]一种试剂盒，为含有选自上述[2-17]所述的(1)～(5)中的至少一种引物集和限制酶的试剂盒，其特征在于，

所述引物集为(1)时，所述限制酶为xbai，

所述引物集为(2)时，所述限制酶为kpni，

所述引物集为(3)时，所述限制酶为aflii，

所述引物集为(5)时，所述限制酶为pvui。

[2-19]一种探针，其特征在于，可与可以检测的标记结合，含有序列号1～10中任一个所示的碱基序列。

[2-20]根据上述[2-19]所述的探针，其特征在于，具有荧光标记、色素或结合部分。

[2-21]一种筛选方法，为富含瑞鲍迪苷m的非转基因甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，包含：以检测选自p01、p02、p03、p04及p05中的至少一种多态性标记为目的而使用上述[2-17]中所述的引物集对被实验植物的基因组dna进行pcr扩增的工序；

及当所述多态性标记为选自p01、p02、p03及p05中的至少一种时，以限制酶对通过所述pcr扩增而得的pcr产物进行处理，并检测限制酶处理产物的工序。

[2-22]根据上述[2-21]所述的筛选方法，其特征在于，所述限制酶为选自xbai、kpni、aflii及pvui中的至少一种。

[2-23]根据上述[2-21]所述的筛选方法，其特征在于，所述多态性标记为p02及p05。

[2-24]根据上述[2-23]所述的筛选方法，其特征在于，所述限制酶为kpni及pvui。

[2-25]根据上述[2-21]～[2-24]中任一项所述的筛选方法，其特征在于，通过筛选而得的植物体相对于干燥叶中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m。

根据本发明可以获得含有更多的瑞鲍迪苷m的甜菊植物体，提供用于生产该植物体的方法、可从该植物体中获得的叶、含有从该叶中获得的瑞鲍迪苷m的食物或饮料等。

附图说明

图1表示在第i种群的标记检测中获得的电泳图。

图2表示在第ii种群的标记检测中获得的电泳图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。以下的实施方式为用于说明本发明的例示，并非将本发明仅限定于该实施方式的意思。只要不脱离该主旨，本发明可以各种各样的方式进行实施。

且，本说明书中引用的所有的文献及公开公报、专利公报及其他的专利文献作为参考纳入本说明书中。此外，本说明书包含2017年10月12日提出申请的成为本申请优先权主张的基础的日本专利申请(日本特愿2017-198515号)的说明书及附图中所述的内容。

1.本发明的瑞鲍迪苷m富含型非转基因甜菊植物体

本发明提供一种富含瑞鲍迪苷m的非转基因甜菊植物体(以下，有时称作“本发明的植物体”或“本发明的甜菊植物体”)，其特征在于，相对于叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m。

本发明的甜菊植物体为由野生种的甜菊植物体派生的种，是为了能够使瑞鲍迪苷m变高而在基因上发生变异的种。且该基因的变异为非转基因的方式产生的变异(后述)。

在本发明中，在富含瑞鲍迪苷m的非转基因甜菊植物体中，有时将特征为相对于叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中所含的总甜菊醇糖苷量含有2～4.6％的瑞鲍迪苷m的甜菊植物体称作富含瑞鲍迪苷m的非转基因甜菊植物体，还有时将特征为含有4.7％以上的瑞鲍迪苷m的甜菊植物体称作超富含瑞鲍迪苷m的非转基因甜菊植物体。

所谓总甜菊醇糖苷(totalsteviolglycoside：tsg)，不包含未知的甜菊醇糖苷，此外也不包含以低于检测极限而存在的甜菊醇糖苷。所谓总甜菊醇糖苷优选为选自瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷f、瑞鲍迪苷i、瑞鲍迪苷j、瑞鲍迪苷k、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷o、瑞鲍迪苷q、瑞鲍迪苷r、杜克苷a、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的2种以上的任意组合。例如，在某实施方式中，总甜菊醇糖苷由瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷f及甜菊醇构成，在其他的实施方式中总甜菊醇糖苷也可由瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷f、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷o及甜菊醇构成。

所谓相对于叶中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m，其特征在于，用相对于从叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中获得的甜菊醇糖苷总量的比率以rebm/tsg％对瑞鲍迪苷m(rebm)的含量进行表示时，rebm/tsg的值的下限为2％以上、3％以上、4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、12％以上、14％以上、16％以上、18％以上、20％以上、22％以上、24％以上、26％以上、28％以上、30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、38％以上。另一方面，其特征在于，rebm/tsg的值的上限为15％以下、16％以下、18％以下、20％以下、22％以下、24％以下、26％以下、28％以下、30％以下、32％以下、34％以下、36％以下、38％以下、40％以下。该下限和上限的组合只要为上限值大于下限值的组合则无特别限定，有时将2％以上且小于4.7％的植物体称作富含瑞鲍迪苷m表型，将4.7％以上且15％以下的植物体称作超富含瑞鲍迪苷m表型。

此外，本发明的植物体也可在干燥叶100g中含有0.19g以上的瑞鲍迪苷m。这意味着由本发明的植物体获得干燥叶时，该干燥叶每100g中瑞鲍迪苷m以0.19g以上、0.20g以上、0.25g以上、0.30g以上、0.35g以上、0.40g以上、0.45g以上、0.50g以上、0.55g以上、0.60g以上、0.65g以上、0.70g以上、0.75g以上、0.80g以上、0.85g以上、0.90g以上、0.95g以上、1.00g以上、1.05g以上、1.10g以上、1.15g以上、1.20g以上、1.25g以上、1.30g以上、1.35g以上、1.40g以上、1.45g以上的量存在。

在此，所谓本发明的植物体的干燥叶是指通过使本发明的甜菊植物体的新鲜叶干燥而使含水量减少至3～4重量％的叶。

在此，本发明的植物体在干燥叶100g中还可进一步含有1.00g以上、1.05g以上、1.10g以上、1.15g以上、1.20g以上、1.25g以上、1.30g以上、1.35g以上、1.40g以上、1.45g以上、1.50g以上、1.55g以上、1.60g以上、1.65g以上、1.70g以上、1.75g以上、1.80g以上、1.85g以上、1.90g以上、1.95g以上、2.00g以上、2.05g以上、2.10g以上、2.15g以上、2.20g以上、2.25g以上、2.30g以上、2.35g以上、2.40g以上、2.45g以上、2.50g以上、2.55g以上、2.60g以上、2.65g以上、2.70g以上、2.75g以上、2.80g以上、2.85g以上、2.90g以上、2.95g以上、3.00g以上、3.05g以上、3.10g以上、3.15g以上、3.20g以上、3.25g以上、3.30g以上、3.35g以上、3.40g以上、3.45g以上、3.50g以上、3.55g以上或3.57g以上的瑞鲍迪苷d。

在此，瑞鲍迪苷m和d的含量的组合并无特别限定，为任意。

本发明的植物体在干燥叶100g中优选含有1.03g以上的瑞鲍迪苷m和1.1g以上的瑞鲍迪苷d。

或者，将野生型甜菊植物体的叶每100g中含有的瑞鲍迪苷m的量(g)设为100％时，本发明的植物体的叶(例如，干燥叶或新鲜叶)与野生型甜菊种相比可以300％以上、400％以上、500％以上、600％以上、700％以上、800％以上、900％以上、1100％以上、1200％以上、1300％以上、1400％以上、1500％以上、1600％以上、1700％以上、1800％以上、1900％以上、2000％以上、2100％以上、2200％以上、2300％以上、2400％以上、2500％以上、2600％以上、2700％以上、2800％以上、2900％以上、3000％以上的高含量含有瑞鲍迪苷m。

此外，以rebm/rebd的比率对叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中的瑞鲍迪苷m(rebm)及瑞鲍迪苷d(rebd)的含量进行表示时，本发明的甜菊植物体的特征在于，rebm/rebd的值的下限为0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.8以上及1.0以上。另一方面，其特征在于，rebm/rebd的值的上限为0.3以下、0.4以下、0.5以下、0.6以下、0.8以下、1.0以下、1.1以下及1.2以下。该下限和上限的组合只要为上限值大于下限值的组合则无特别限定，优选为0.2以上且1.2以下，或者0.6以上且1.1以下。

此外，作为相对于甜菊醇糖苷总量的比率以(rebd+rebm)/tsg％对叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中的瑞鲍迪苷m(rebm)及瑞鲍迪苷d(rebd)的含量进行表示时，本发明的甜菊植物体的特征在于，(rebd+rebm)/tsg的值的下限为14％以上、16％以上、18％以上、20％以上、22％以上、24％以上、26％以上、28％以上、30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、38％以上。另一方面，其特征在于，(rebd+rebm)/tsg的值的上限为18％以下、20％以下、22％以下、24％以下、26％以下、28％以下、30％以下、32％以下、34％以下、36％以下、38％以下、40％以下。该下限和上限的组合只要为上限值大于下限值的组合则无特别限定，优选为14％以上且40％以下，或者16％以上且40％以下。

在其他的实施方式中，本发明的植物体也可为甜菊醇糖苷总量比野生型少的植物体。具体而言，也可为干燥叶100g中含有小于19g的甜菊醇糖苷总量的植物体。这意味着，由本发明的植物体得到干燥叶时，该干燥叶每100g的甜菊醇糖苷总量为小于19g、小于18g、小于17g、小于16g、小于15g、小于14g、小于13g、小于12g、小于11g、小于10g、小于9g、小于8g、小于7g的量。

此外，以rebm/reba的比率对叶(例如，干燥叶或新鲜叶)100g中的瑞鲍迪苷m(rebm)及瑞鲍迪苷a(reba)的含量进行表示时，本发明的甜菊植物体的特征在于，rebm/reba的值的下限为0.03以上、0.04以上、0.05以上、0.06以上、0.08以上、0.10以上、0.12以上、0.14以上。另一方面，其特征在于，rebm/reba的值的上限为0.08以下、0.10以下、0.12以下、0.14以下、0.16以下、0.18以下、0.20以下、0.24以下、0.26以下。该下限和上限的组合只要为上限值大于下限值的组合则无特别限定，优选为0.03以上且0.26以下，或者0.10以上且0.26以下。

此外，作为相对于甜菊醇糖苷总量的比率以(reba+rebm)/tsg对叶(例如，干燥叶或新鲜叶)100g中的瑞鲍迪苷m(rebm)及瑞鲍迪苷a(reba)的含量进行表示时，本发明的甜菊植物体的特征在于，(reba+rebm)/tsg的值的下限为4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、12％以上、14％以上、16％以上、18％以上、20％以上、22％以上、24％以上、26％以上、28％以上、30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、38％以上。另一方面，其特征在于，(reba+rebm)/tsg的值的上限为10％以下、12％以下、14％以下、16％以下、18％以下、20％以下、22％以下、24％以下、26％以下、28％以下、30％以下、32％以下、34％以下、36％以下、38％以下、40％以下。该下限和上限的组合只要为上限值大于下限值的组合则无特别限定，优选为4％以上且40％以下，或者16％以上且40％以下。

如前所述，本发明的甜菊植物体为发生了瑞鲍迪苷m升高的变异的植物体。该变异具有以下的(1)～(5)中的至少1种的遗传性状(以下有时称“本发明的遗传性状”)。

(1)就与序列号35的44位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性。

(2)就与序列号37的40位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性。

(3)就与序列号39的41位相当的位置的碱基为c的等位基因而言为同型接合性。

(4)就与序列号42的55～72位相当的部分缺失的等位基因而言为同型接合性。

(5)就与序列号43的50位相当的位置的碱基为a的等位基因而言为同型接合性。

所谓“与～相当的位置(或部分)”，当在基因组中存在与标准序列(例如，序列号35、37、39、42、43等)相同的序列时，指在基因组中存在的该序列中的位置或部分(例如，44位、40位、41位、55～72位、50位等)，当在基因组中不存在与标准序列相同的序列时，指基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置或部分相当的位置或部分。在基因组中是否存在与标准序列相同或与其相当的序列，例如可通过以下方法决定：通过可用pcr对标准序列进行扩增的引物对作为对象的甜菊植物的基因组dna进行扩增，并实施扩增产物的测序，实施所得序列和标准序列的比对分析。作为与标准序列相当的序列的非限定例，例如可列举相对于标准序列具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.1％以上、98.4％以上、98.7％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上或99.8％以上的序列一致性的碱基序列。基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置或部分相当的位置或部分，可以考虑标准序列中的位置或部分的前后的碱基序列等而决定。例如，可通过对标准序列和基因组中的与标准序列相当的序列的比对分析，决定基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置或部分相当的位置或部分。

例如，若以遗传性状(1)的“与序列号35的44位相当的位置”为例，当甜菊植物体的基因组具有由与序列号35相同的碱基序列构成的部分时，“与序列号35的44位相当的位置”为自基因组中的由与序列号35相同的碱基序列构成的部分的5’侧开始的44位。另一方面，当甜菊植物体的基因组与序列号35不同但是具有由与其相当的碱基序列构成的部分时，由于基因组不具有由与序列号35相同的碱基序列构成的部分，“与序列号35的44位相当的位置”并非一定是自与序列号35相当的部分的5’侧开始的44位，但是考虑序列号35的44位的前后的碱基序列等，可以确定涉及的甜菊植物的基因组中的“与序列号35的44位相当的位置”。例如，通过甜菊植物的基因组中的与序列号35相当的部分的碱基序列和序列号35的碱基序列的比对分析，可以确定甜菊植物的基因组中的“与序列号35的44位相当的位置”。

“由与序列号35相当的碱基序列构成的部分”意味着，例如，由相对于序列号35的碱基序列具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.1％以上、98.4％以上、98.7％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上或99.8％以上的序列一致性的碱基序列构成的部分。

在一部分的方式中，在“由与序列号35相当的碱基序列构成的部分”中包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物体的基因组的部分：与从序列号35的5’末端开始15～25个碱基长的部分的互补序列杂交的正向引物和与从序列号35的3’末端侧开始15～25个碱基长的部分杂交的反向引物。

这里为了简洁，以遗传性状(1)为例进行了说明，但是对于遗传性状(2)～(5)也是同样的。

在特定的方式中，在“由与序列号35相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：含有序列号45的碱基序列的正向引物和含有序列号46的碱基序列的反向引物。

在特定的方式中，在“由与序列号37相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：含有序列号47的碱基序列的正向引物和含有序列号48的碱基序列的反向引物。

在特定的方式中，在“由与序列号39相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：含有序列号49的碱基序列的正向引物和含有序列号50的碱基序列的反向引物。

在特定的方式中，在“由与序列号42相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：含有序列号51的碱基序列的正向引物和含有序列号52的碱基序列的反向引物。

在特定的方式中，在“由与序列号43相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：含有序列号53的碱基序列的正向引物和含有序列号54的碱基序列的反向引物。

在特定的方式中，“与序列号35的44位相当的位置的碱基为t的等位基因”含有序列号55、65或75的碱基序列。

在特定的方式中，“与序列号37的40位相当的位置的碱基为t的等位基因”包含序列号57、67或77的碱基序列。

在特定的方式中，“与序列号39的41位相当的位置的碱基为c的等位基因”包含序列号59、69或79的碱基序列。

在特定的方式中，“与序列号42的55～72位相当的部分的缺失的等位基因”包含序列号61、71或81的碱基序列。

在特定的方式中，“与序列号43的50位相当的位置的碱基为a的等位基因”包含序列号63、73或83的碱基序列。

在此，有时将选自下述位置中的位置称作“本发明的多态性部位”或“本发明的变异部位”：(1)与序列号35的44位相当的位置、(2)与序列号37的40位相当的位置、(3)与序列号39的41位相当的位置、(4)与序列号42的55～72位相当的部分及(5)与序列号43的50位相当的位置。

此外，有时将选自下述变异中的变异称作“本发明的多态性”或“本发明的变异”：(1)与序列号35的44位相当的位置上由a向t的变异、(2)与序列号37的40位相当的位置上由c向t的变异、(3)与序列号39的41位相当的位置上由g向c的变异、(4)与序列号42的55～72位相当的部分的缺失及(5)与序列号43的50位相当的位置上由g向a的变异。

上述遗传性状可通过以下方法进行检测：pcr法、taqmanpcr法、测序法、微阵列法、invader法、tilling法、rad(randomamplifiedpolymorphicdna)法、限制酶片段长度多态性(rflp)法、pcr-sscp法、aflp(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)法、sslp(simplesequencelengthpolymorphism)法、caps(cleavedamplifiedpolymorphicsequence)法、dcaps(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequence)法、等位基因特异性寡核苷酸(aso)法、arms法、变性梯度凝胶电泳(dgge)法、ccm(chemicalcleavageofmismatch)法、dol法、maldi-tof/ms法、tdi法、锁式探针法、分子信标法、dash(dynamicallelespecifichybridization)法、ucan法、eca法、pinpoint法、probe(primeroligobaseextension)法、vset(veryshortextension)法、survivorassay、sniperassay、luminexassay、good法、lcx法、snapshot法、massarray法、pyrosequencing法、snp-it法、熔解曲线分析法等，但检测方法并不限定于这些。

在特定的方式中，上述遗传性状可使用本发明者们开发的多态性标记作为“多态性标记阳性”的遗传性状被检测出。

在此多态性标记为选自p01～p05中的至少一种。

对于p01所谓阳性是指，使用具有序列号1所示的碱基序列的正向引物及具有序列号2所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增，即使对得到的pcr产物(约383bp长：例如，序列号21或22)实施xbai限制酶处理也仅可获得约383bp长的条带(例如，序列号21)。相反的对上述pcr产物实施xbai限制酶处理时生成约344bp的限制酶处理产物(例如，序列号23)时，该候选植物体则为p01阴性。

对于p02所谓阳性是指，使用具有序列号3所示的碱基序列的正向引物及具有序列号4所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增，即使对得到的pcr产物(297bp长)(例如，序列号24或25)实施kpni限制酶处理也仅可获得约297bp长的条带(例如，序列号24)。相反的当生成约258bp的限制酶处理产物(例如，序列号26)时，该候选植物体则为p02阴性。

对于p03所谓阳性是指，使用具有序列号5所示的碱基序列的正向引物及具有序列号6所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增，即使对得到的pcr产物(约390bp长)(例如，序列号27或28)实施aflii限制酶处理也仅可获得约390bp长的条带(例如，序列号27)。相反的当生成约347bp的限制酶处理产物(例如，序列号29)时，该候选植物体则为p03阴性。

对于p04所谓阳性是指，使用具有序列号7所示的碱基序列的正向引物及具有序列号8所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增时，仅生成约140bp的pcr产物(例如，序列号30)，生成140bp(例如，序列号30)及158bp(例如，序列号34)的pcr产物时意味着为阴性。

对于p05所谓阳性是指，使用具有序列号9所示的碱基序列的正向引物及具有序列号10所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增，即使对得到的pcr产物(约288bp长)(例如，序列号31或32)实施pvui限制酶处理也仅可获得约288bp长的条带(例如，序列号31)。相反的当生成约240bp的限制酶处理产物(例如，序列号33)时，该候选植物体则为p05阴性。

关于上述bp长，所谓“约”是指±5bp。限制酶处理可遵循使用的各限制酶的销售商推荐的条件实施。

关于本发明的植物体的筛选方法的细节可参考后述的项目“3.本发明的植物体的筛选方法”。

在实施例中确认上述遗传性状(例如，上述多态性标记阳性的多态性)与富含瑞鲍迪苷m及/或富含瑞鲍迪苷d的表型具有统计学上的相关关系。

瑞鲍迪苷m及d可以通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应以萃取液的状态萃取。萃取条件等可以参考ohtaetal.,j.appl.glycosci.，vol.57，no.3(2010)或wo2010/038911中所述的方法或后述的实施例中所述的方法。

进一步，对于这样得到的萃取液，可通过利用乙酸乙酯或其他有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography：hplc)、气相色谱法、飞行时间质谱(time-of-flightmassspectrometry:tof-ms)、超高效液相色谱(ultra(high)performanceliquidchromatography：uplc)等公知的方法提纯瑞鲍迪苷m。

本发明所涉及的瑞鲍迪苷m含量可通过ohtaetal.,j.appl.glycosci.、vol.57、no.3(2010)或wo2010/038911中所述方法或后述的实施例中所述的方法进行测定。具体而言，可从本发明的甜菊植物体中采取新鲜叶作为样本，通过实施lc/ms-ms进行测定。

本发明的植物体中并非仅包含植物体整体，还可包含植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵状组织等)或各种形态的植物细胞(例如，悬浊培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。此外，叶也可为前面所述的干燥叶。

此外，本发明的植物体中也可包含组织培养物或植物培养细胞。是因为通过培养这样的组织培养物或植物培养细胞，可以再生植物体。作为本发明的植物体的组织培养物或植物培养细胞的例子，可列举胚、分裂组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织等，但并不限定于这些。

2.本发明的植物体的生产方法

本发明在其他的实施方式中提供一种生产以相对于叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m为特征的富含瑞鲍迪苷m的甜菊植物体的方法(以下，有时称作“本发明的生产方法”)，其特征在于，包含使本发明的甜菊植物体与第2甜菊植物体杂交的工序。

通过该方法生产的“特征为相对于叶中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m的富含瑞鲍迪苷m的甜菊植物体”与本发明的植物体具有相同的表型和遗传性质。

具体而言，从根据本发明的生产方法获得的植物体中获得叶(例如，干燥叶或新鲜叶)时，相对于叶中所含的总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m。其特征在于，作为相对于从叶中获得的甜菊醇糖苷总量的比率以rebm/tsg％对瑞鲍迪苷m(rebm)的含量进行表示时，rebm/tsg的值的下限为2％以上、3％以上、4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、12％以上、14％以上、16％以上、18％以上、20％以上、22％以上、24％以上、26％以上、28％以上、30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、38％以上。另一方面，其特征在于，rebm/tsg的值的上限为15％以下、16％以下、18％以下、20％以下、22％以下、24％以下、26％以下、28％以下、30％以下、32％以下、34％以下、36％以下、38％以下、40％以下。该下限和上限的组合只要为上限值大于下限值的组合则无特别限定，优选为2％以上且20％以下，或7％以上且15％以下。

此外，根据本发明的生产方法获得的植物体在干燥叶100g中也可含有0.19g以上的瑞鲍迪苷m。这意味着，从本发明的植物体得到干燥叶时，该干燥叶每100g中瑞鲍迪苷m以0.19g以上、0.20g以上、0.25g以上、0.30g以上、0.35g以上、0.40g以上、0.45g以上、0.50g以上、0.55g以上、0.60g以上、0.65g以上、0.70g以上、0.75g以上、0.80g以上、0.85g以上、0.90g以上、0.95g以上、1.00g以上、1.05g以上、1.10g以上、1.15g以上、1.20g以上、1.25g以上、1.30g以上、1.35g以上、1.40g以上、1.45g以上的量存在。

在此，根据本发明的生产方法获得的植物体在干燥叶100g中可进一步含有1.00g以上、1.05g以上、1.10g以上、1.15g以上、1.20g以上、1.25g以上、1.30g以上、1.35g以上、1.40g以上、1.45g以上、1.50g以上、1.55g以上、1.60g以上、1.65g以上、1.70g以上、1.75g以上、1.80g以上、1.85g以上、1.90g以上、1.95g以上、2.00g以上、2.05g以上、2.10g以上、2.15g以上、2.20g以上、2.25g以上、2.30g以上、2.35g以上、2.40g以上、2.45g以上、2.50g以上、2.55g以上、2.60g以上、2.65g以上、2.70g以上、2.75g以上、2.80g以上、2.85g以上、2.90g以上、2.95g以上、3.00g以上、3.05g以上、3.10g以上、3.15g以上、3.20g以上、3.25g以上、3.30g以上、3.35g以上、3.40g以上、3.45g以上、3.50g以上、3.55g以上或3.57g以上的瑞鲍迪苷d。

在此，瑞鲍迪苷m和d的含量的组合并无特别限定，为任意。

根据本发明的生产方法获得的植物体在干燥叶100g中优选含有1.03g以上的瑞鲍迪苷m和1.1g以上的瑞鲍迪苷d。

或者，将野生型甜菊植物体的叶(例如，干燥叶或新鲜叶)每100g中含有的瑞鲍迪苷m的量(g)设为100％时，与野生型甜菊种相比根据本发明的生产方法获得的植物体的叶可以300％以上、400％以上、500％以上、600％以上、700％以上、800％以上、900％以上、1100％以上、1200％以上、1300％以上、1400％以上、1500％以上、1600％以上、1700％以上、1800％以上、1900％以上、2000％以上、2100％以上、2200％以上、2300％以上、2400％以上、2500％以上、2600％以上、2700％以上、2800％以上、2900％以上、3000％以上的高含量含有瑞鲍迪苷m。

此外，以rebm/rebd的比率对叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中的瑞鲍迪苷m(rebm)及瑞鲍迪苷d(rebd)的含量进行表示时，根据本发明的生产方法获得的植物体的特征在于，rebm/rebd的值的下限为0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.8以上、1.0以上。另一方面，其特征在于，rebm/rebd的值的上限为0.3以下、0.4以下、0.5以下、0.6以下、0.8以下、1.0以下、1.1以下、1.2以下。该下限和上限的组合只要为上限值大于下限值的组合则无特别限定，优选为0.2以上且1.2以下，或者0.6以上且1.1以下。

此外，作为相对于甜菊醇糖苷总量的比率以(rebm+rebd)/tsg％对叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中的瑞鲍迪苷m(rebm)及瑞鲍迪苷d(rebd)的含量进行表示时，根据本发明的生产方法获得的植物体的特征在于，(rebd+rebm)/tsg的值的下限为14％以上、16％以上、18％以上、20％以上、22％以上、24％以上、26％以上、28％以上、30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、38％以上。另一方面，其特征在于，(rebd+rebm)/tsg的值的上限为18％以下、20％以下、22％以下、24％以下、26％以下、28％以下、30％以下、32％以下、34％以下、36％以下、38％以下、40％以下。该下限和上限的组合只要为上限值大于下限值的组合则无特别限定，优选为14％以上且40％以下，或者16％以上且40％以下。

在其他的实施方式中，根据本发明的生产方法获得的植物体也可为甜菊醇糖苷总量比野生型少的植物体。具体而言，也可为干燥叶100g中含有小于19g的甜菊醇糖苷总量的植物体。这意味着，从本发明的植物体得到干燥叶时，该干燥叶每100g中甜菊醇糖苷总量为小于19g、小于18g、小于17g、小于16g、小于15g、小于14g、小于13g、小于12g、小于11g、小于10g、小于9g、小于8g、小于7g的量。

此外，作为相对于甜菊醇糖苷总量的比率以(reba+rebm)/tsg％对叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中的瑞鲍迪苷m(rebm)及瑞鲍迪苷a(reba)的含量进行表示时，根据本发明的生产方法获得的植物体的特征在于，(reba+rebm)/tsg的值的下限为4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、12％以上、14％以上、16％以上、18％以上、20％以上、22％以上、24％以上、26％以上、28％以上、30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、38％以上、40％以上。另一方面，其特征在于(reba+rebm)/tsg的值的上限为30％以下、32％以下、34％以下、36％以下、38％以下、40％以下、42％以下、44％以下、46％以下、48％以下、50％以下、52％以下、54％以下、56％以下、58％以下、60％以下、62％以下、64％以下、66％以下、68％以下、70％以下、72％以下、74％以下、76％以下、78％以下、80％以下。该下限和上限的组合只要为上限值大于下限值的组合则无特别限定，优选为4％以上且80％以下，或者40％以上且80％以下。

根据本发明的生产方法获得的植物体具有瑞鲍迪苷m升高的以下的(1)～(5)中的至少一种遗传性状。

(1)就与序列号35的44位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性。

(2)就与序列号37的40位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性。

(3)就与序列号39的41位相当的位置的碱基为c的等位基因而言为同型接合性。

(4)就与序列号42的55～72位相当的部分缺失的等位基因而言为同型接合性。

(5)就与序列号43的50位相当的位置的碱基为a的等位基因而言为同型接合性。

所涉及的遗传性状可使用本发明者们开发的多态性标记作为“多态性标记阳性”的遗传性状被检测出。

在此多态性标记为选自p01～p05中的至少一种。

对于p01所谓阳性是指，使用具有序列号1所示的碱基序列的正向引物及具有序列号2所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增，即使对得到的pcr产物(约383bp长：例如，序列号21或22)实施xbai限制酶处理也仅可获得约383bp长的条带(例如，序列号21)。相反的对上述pcr产物实施xbai限制酶处理时生成约344bp的限制酶处理产物(例如，序列号23)时，该候选植物体则为p01阴性。

对于p02所谓阳性是指，使用具有序列号3所示的碱基序列的正向引物及具有序列号4所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增，即使对得到的pcr产物(297bp长)(例如，序列号24或25)实施kpni限制酶处理也仅可获得约297bp长的条带(例如，序列号24)。相反的当生成约258bp的限制酶处理产物(例如，序列号26)时，该候选植物体则为p02阴性。

对于p03所谓阳性是指，使用具有序列号5所示的碱基序列的正向引物及具有序列号6所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增，即使对得到的pcr产物(约390bp长)(例如，序列号27或28)实施aflii限制酶处理也仅可获得约390bp长的条带(例如，序列号27)。相反的当生成约347bp的限制酶处理产物(例如，序列号29)时，该候选植物体则为p03阴性。

对于p04所谓阳性是指，使用具有序列号7所示的碱基序列的正向引物及具有序列号8所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增时，仅生成约140bp的pcr产物(例如，序列号30)，生成140bp(例如，序列号30)及158bp(例如，序列号34)的pcr产物时意味着为阴性。

对于p05所谓阳性是指，使用具有序列号9所示的碱基序列的正向引物及具有序列号10所示的碱基序列的反向引物，对候选植物体的基因组dna实施pcr扩增，即使对得到的pcr产物(约288bp长)(例如，序列号31或32)实施pvui限制酶处理也仅可获得约288bp长的条带(例如，序列号31)。相反的当生成约240bp的限制酶处理产物(例如，序列号33)时，该候选植物体则为p05阴性。

关于上述bp长，所谓“约”是指±5bp。限制酶处理可遵循使用的各限制酶的销售商推荐的条件实施。

在本发明的生产方法中，所谓“使其杂交”是指通过使本发明的植物体(第一代(s1))和第2植物体(s1)交配获得其子植物体(根据本发明的生产方法生产的植物体(第二代(s2)))。作为杂交方法，优选回交。所谓“回交”为使在本发明的植物体和第2植物体之间诞生的子植物体(s2)进一步与本发明的植物体(即，具有本发明的遗传性状的植物体)(s1)杂交，生产具有本发明的遗传性状的植物体的方法。本发明的生产方法中使用的第2植物体(s1)为与本发明的植物体具有相同的表型和遗传性质时，实质上为回交。本发明的基因多态性遵循孟德尔定律进行遗传，与其相伴的与该基因多态性相关的表型，即富含瑞鲍迪苷m的表型也遵循孟德尔定律进行遗传。

或者，本发明的植物体也可通过自体受精进行生产。自体受精可通过使本发明的植物体的雄蕊的花粉向本发明的植物体的雌蕊自花传粉来实施。

根据本发明的生产方法生产的植物体的表型及遗传性质与本发明的植物体相同，因此通过使根据本发明的生产方法生产的植物体进一步与第3甜菊植物体杂交，可以生产以相对于叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中所含总甜菊醇糖苷量含有2％以上的瑞鲍迪苷m为特征的富含瑞鲍迪苷m的甜菊植物体。

作为其他方式，本发明的植物体也可通过对前面所述组织培养物或植物培养细胞进行培养而对植物体进行再生的方式生产。关于培养条件，与野生型甜菊植物的组织培养物或植物培养细胞的培养条件相同，为公知的(protocolsforinvitroculturesandsecondarymetaboliteanalysisofaromaticandmedicinalplants，methodinmolecularbiology，vo.1391，pp113-123.)。

或者，由于本发明的植物体为非转基因体，因此也可通过非转基因的方法将上述多态性编入野生型的甜菊植物体而制作。作为“非转基因的方法”的例子，可列举不导入外来基因而诱导宿主细胞(或宿主植物体)的基因变异的方法。作为那样的方法可列举使植物细胞的诱变剂作用的方法。作为那样的诱变剂，可列举甲磺酸乙酯(ems)及叠氮化钠等。例如甲磺酸乙酯(ems)可以0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等浓度对植物细胞进行处理。处理时间为1～48小时、2～36小时、3～30小时、4～28小时、5～26小时、6～24小时。处理流程自身为公知的，可通过使经过吸水过程的吸水种子在以上述浓度含有诱变剂的处理液中浸渍上述处理时间来实施。

或者，作为非转基因的方法的例子，也可为使x射线、γ射线、紫外线等放射线或光线照射植物细胞的方法。此时，将用适当的紫外线的照射量(紫外线灯强度、距离、时间)进行照射后的细胞于选择培养基等培养后，可选择具有目标性状的细胞、愈伤组织、植物体。那时的照射强度为0.01～100gr、0.03～75gr、0.05～50gr、0.07～25gr、0.09～20gr、0.1～15gr、0.1～10gr、0.5～10gr、1～10gr，照射距离为1cm～200m、5cm～100m、7cm～75m、9cm～50m、10cm～30m、10cm～20m、10cm～10m，照射时间为1分钟～2年、2分钟～1年、3分钟～0.5年、4分钟～1个月、5分钟～2周、10分钟～1周。照射的强度、距离及时间根据放射线的种类或成为照射对象的状态(细胞、愈伤组织、植物体)而不同，若为本领域技术人员可进行适当调整。

此外，细胞融合、花药培养(单倍体培养)、远缘杂交(单倍体培养)等方法也是公知的。

一般而言，植物细胞由于在培养期间有时会伴随变异，因此为了维持更稳定的性状优选恢复为植物个体。

另外，本发明的植物体虽然为非转基因甜菊植物体，然而以本发明的植物体为宿主，事后进行转基因(例如通过基因组编辑等)而得的植物体(例如，以本发明的植物体为宿主实施转基因，进一步附加了其他的性状的植物体)也不从本发明的范围中排除。

3.本发明的植物体的筛选方法

本发明的植物体及与本发明的植物体具有相同表型和遗传性质的植物体可通过从该植物体的组织中检测本发明的遗传性状进行筛选。在此，所谓“筛选”是指识别本发明的植物体和其以外的植物体，并选择本发明的植物体。

从而，作为其他的实施方式，本发明提供一种方法，为筛选瑞鲍迪苷m富含型甜菊植物体的筛选方法(以下有时称“本发明的筛选方法”)，其特征在于，包含从被实验植物的基因组中检测以下(1)～(5)的至少1种的遗传性状的存在及/或不存在的工序。

(1)就与序列号35的44位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性。

(2)就与序列号37的40位相当的位置的碱基为t的等位基因而言为同型接合性。

(3)就与序列号39的41位相当的位置的碱基为c的等位基因而言为同型接合性。

(4)就与序列号42的55～72位相当的部分缺失的等位基因而言为同型接合性。

(5)就与序列号43的50位相当的位置的碱基为a的等位基因而言为同型接合性。

本发明的筛选方法也可进一步包含将检测出至少存在上述(1)～(5)中的1种遗传性状的植物体从被实验植物中选出的工序。

本发明的遗传性状的存在可根据检出存在选自下述的等位基因，

(a)与序列号35的44位相当的位置的碱基为t的等位基因，

(b)与序列号37的40位相当的位置的碱基为t的等位基因，

(d)与序列号39的41位相当的位置的碱基为c的等位基因，

(d)与序列号42的55～72位相当的部分缺失的等位基因，及

(e)与序列号43的50位相当的位置的碱基为a的等位基因，

及/或检出不存在选自下述的等位基因来决定，

(a)与序列号35的44位相当的位置的碱基为a的等位基因，

(b)与序列号37的40位相当的位置的碱基为c的等位基因，

(c)与序列号39的41位相当的位置的碱基为g的等位基因，

(d)与序列号42的55～72位相当的部分未缺失的等位基因，及

(e)与序列号43的50位相当的位置的碱基为g的等位基因。

本发明的遗传性状的不存在可根据检出不存在选自下述的等位基因，

(a)与序列号35的44位相当的位置的碱基为t的等位基因，

(b)与序列号37的40位相当的位置的碱基为t的等位基因，

(d)与序列号39的41位相当的位置的碱基为c的等位基因，

(d)与序列号42的55～72位相当的部分缺失的等位基因，及

(e)与序列号43的50位相当的位置的碱基为a的等位基因，

及/或检出存在选自下述的等位基因来决定，

(a)与序列号35的44位相当的位置的碱基为a的等位基因，

(b)与序列号37的40位相当的位置的碱基为c的等位基因，

(c)与序列号39的41位相当的位置的碱基为g的等位基因，

(d)与序列号42的55～72位相当的部分未缺失的等位基因，及

(e)与序列号43的50位相当的位置的碱基为g的等位基因。

作为本发明的遗传性状的检测方法的具体例，可列举pcr法、taqmanpcr法、测序法、微阵列法、invader法、tilling法、rad法、rflp法、pcr-sscp法、aflp法、sslp法、caps法、dcaps法、aso法、arms法、dgge法、ccm法、dol法、maldi-tof/ms法、tdi法、锁式探针法、分子信标法、dash法、ucan法、eca法、pinpoint法、probe法、vset法、survivorassay、sniperassay、luminexassay、good法、lcx法、snapshot法、massarray法、pyrosequencing法、snp-it法、熔解曲线分析法等，但并不限定于这些。

在pcr法的情况下，优选制作3’末端部分具有与本发明的多态性部位互补的序列的引物。若使用这样设计的引物，当成为模板的样本具有多态性时，由于引物完全与模板杂交，发生聚合酶延伸反应，模板不具有本发明的变异时，由于引物的3’末端的核苷酸与模板产生不匹配，不发生延伸反应。从而，使用这样的引物实施pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳等对扩增产物进行分析，若能确认一定的大小的扩增产物，则作为样本的模板具有变异，扩增产物不存在时，可判断模板不具有变异。

或者，使本发明的多态性不和引物序列重复，且设计可使本发明的基因变异pcr扩增的引物序列，通过对扩增的核苷酸片段的碱基序列测序，可检测本发明的遗传性状。

关于pcr及琼脂糖凝胶电泳，参考以下：sambrook,fritschandmaniatis,“molecularcloning:alaboratorymanual”2ndedition(1989),coldspringharborlaboratorypress。

所谓taqmanpcr法是利用基于经荧光标记的等位基因特异性寡核苷酸和taqdna聚合酶的pcr反应的方法(livak,k.j.genet.anal.14,143(1999)；morrist.etal.,j.clin.microbiol.34,2933(1996))。

所谓测序法是通过pcr使含有变异的区域扩增，使用dyeterminator等对dna序列进行测序分析变异的有无的方法(sambrook,fritschandmaniatis,“molecularcloning:alaboratorymanual”2ndedition(1989),coldspringharborlaboratorypress)。

dna微阵列为核苷酸探针的一端在支持体上固定为阵列的物质，包含dna芯片、基因芯片、微芯片、珠阵列等。通过使用含有与本发明的多态性互补的序列的探针可详尽地检测本发明的多态性的有无。作为dna芯片等dna微阵列测定可列举基因芯片测定(affymetrix公司；参考美国专利第6,045,996号，同第5,925,525号及同第5,858,659号)。基因芯片技术为利用贴附于芯片上的寡核苷酸探针的小型化高密度微阵列的技术。

所谓invader法为基于对于snp等多态性的各自的等位基因为特异性的2种reporter探针及1种invader探针向模板dna的杂交和具有识别dna的结构并切断的特殊的核酸内切酶活性的cleavase酶的对dna的切断进行组合的方法(livak,k.j.biomol.eng.14,143-149(1999)；morrist.etal.,j.clin.microbiol.34,2933(1996)；lyamichev,v.etal.,science,260,778-783(1993)等)。

所谓tilling(targetinginducedlocallesionsingenomes)法为，通过pcr扩增和celi核酸酶处理对导入变异的突变体集团的基因组中的变异不匹配进行筛选的方法。

在一种方式中，本发明的筛选方法也可包含从被实验植物的基因组中检测本发明的多态性标记阳性的工序。所涉及的工序包含从被实验植物中提取基因组dna，针对该基因组dna检测本发明的多态性标记的操作。多态性标记如前所述为选自p01～p05中的至少一种。此外，所谓多态性标记阳性是指对于选自p01～p05中的至少一种的标记为阳性。

关于p01～p05的阳性的检测方法如前所述。

在该方式中，本发明的筛选方法也可进一步包含将被检测出本发明的多态性标记阳性的植物体从被实验植物中选出的工序。

在某种实施方式中提供一种筛选方法，为富含瑞鲍迪苷m的非转基因甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，包含使用下述引物集(1)～(5)中的至少一种对被实验植物的基因组dna进行pcr扩增的工序，

以限制酶对通过所述pcr扩增而得的pcr产物进行处理，并检测限制酶处理产物的工序。

(1)一种引物集，该引物集包含：含有序列号1所示的碱基序列的正向引物及含有序列号2所示的碱基序列的反向引物，

(2)一种引物集，该引物集包含：含有序列号3所示的碱基序列的正向引物及含有序列号4所示的碱基序列的反向引物，

(3)一种引物集，该引物集包含：含有序列号5所示的碱基序列的正向引物及含有序列号6所示的碱基序列的反向引物，

(4)一种引物集，该引物集包含：含有序列号7所示的碱基序列的正向引物及含有序列号8所示的碱基序列的反向引物，

或(5)一种引物集，该引物集包含：含有序列号9所示的碱基序列的正向引物及含有序列号10所示的碱基序列的反向引物。

关于pcr扩增的条件如前所述。

然而，引物集并不限定于具有序列号1～10的序列的物质，例如作为正向引物，只要在3’末端具有从序列号1、3、5、7或9的3’侧末端至向上游的15个碱基为止的序列(参考下表)即可，作为反向引物，只要在3’末端具有从序列号2、4、6、8或10的3’侧末端至向上游的15个碱基为止的序列(参考下表)即可。这样的引物也可为15～50个碱基长、20～45个碱基长的长度。

[表1]

引物集并不限定于具有序列号1～10的序列的物质，例如作为正向引物，只要具有或含有序列号1、3、5、7或9中的任意的连续的15碱基以上的序列即可，作为反向引物，只要具有或含有序列号2、4、6、8或10中的任意的连续的15碱基以上的序列即可。

(1”)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号1中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号2中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

(2”)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号3中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号4中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

(3”)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号5中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号6中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

(4”)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号7中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号8中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物，

或(5”)一种引物集，该引物集包含：具有或含有序列号9中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物及具有或含有序列号10中的任意的连续的15碱基以上的序列的反向引物。这样的引物只要在3’侧末端存在上述任意的连续的15碱基以上的序列，也可为15～50个碱基长、20～45个碱基长、30～65个碱基长的长度。

本发明的筛选方法也可进一步包含对检测出本发明的遗传性状的被实验甜菊植物的组织(例如叶)的rebm的含量进行测定的工序。rebm含量的测定如本发明的植物体的项目中所述。此外，在该方式中，对于从检测出本发明的遗传性状的被实验甜菊植物体中选择rebm的含量高的个体，并将其与其他的甜菊植物体交配而得的子植物体，也可适用本发明的筛选方法。从而，本发明的筛选方法可包含以下1种以上的工序。

(i)从被实验甜菊植物的基因组中检测本发明的遗传性状的工序，

(ii)对检测出本发明的遗传性状的被实验甜菊植物的组织的rebm的含量进行测定的工序，

(iii)从检测出本发明的遗传性状的被实验甜菊植物体中选择rebm的含量高的个体的工序，

(iv)将选中的rebm的含量高的个体与其他的甜菊植物体交配的工序，

(v)从由交配而得的子植物体的基因组中检测本发明的遗传性状的工序，

(vi)对检测出本发明的遗传性状的子植物组织的rebm的含量进行测定的工序，

(vii)从检测出本发明的遗传性状的子植物体中选择rebm的含量高的个体的工序。

进行选择的rebm的含量高的个体，例如可为检测出本发明的遗传性状的被实验甜菊植物体中，关于rebm的含量的高度为前50％为止、前40％为止、前30％为止、前20％为止、前10％为止、前5％为止、前4％为止、前3％为止、前2％为止或前1％为止的个体等。此外，进行交配的其他的甜菊植物体可含有也可不含有本发明的遗传性状。在上述方式中，工序(iv)～(vii)可多次重复。如此可筛选rebm的含量更高的甜菊植物体。

在本发明的筛选方法中，被实验甜菊植物体可以为天然植物体也可以为非转基因植物体。关于非转基因植物体，如本发明的植物体的项目中所述。

在本发明的筛选方法中，被实验甜菊植物体可包含实施了突变诱发处理的甜菊植物及其后代植物。关于突变诱发处理，如本发明的植物体的项目中所述，包含基于诱变剂的处理或基于放射线或光线的照射的处理等。

此外，本发明提供上述记载的引物集，例如，选自上述(1)～(5)、(1’)～(5’)及(1”)～(5”)中的任何一种以上的引物集。本发明进一步提供可通过pcr对具有选自序列号35～44中的碱基序列的区域进行扩增的引物集，例如，含有序列号45的碱基序列的正向引物和含有序列号46的碱基序列的反向引物的引物集、含有序列号47的碱基序列的正向引物和含有序列号48的碱基序列的反向引物的引物集、含有序列号49的碱基序列的正向引物和含有序列号50的碱基序列的反向引物的引物集、含有序列号51的碱基序列的正向引物和含有序列号52的碱基序列的反向引物的引物集、含有序列号53的碱基序列的正向引物和含有序列号54的碱基序列的反向引物的引物集。

进一步本发明提供一种可检测本发明的遗传性状的存在及/或不存在的探针(以下，有时称作「本发明的探针」)。本发明的探针可具有适用于本发明的遗传性状的存在及/或不存在的各种检测方法的结构。例如，本发明的探针可包含与含有本发明的变异部位的基因组的部分具有互补性的碱基序列。作为涉及的探针的非限定例，可列举包含选自序列号55～64中的碱基序列的探针。这些序列中，序列号55、57、59、61及63对于含有本发明的变异的等位基因为特异性的，序列号56、58、60、62及64对于不含有本发明的变异的等位基因为特异性的。本发明的遗传性状的存在可通过含有本发明的变异的等位基因的检出及/或不含有本发明的变异的等位基因的未检出进行检测，本发明的遗传性状的不存在可通过含有本发明的变异的等位基因的未检出及/或不含有本发明的变异的等位基因的检出进行检测。本发明的探针优选具有标记。作为涉及的标记的非限定例，可列举荧光标记、发光标记、放射性标记、色素、酶、失活剂(quencher)、与可以检测的标记结合的部分等。在特定的方式中，本发明的探针具有选自序列号55～64中的碱基序列和标记。

本发明进一步提供一种筛选用试剂盒，该试剂盒含有选自上述(1)～(5)、(1’)～(5’)及(1”)～(5”)中的任何一种以上的引物集，以及根据情况而含有限制酶。

在该试剂盒中，使用选自(1)、(1’)及(1”)中的任何一种以上的引物集时，所述试剂盒中所含限制酶为xbai。

在该试剂盒中，使用选自(2)、(2’)及(2”)中的任何一种以上的引物集时，所述试剂盒中所含限制酶为kpni。

在该试剂盒中，使用选自(3)、(3’)及(3”)中的任何一种以上的引物集时，所述试剂盒中所含限制酶为aflii。

在该试剂盒中，使用选自(5)、(5’)及(5”)中的任何一种以上的引物集时，所述试剂盒中所含限制酶为pvui。

在该试剂盒的其他的方式中，

所述引物集包含具有或含有序列号1中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物时，所述限制酶含有xbai，

所述引物集包含具有或含有序列号3中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物时，所述限制酶含有kpni，

所述引物集包含具有或含有序列号5中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物时，所述限制酶含有aflii，

所述引物集包含具有或含有序列号9中的任意的连续的15碱基以上的序列的正向引物时，所述限制酶含有pvui。

本发明还提供一种筛选用试剂盒，该试剂盒含有：可通过pcr对具有选自序列号35～44中的碱基序列的区域进行扩增的引物集和本发明的探针。

这些引物集、探针及试剂盒可用于本发明的遗传性状的检测，用于本发明的筛选方法等。此外，在这些引物集及试剂盒中可包含记录有以下内容的媒体：包含与本发明的遗传性状的检测或本发明的筛选方法相关的说明的指示，例如，与使用说明书或使用方法相关的信息，该媒体例如为软盘、cd、dvd、蓝光光盘、存储卡、usb存储器等。

5.来自植物体的萃取物的制造方法及使用了该萃取物的制品

在本发明的其他方式中提供一种含有瑞鲍迪苷m的萃取物的制造方法(以下，有时称作“本发明的萃取物的制造方法”)，其特征在于，包含由本发明的植物体或该植物体的种子或叶(例如，干燥叶或新鲜叶)获得萃取物的工序。进一步提供一种瑞鲍迪苷m的制造方法(以下，有时称作“本发明的瑞鲍迪苷m的制造方法”)，其特征在于，包含从根据本发明的萃取物的制造方法而得的萃取物中提纯瑞鲍迪苷m的工序。

具体而言，提供一种瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者的制造方法，其特征在于，包含从本发明的瑞鲍迪苷m富含型甜菊植物体、根据本发明的筛选方法选拔的瑞鲍迪苷m富含型甜菊植物体或根据本发明的方法制造的瑞鲍迪苷m富含型甜菊植物体中获得含有瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者的萃取物的工序。

含有瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者的萃取物可以通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应而得。萃取条件等可以参考ohtaetal.,j.appl.glycosci.，vol.57，no.3(2010)或wo2010/038911中所述的方法或后述的实施例中所述的方法。

此外，对于含有瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者的萃取物，可通过利用乙酸乙酯或其他有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography：hplc)、气相色谱法、飞行时间质谱(time-of-flightmassspectrometry:tof-ms)、超高效液相色谱(ultra(high)performanceliquidchromatography：uplc)等公知的方法提纯瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者。

根据本发明的萃取物的制造方法获得的萃取物(以下称“本发明的萃取物”)与野生型甜菊种相比以更高含量含有瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者。

与从野生型甜菊中获得的萃取物相比本发明的萃取物也可以300％以上、400％以上、500％以上、600％以上、700％以上、800％以上、900％以上、1100％以上、1200％以上、1300％以上、1400％以上、1500％以上、1600％以上、1700％以上、1800％以上、1900％以上、2000％以上、2100％以上、2200％以上、2300％以上、2400％以上、2500％以上、2600％以上、2700％以上、2800％以上、2900％以上、3000％以上、3100％以上、3200％以上、3300％以上、3400％以上、3500％以上、3600％以上、3700％以上、3800％以上、3900％以上、4000％以上、4100％以上、4200％以上、4300％以上、4400％以上、4500％以上、4600％以上、4700％以上、4800％以上、4900％以上、5000％以上的高含量含有瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者。在此，本发明的萃取物和从野生型甜菊种中得到的萃取物可为用相同方法获得的物质。

通过将如此而得的本发明的萃取物及/或根据本发明的瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者的制造方法而得的瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者与其他成分进行混合，可制造提高了瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者的含量的新型医药品、香料或饮食品。于是，作为其他的实施方式，本发明提供一种医药品、香料或饮食品的制造方法，其特征在于，包含将本发明的萃取物及/或根据本发明的瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者的制造方法而得的瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者与其他成分混合的工序。进一步，本发明提供根据上述制造方法而得的提高了瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷d或其两者的含量的新型医药品、香料或饮食品。这里所谓饮食品是指饮料及食品。从而，在某种实施方式中，本发明提供新型的医药品、香料、饮料或食品，此外还提供该医药品、香料、饮料或食品的制造方法。

实施例

以下记载本发明涉及的实验例、实施例等，但本发明并不限定于这些具体的方式。

[实施例1]高rebm甜菊植物的制作

1.育种材料的导入及初期选拔

于2014年8月播种市售甜菊种子，育苗，同年10月～2015年3月为止的期间，根据生长发育状况及叶片形态对约3,000个个体进行选拔。2015年4月通过使用lc-ms/ms的定量分析对获得的115个个体测定各甜菊醇糖苷的含量及含有率，选拔rebd及rebm的含有率较高的3个个体(2个成分总计于tsg中所占比例为20％以上的个体)。同时，根据总甜菊醇糖苷(tsg)含量也进行了选拔，获得tsg收率(从单位叶片干燥物重量中获得的可测定的甜菊醇糖苷的总量)为20％以上的14个个体。

2.自交系的制作及选拔

从上述获得的115个个体中选拔生长发育状况良好的高reba型的5个个体，2015年1月在个体间或个体内实施人工授粉，同年3月实施混播制种获得自交第一代(s1种子)。进一步对这些s1种子进行播种、育苗，得到105个个体的s1种群。2015年6月对这些s1种群各个体进行单独培育，通过个体内的人工授粉获得自交第二代(s2种子)。得到的s2种子以获得的每个s1个体作为体系进行区别获得105体系的s2种群。然后，确认获得的s2个体的生长发育状况，对于生长发育良好的个体采集各个体的叶4枚作为样本，使用lc-ms/ms实施甜菊醇糖苷量的定量分析。根据得到的分析结果，计算rebd含量、rebm含量及tsg量，将叶每100g的rebd含量+rebm含量的总和超过2g(＝2％)的个体选拔为优良个体。

3.杂交系的制作及选拔

将根据成分分析选拔的高rebd且高rebm植物体(3个个体)及高tsg植物体(6个个体)作为培育亲本提供给总计53组的杂交试验。上述选拔个体于2015年4月通过插枝进行营养繁殖同年6月确立成苗，在至同年11月为止的期间进行养护分别确立多株亲株。自2016年1月开始人工交配，各组获得1,000粒左右的杂交种子(f1种子)，然后于同年3月对获得的f1种子进行播种、育苗。然后确认获得的f1个体的生长发育状况，对于生长发育良好的个体采集各个体的叶4枚作为样本，使用lc-ms/ms实施甜菊醇糖苷量的定量分析。根据得到的分析结果，计算rebd含量、rebm含量及tsg量，将rebd含量+rebm含量的总和超过2g/100g(＝2％)的个体选拔为优良个体。

4.遗传标记的制作

使用由初期选拔而得的10个个体进行了遗传标记的制作。2015年6月，基于rebd+rebm含量率的总和分成高(29.16％以上)、低(6.06％以下)两组，在因活化次级代谢产物的生物合成路径而被熟知的wrky编码区域及wd40编码区域上实施各组共通的多态性探索，获得特定的单碱基多态性(snp)。基于获得的snp进行引物设计和限制酶的选择，确立了可识别特定的snp的多态性标记(1)～(5)。

(1)p01

在标记p01的检测中使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(xbai)，于37℃下进行酶促反应，实施基于限制酶的处理。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchipgxtouchht实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行了识别。

引物的序列如下所示。

正向引物：5’-aaggttctttatttttaaacttatgttaatttattgtatctag-3’(序列号1)

反向引物：5’-ccttatgtacacatgctacac-3’(序列号2)

对得到的pcr产物(约383bp长)实施xbai限制酶处理，将未生成约344bp的限制酶处理产物(例如，序列号23)之物作为p01阳性。

(2)p02

在标记p02的检测中使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(kpni)，于37℃下进行酶促反应，实施基于限制酶的处理。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchipgxtouchht实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行了识别。

引物的序列如下所示。

正向引物：5’-taatcatccaaaccctaatctcgccaaacaaccgggtac-3’(序列号3)

反向引物：5’-gaggaagacattggcaactc-3’(序列号4)

对得到的pcr产物(约297bp长)实施kpni限制酶处理，将未生成约260bp的限制酶处理产物(例如，序列号26)之物作为p02阳性。

(3)p03

在标记p03的检测中使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(aflii)，于37℃下进行酶促反应，实施基于限制酶的处理。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchipgxtouchht实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行了识别。

引物的序列如下所示。

正向引物：5’-cgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaacccgcttaa-3’(序列号5)

反向引物：5’-accagcaataatccttgaattag-3’(序列号6)

对得到的pcr产物(约390bp长)实施aflii限制酶处理，将未生成约347bp的限制酶处理产物(例如，序列号29)之物作为p03阳性。

(4)p04

在标记p04的检测中使用以下引物实施pcr。以微芯片型电泳装置labchipgxtouchht使pcr产物电泳，根据电泳后的带型对标记进行了识别。

引物的序列如下所示。

正向引物：5’-cgcaaacacgtatactaatc-3’(序列号7)

反向引物：5’-tttagcatggtatgtacaac-3’(序列号8)

将仅生成约140bp的pcr产物(例如，序列号30)之物作为p04阳性。

(5)p05

在标记p05的检测中使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(pvui)，于37℃下进行酶促反应，实施基于限制酶的处理。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchipgxtouchht实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行了识别。

引物的序列如下所示。

正向引物：5’-atacaaaaacacaacccatatggtcaaatcaacccattcatgagcgatc-3’(序列号9)

反向引物：5’-cccttgtaaatcccatatgtag-3’(序列号10)

对得到的pcr产物(约288bp长)实施pvui限制酶处理，将未生成约240bp的限制酶处理产物(例如，序列号33)之物作为p05阳性。

5.遗传标记的验证

使用上述确立的多态性标记和第i种群，实施了标记的验证实验。实施第i种群192个个体的成分分析，基于rebm含量值选拔前8个个体(0.35％以上)、后8个个体(0.12％以下)，进行上述标记检验。结果仅rebm含量高的前8个个体被选拔为对于目标的多态性持阳性的个体(图1)。

对于第ii种群也进行了同样的验证实验。实施第ii种群137个个体的成分分析，基于rebm含量值选拔前8个个体(0.24％以上)、后8个个体(0.01％以下)，进行上述标记检验。结果仅rebm含量高的前8个个体被选拔为具有目标的多态性的个体(图2)。在图1及2中明确了仅具有高rebm表型的个体生成了目标大小的条带。

6.样本群体的增加

对于在遗传标记的验证时使用的2个分离群体，第i及第ii种群，为了进一步验证，增加个体数进行了实验。包含上述的个体数，分别使用了62个个体、109个个体。基于rebm含量分成0.2％以上、0.1％以上～小于0.2％、0％以上～小于0.1％的3组，实施标记检验得到通过本标记0.2％以上组优先被检测出的结果，证明阳性个体的出现频率在组间在统计学上具有显著性差异(基于卡方检验的适合度检验，无效假设假定为标记检验结果与表型无关，频率分布均等。检验结果参考下表)。

[表2]

第i种群的标记检验结果(62个体)

■使用标记：p02

卡方检验结果(df＝2)36.81^**

[表3]

第i种群的标记检验结果(62个体)

■使用标记：p05

卡方检验结果(df＝2)36.81^**

[表4]

第ii种群的标记检验结果(109个体)

■使用标记：p02

卡方检验结果(df＝2)75.94^**

[表5]

第ii种群的标记检验结果(109个体)

■使用标记：p05

卡方检验结果(df＝2)18.81^**

7.高rebm植物体的选拔

使用上述所得的遗传标记对高rebm植物体进行选拔时，在验证用群体以外的分离群体中如下表所示也可选拔rebm比率为2％以上的个体，确认了上述所得的遗传标记可为实用的选拔标记。高rebm植物体的选拔结果如下表所示。表中的「○」表示标记检验结果为阳性。

[表6]

工业实用性

由于根据本发明可更有效地提供瑞鲍迪苷m及d，因此通过含有充分的量的瑞鲍迪苷m及d可提供优质的味道的医药品、香料或饮食品等。

序列表

<110>suntoryholdingslimited

<120>富含瑞鲍迪苷m的甜菊植物

<130>g1806wo

<150>jp2017-198515

<151>2017-10-12

<160>84

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>1

aaggttctttatttttaaacttatgttaatttattgtatctag43

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>2

ccttatgtacacatgctacac21

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>3

taatcatccaaaccctaatctcgccaaacaaccgggtac39

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>4

gaggaagacattggcaactc20

<210>5

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>5

cgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaacccgcttaa47

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>6

accagcaataatccttgaattag23

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>7

cgcaaacacgtatactaatc20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>8

tttagcatggtatgtacaac20

<210>9

<211>49

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>9

atacaaaaacacaacccatatggtcaaatcaacccattcatgagcgatc49

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>10

cccttgtaaatcccatatgtag22

<210>11

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>11

atttattgtatctag15

<210>12

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>12

gtacacatgctacac15

<210>13

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>13

caaacaaccgggtac15

<210>14

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>14

agacattggcaactc15

<210>15

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>15

acgaaacccgcttaa15

<210>16

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>16

taatccttgaattag15

<210>17

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>17

acacgtatactaatc15

<210>18

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>18

catggtatgtacaac15

<210>19

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>19

cattcatgagcgatc15

<210>20

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>20

aaatcccatatgtag15

<210>21

<211>383

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>21

aaggttctttatttttaaacttatgttaatttattgtatctagtagttaatcaagagatg60

ctctcttggagaaattttatggtcataaaacctatatcaaagagatgctctcttggtata120

ttccatacttaaaatatctattttggaaaaaaagtgtagcatcttcctgcttttagtagg180

tgtcaatcattattaaatttcacaaaaccgtgcaagaatcccagtttccctatagtttgt240

atacgttcctgatctagtattttacttatgtttcaaatcaatccaatcatgcttgtgtcc300

gaaaattaaaaaacaagggtattggatgccctgtaccactattattaacttttcagaaaa360

acgtgtagcatgtgtacataagg383

<210>22

<211>383

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>22

aaggttctttatttttaaacttatgttaatttattgtatctagaagttaatcaagagatg60

ctctcttggagaaattttatggtcataaaacctatatcaaagagatgctctcttggtata120

ttccatacttaaaatatctattttggaaaaaaagtgtagcatcttcctgcttttagtagg180

tgtcaatcattattaaatttcacaaaaccgtgcaagaatcccagtttccctatagtttgt240

atacgttcctgatctagtattttacttatgtttcaaatcagtccaatcatgcttgtgtcc300

gaaaattaaaaaacaagggtattggatgccctgtaccactattattaacttttcagaaaa360

acgtgtagcatgtgtacataagg383

<210>23

<211>344

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>23

ctagaagttaatcaagagatgctctcttggagaaattttatggtcataaaacctatatca60

aagagatgctctcttggtatattccatacttaaaatatctattttggaaaaaaagtgtag120

catcttcctgcttttagtaggtgtcaatcattattaaatttcacaaaaccgtgcaagaat180

cccagtttccctatagtttgtatacgttcctgatctagtattttacttatgtttcaaatc240

agtccaatcatgcttgtgtccgaaaattaaaaaacaagggtattggatgccctgtaccac300

tattattaacttttcagaaaaacgtgtagcatgtgtacataagg344

<210>24

<211>297

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>24

taatcatccaaaccctaatctcgccaaacaaccgggtactgatccaaaccctgaaatgag60

cacaactcttgaacctgatcacgagaatgaagagcacaaacatgttatgacacatgtaaa120

cgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaacccgtttaactgtaaatcttga180

aaacacattctttgatgaaaaacccctttcgtatccggatcttatggacttttctgcatc240

gaaaacggacgaatacgacttctatgatgaacttgaagagctgccaatgtcttcctc297

<210>25

<211>297

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>25

taatcatccaaaccctaatctcgccaaacaaccgggtaccgatccaaaccctgaaatgag60

cacaactcttgaacctgatcacgagaatgaagagcacaaacatgttatgacacatgtaaa120

cgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaacccgtttaagtgtaaatcttga180

aaacacattctttgatgaagaacccctttcgtatccggatcttatggacttttctgcatc240

gaaaaaggacgaatacgacttctatgatgaacttgaagagttgccaatgtcttcctc297

<210>26

<211>258

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>26

cgatccaaaccctgaaatgagcacaactcttgaacctgatcacgagaatgaagagcacaa60

acatgttatgacacatgtaaacgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaac120

ccgtttaagtgtaaatcttgaaaacacattctttgatgaagaacccctttcgtatccgga180

tcttatggacttttctgcatcgaaaaaggacgaatacgacttctatgatgaacttgaaga240

gttgccaatgtcttcctc258

<210>27

<211>390

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>27

cgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaacccgcttaactgtaaatcttga60

aaacacattctttgatgaaaaacccctttcgtatccggatcttatggacttttctgcatc120

gaaaacggacgaatacgacttctatgatgaacttgaagagctgccaatgtcttcctcatc180

attcaaaagcttcatgagaagtaatttctttgaggaaagagttcttgttcaaccttattg240

attaagaatttaagggaagcagattatatatgtaattaaattttggtatttatactttga300

acttaattaataattataataataatcccaactagaggcacttagtggagattacttata360

tataatactaattcaaggattattgctggt390

<210>28

<211>390

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>28

cgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaacccgcttaagtgtaaatcttga60

aaacacattctttgatgaagaacccctttcgtatccggatcttatggacttttctgcatc120

gaaaaaggacgaatacgacttctatgatgaacttgaagagttgccaatgtcttcctcatc180

attcaaaagcttcatgagaagtaatttctttgaggaaagagttcttgttcaaccttattg240

attaagaatttaagggaagcagattatatatgtaattaaattttggtatttatactttga300

acttaattaataattataataataatcccaactagaggcacttagtggagattacttata360

tataatactaattcaaggattattgctggt390

<210>29

<211>347

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>29

ttaagtgtaaatcttgaaaacacattctttgatgaagaacccctttcgtatccggatctt60

atggacttttctgcatcgaaaaaggacgaatacgacttctatgatgaacttgaagagttg120

ccaatgtcttcctcatcattcaaaagcttcatgagaagtaatttctttgaggaaagagtt180

cttgttcaaccttattgattaagaatttaagggaagcagattatatatgtaattaaattt240

tggtatttatactttgaacttaattaataattataataataatcccaactagaggcactt300

agtggagattacttatatataatactaattcaaggattattgctggt347

<210>30

<211>140

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>30

cgcaaacacgtatactaatcacgtaacatattttttatttctaaattaaaatttgaatta60

aagataacataatatttatttttagagtgtaacttctaaaaaatatcaacctacgaaaaa120

gttgtacataccatgctaaa140

<210>31

<211>288

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>31

atacaaaaacacaacccatatggtcaaatcaacccattcatgagcgatcaggtcaaattc60

gctatctgagctgatgcattcaactatttggtctctttttaacatttattttttttatta120

ttttgaatgtagaaactttggaactactcaactggtaagttcttgaagatgtataccggt180

catgtaaacaaaacatattgtataactccgactttttctgtaacaaatggaaaatatatt240

gttagtggttcagaagatcattgtgtctacatatgggatttacaaggg288

<210>32

<211>288

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>32

atacaaaaacacaacccatatggtcaaatcaacccattcatgagcgatcgggtcaaattc60

gctatctgagctgatgcattcaactatttggtctctttttaacatttattttttttatta120

ttttgaatgtagaaactttggaactactcaactggtaagttcttgaagatgtataccggt180

catgtaaacaaaacatattgtataactccgactttttctgtaacaaatggaaaatatatt240

gttagtggttcagaagatcattgtgtctacatatgggatttacaaggg288

<210>33

<211>240

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>33

cgggtcaaattcgctatctgagctgatgcattcaactatttggtctctttttaacattta60

ttttttttattattttgaatgtagaaactttggaactactcaactggtaagttcttgaag120

atgtataccggtcatgtaaacaaaacatattgtataactccgactttttctgtaacaaat180

ggaaaatatattgttagtggttcagaagatcattgtgtctacatatgggatttacaaggg240

<210>34

<211>158

<212>dna

<213>人工序列

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<223>合成dna

<400>34

cgcaaacacgtatactaatcacgtaacatattttttatttctaaattaaaattttataac60

aatatcatacttgaattaaagataacataatatttatttttagagtgtaacttctaaaaa120

atatcaacctacgaaaaagttgtacataccatgctaaa158

<210>35

<211>141

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>35

aaggttctttatttttaaacttatgttaatttattgtatcttgtagttaatcaagagatg60

ctctcttggagaaattttatggtcataaaacctatatcaaagagatgctctcttggtata120

ttccatacttaaaatatctat141

<210>36

<211>141

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>36

aaggttctttatttttaaacttatgttaatttattgtatcttgaagttaatcaagagatg60

ctctcttggagaaattttatggtcataaaacctatatcaaagagatgctctcttggtata120

ttccatacttaaaatatctat141

<210>37

<211>137

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>37

taatcatccaaaccctaatctcgccaaacaaccgaatactgatccaaaccctgaaatgag60

cacaactcttgaacctgatcacgagaatgaagagcacaaacatgttatgacacatgtaaa120

cgatggtttttgctaca137

<210>38

<211>137

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>38

taatcatccaaaccctaatctcgccaaacaaccgaataccgatccaaaccctgaaatgag60

cacaactcttgaacctgatcacgagaatgaagagcacaaacatgttatgacacatgtaaa120

cgatggtttttgctaca137

<210>39

<211>137

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>39

cgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaacccgtttaactgtaaatcttga60

aaacacattctttgatgaagaacccctttcgtatccggatcttatggacttttctgcatc120

gaaaaaggacgaatacg137

<210>40

<211>137

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>40

cgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaacccgtttaagtgtaaatcttga60

aaacacattctttgatgaagaacccctttcgtatccggatcttatggacttttctgcatc120

gaaaaaggacgaatacg137

<210>41

<211>140

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>41

cgcaaacacgtatactaatcacgtaacatattttttatttctaaattaaaatttgaatta60

aagataacataatatttatttttagagtgtaacttctaaaaaatatcaacctacgaaaaa120

gttgtacataccatgctaaa140

<210>42

<211>158

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>42

cgcaaacacgtatactaatcacgtaacatattttttatttctaaattaaaattttataac60

aatatcatacttgaattaaagataacataatatttatttttagagtgtaacttctaaaaa120

atatcaacctacgaaaaagttgtacataccatgctaaa158

<210>43

<211>139

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>43

atacaaaaacacaacccatatggtcaaatcaacccattcatgagtaatcaggtcaaattc60

gctatctgagctgatgcattcaactatttggtctctttttaacatttattttttttatta120

ttttgaatgtagaaacttt139

<210>44

<211>139

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>44

atacaaaaacacaacccatatggtcaaatcaacccattcatgagtaatcgggtcaaattc60

gctatctgagctgatgcattcaactatttggtctctttttaacatttattttttttatta120

ttttgaatgtagaaacttt139

<210>45

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>45

aaggttctttatttt15

<210>46

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>46

atagatattttaagt15

<210>47

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>47

taatcatccaaaccc15

<210>48

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>48

tgtagcaaaaaccat15

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<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

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<210>50

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>50

cgtattcgtcctttt15

<210>51

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>51

cgcaaacacgtatac15

<210>52

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

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tttagcatggtatgt15

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<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>53

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<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

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aaagtttctacattc15

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

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ttgtatcttgtagttaatcaa21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>合成dna

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aaccgaataccgatccaaacc21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

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acccgtttaactgtaaatctt21

<210>60

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>21

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<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<210>66

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

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tgttaatttattgtatcttgaagttaatcaagagatgctct41

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<211>41

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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agaagacgaaacccgtttaagtgtaaatcttgaaaacacat41

<210>71

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<212>dna

<213>人工序列

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ttatttctaaattaaaatttgaattaaagataacataata40

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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ttatttctaaattaaaattttataacaatatcatacttgaattaaagataacataata58

<210>73

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

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<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<213>人工序列

<220>

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a61

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<211>61

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<213>人工序列

<220>

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a61

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<213>人工序列

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t61

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t61

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<213>人工序列

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<223>合成dna

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a61

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<211>61

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<213>人工序列

<220>

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a61

<210>81

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<213>人工序列

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<213>人工序列

<220>

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<400>82

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acataatatttattttta78

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<211>61

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<220>

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t61

<210>84

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<213>人工序列

<220>

<223>合成dna

<400>84

atggtcaaatcaacccattcatgagtaatcgggtcaaattcgctatctgagctgatgcat60

t61