一种东革阿里不定根的生物反应器培养体系的方法与流程

本发明涉及一种东革阿里药物的培养体系，具体为一种东革阿里不定根的生物反应器培养体系的方法。

背景技术：

东革阿里是世界上有名的药用植物，主要具有壮阳的功效，在原产地马来西亚已被定为保护种。东革阿里繁殖方式主要为种子繁殖，但由于其自然结实率和种子发芽率低、周期长(5-25年)，目前基本是野生状态，远远不能满足药用市场对其根的需求水平。东革阿里在国内的引种栽培研究尚处在初始阶段。因此，利用生物技术开发东革阿里天然药物资源，生产有效代谢物具有重要意义。

目前，利用植物组织培养手段获得的不定根遗传稳定性高、有效物质含量稳定、具有较高的安全性，因此不定根培养成为快速获得药用植物活性成分的有效方法。研究表明，在东革阿里有效代谢物的生产上，通过东革阿里细胞培养已获得了eurycomanone(nhannguyenhuu和locnguyenhoang，2017)、9-methoxycanthin-6-one(roslin.等，2009)、9-hydroxycanthin-6-one(luthfiazizm.s.等，2009)及总酚、总黄酮(shimkyuman等，2015)。但大量试验表明，细胞培养存在着有效物质含量不稳定的弊端，而不定根培养可以解决这一问题，由于根培养中细胞的高度分化使得有效代谢物的合成能力明显提高，同时表现出明显的代谢稳定性和活力的稳定性(李慧娟等，2011；李铁军等，2013)。然而有关东革阿里不定根培养方面的研究很少，就taolulu等(2015)利用3l生物反应器进行了研究，只探明了培养基中生长素和不同氮形态比例对不定根生长及总酚、总黄酮积累的影响。而本项目在此基础上利用5l生物反应器系统地进行了培养基条件的优化研究，探明反应器内不定根的培养机制，建立适合于东革阿里不定根培养的工艺，通过确认不定根中的eurycomanone物质和20l反应器的扩大培养，实现了东革阿里不定根的规模化生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种东革阿里不定根的生物反应器培养体系的方法，其建立了东革阿里不定根的生物反应器(5l)培养体系，进行了20l生物反应器扩大培养，并在生物反应器培养7周的东革阿里不定根中均检测到eurycomanone.eurycomanone是东革阿里植物的生物标志，因此本发明可为替代野生东革阿里植物生产次生代谢物的有效途径。

本发明采用的技术方案如下：一种东革阿里不定根的生物反应器培养体系的方法，通过植物生长物质、培养基种类、培养基中nh4⁺：no3^-及生长周期对不定根生长的影响研究和反应器培养中底物ph、阴阳离子、糖等参数变化与生物量的相关性分析，建立了东革阿里不定根的5l生物反应器培养体系；其特征在于方法步骤如下：

(1)选取高产、均匀一致的东革阿里不定根为材料；

(2)不定根气升式生物反应器悬浮培养；

(3)利用5l生物反应器系统地进行影响不定根生长的因素研究；

(4)确定反应器优化的培养体系；

(5)利用esi-ms/ms确定含有eurycomanone物质的东革阿里不定根系；

(6)不定根培养从5l反应器扩大到20l。

步骤(1)中具体方法为：

(1)以从种子发芽的东革阿里试管苗为原材料，利用子叶诱导不定根；

(2)不定根诱导培养基为ms+3.0mgl^-1iba+30gl^-1sucrose+2.3gl^-1gelrite；获得的不定根系通过流式细胞仪倍性分析筛选出遗传性状稳定、生长均一、生物产量高的不定根系，解决培养材料在长期继代培养中变异的可能性；

(3)在500ml三角瓶中，加入ms+3mgl^-1iba+30gl^-1sucrose的液体培养基250ml，每瓶中接种6gl^-1不定根；三角瓶放置在旋转速度为100rpm的振荡器上,进行暗培养，每7周继代一次，作为试验材料。

步骤(2)中具体方法为：将24g东革阿里不定根接种于含有ms+3mgl^-1iba+30gl^-1sucrose的4l液体培养基的5l气升式生物反应器内进行暗培养，空气注入量为0.1vvm，培养温度为23±2℃，培养7周后将不定根取出切成1cm大小作为用于试验材料。

步骤(3)中利用5l生物反应器系统地进行影响不定根生长的因素研究：植物生长物质、培养基种类、培养基中nh4⁺：no3^-及生长周期对不定根生长的影响研究；反应器培养中底物ph、阴阳离子、糖等参数变化与生物量的相关性分析。

生长素iba和naa浓度设置为1、3、5、7和9mgl^-1，在确定最佳生长素种类和浓度后，加入细胞分裂素不同浓度的kinetin(0.1、0.5、1.0和2.0mgl^-1)和tdz(0.01、0.05、0.1和0.2mgl^-1)，确定最佳的生长素和细胞分裂素的组合。试验采用250ml三角瓶，每个三角瓶中加入ms+30gl^-1sucrose+生长素/细胞分裂素的70ml的培养基，接种密度为6gl^-1，进行暗培养。培养7周后调查不定根干重、鲜重及总酚、总黄酮含量。

确定最佳的生长素和细胞分裂素的组合后，试验利用5l生物反应器，每个反应器中加入3000ml的培养基，接种密度为6gl^-1，空气流量为0.1vvm(airvolume/culturevolume/min)。将培养基种类设置为3/4ms、ms、dkw、wpm和b5，培养基的其它成分为30gl^-1sucrose+3mgl^-1iba。暗培养7周后调查不定根干重、鲜重、总酚、总黄酮和大量元素含量及培养基中的阴阳离子浓度、糖、ec和水势。

确定最佳的培养基后，把3/4ms培养基中nh4⁺：no3^-设置为0:45、7.5：37.5、15:30、22.5:22.5、30:15、37.5:7.5、45:0，培养基的其它成分为30gl^-1sucrose+3mgl^-1iba。其它试验方法及条件同培养基种类试验。

为了探讨不同培养时期不定根生长和总酚、总黄酮积累的变化，在5l生物反应器中加入3/4ms+30gl^-1sucrose+iba3mgl^-1的培养基3000ml，在培养2、4、6、7周后分别调查不定根干重、鲜重、总酚、总黄酮和大量元素含量及培养基中的阴阳离子浓度、糖、ec。

步骤(4)中具体方法为：建立适合于东革阿里不定根培养的5l生物反应器培养体系；

(1)利用5l气升式生物反应器，在nh4⁺：no3^-为15:30mm的3/4ms培养基中加入3.0mgl^-1iba，30gl^-1sucrose，接种密度为6gl^-1，空气注入量为0.1vvm的条件下培养7周时，东革阿里不定根的生长量和总酚、总黄酮含量最高；

(2)培养7周后，获得的干物重和鲜重各为4.65gl^-1和50.45gl^-1；总酚和总黄酮含量各5.23mgg^-1dw、2mgg^-1dw；不定根中大量元素含量分别是：t-n为2.78％，p为1.16％，k为5.03％，ca为0.12％，mg为0.10％；

(3)不定根生长和底物消耗的动态研究中，在保持n素水平的基础上适量的nh4⁺-n比例有利于不定根生长，高浓度的so4^2-和ca²⁺抑制不定根对离子的吸收；培养基动态变化中，随着生物量的增加，可以看出nh4⁺、k⁺、no3^-、so4^2-、hpo4^-等离子浓度的降低，其中hpo4^-的吸收最为迅速，培养2周后为0；培养2周后培养基中无蔗糖，主要以果糖和葡萄糖形式被利用。

步骤(5)中具体方法为：确定不定根中eurycomanone物质：采用esi-ms/ms法对东革阿里野生根和生物反应器内培养7周的东革阿里不定根进行eurycomanone物质的分析鉴定结果表明，在东革阿里野生根和不定根中都检测到eurycomanone物质。

步骤(6)中具体方法为：在5l生物反应器培养的基础上，利用20l生物反应器进行东革阿里不定根培养，20l反应器中加入3/4ms+3mgl^-1iba+30gl^-1sucrose的液体培养基14l，接种密度为6gl^-1,空气流量为0.1vvm；暗培养7周后调查不定根干重、鲜重、总酚和总黄酮含量及eurycomanone物质的检测；结果表明，不同容积反应器对不定根的生长及总酚、总黄酮积累无显著性差异；通过esi-ms/ms分析，确定20l反应器内培养7周的东革阿里不定根中含有eurycomanone物质；从而验证了5l反应器培养东革阿里不定根的条件基本适用于20l反应器的扩大培养，为东革阿里规模化生产提供理论依据与技术支撑。

本发明的有益效果是：1.本方法培养的东革阿里不定根的生产周期是49天，不受季节、气候、土壤条件的制约，避免农药残留和重金属含量超标，适用于高品质东革阿里原材料的规模化周年生产上，可达到解决资源短缺的问题和野生资源的永续利用目的。2.通过本方法可获得东革阿里的eurycomanone及其它有效代谢物，能实现天然有效代谢物的标准化及规模化生产，从而为东革阿里新药开发提供安全、高效的原材料。

附图说明

图1为本发明东革阿里不定根的生物反应器培养体系的流程图。

具体实施方式

如图1所示，一种东革阿里不定根的生物反应器培养体系的方法，通过植物生长物质、培养基种类、培养基中nh4⁺：no3^-及生长周期对不定根生长的影响研究和反应器培养中底物ph、阴阳离子、糖等参数变化与生物量的相关性分析，建立了东革阿里不定根的5l生物反应器培养体系；利用esi-ms/ms确定含有生物标志物质(eurycomanone)的不定根系；并将不定根培养从5l反应器扩大到20l；其特征在于方法步骤如下：

(1)选取高产、均匀一致的东革阿里不定根为材料；

(2)不定根气升式生物反应器悬浮培养；

(3)利用5l生物反应器系统地进行影响不定根生长的因素研究；

(4)确定反应器优化的培养体系；

(5)利用esi-ms/ms确定含有eurycomanone物质的东革阿里不定根系；

(6)不定根培养从5l反应器扩大到20l。

步骤(1)中具体方法为：

(1)以从种子发芽的东革阿里试管苗为原材料，利用子叶诱导不定根；

(2)不定根诱导培养基为ms+3.0mgl^-1iba+30gl^-1sucrose+2.3gl^-1gelrite；获得的不定根系通过流式细胞仪倍性分析筛选出遗传性状稳定、生长均一、生物产量高的不定根系，解决培养材料在长期继代培养中变异的可能性；

(3)在500ml三角瓶中，加入ms+3mgl^-1iba+30gl^-1sucrose的液体培养基250ml，每瓶中接种6gl^-1不定根；三角瓶放置在旋转速度为100rpm的振荡器上,进行暗培养，每7周继代一次，作为试验材料。

步骤(2)中具体方法为：将24g东革阿里不定根接种于含有ms+3mgl^-1iba+30gl^-1sucrose的4l液体培养基的5l气升式生物反应器内进行暗培养，空气注入量为0.1vvm，培养温度为23±2℃，培养7周后将不定根取出切成1cm大小作为用于试验材料。

步骤(3)中利用5l生物反应器系统地进行影响不定根生长的因素研究：植物生长物质、培养基种类、培养基中nh4⁺：no3^-及生长周期对不定根生长的影响研究；反应器培养中底物ph、阴阳离子、糖等参数变化与生物量的相关性分析；调查项目：1、生物量(鲜重、干重)，2、不定根中的总酚、总黄酮及大量元素含量测定，3、培养基中的阴阳离子浓度、糖、ec、ph和水势。

步骤(4)中具体方法为：建立适合于东革阿里不定根培养的5l生物反应器培养体系；

(1)利用5l气升式生物反应器，在nh4⁺：no3^-为15:30mm的3/4ms培养基中加入3.0mgl^-1iba，30gl^-1sucrose，接种密度为6gl^-1，空气注入量为0.1vvm的条件下培养7周时，东革阿里不定根的生长量和总酚、总黄酮含量最高；

(2)培养7周后，获得的干物重和鲜重各为4.65gl^-1和50.45gl^-1；总酚和总黄酮含量各5.23mgg^-1dw、2mgg^-1dw；不定根中大量元素含量分别是：t-n为2.78％，p为1.16％，k为5.03％，ca为0.12％，mg为0.10％；

(3)不定根生长和底物消耗的动态研究中，在保持n素水平的基础上适量的nh4⁺-n比例有利于不定根生长，高浓度的so4^2-和ca²⁺抑制不定根对离子的吸收；培养基动态变化中，随着生物量的增加，可以看出nh4⁺、k⁺、no3^-、so4^2-、hpo4^-等离子浓度的降低，其中hpo4^-的吸收最为迅速，培养2周后为0；培养2周后培养基中无蔗糖，主要以果糖和葡萄糖形式被利用。

步骤(5)中具体方法为：确定不定根中eurycomanone物质：采用esi-ms/ms法对东革阿里野生根和生物反应器内培养7周的东革阿里不定根进行eurycomanone物质的分析鉴定结果表明，在东革阿里野生根和不定根中都检测到eurycomanone物质。

步骤(6)中具体方法为：在5l生物反应器培养的基础上，利用20l生物反应器进行东革阿里不定根培养，20l反应器中加入3/4ms+3mgl^-1iba+30gl^-1sucrose的液体培养基14l，接种密度为6gl^-1,空气流量为0.1vvm；暗培养7周后调查不定根干重、鲜重、总酚和总黄酮含量及eurycomanone物质的检测；结果表明，不同容积反应器对不定根的生长及总酚、总黄酮积累无显著性差异；通过esi-ms/ms分析，确定20l反应器内培养7周的东革阿里不定根中含有eurycomanone物质；从而验证了5l反应器培养东革阿里不定根的条件基本适用于20l反应器的扩大培养，为东革阿里规模化生产提供理论依据与技术支撑。

eurycomanone是东革阿里的一种主要活性成分，也是标志性有效物质，它能使补中益神、壮阳、提高体力等效果。该项目利用生物反应器技术，通过高产不定根系诱导和对培养基条件(生长素种类及浓度、细胞分裂素种类及浓度、培养基种类、nh4⁺：no3^-、生长周期)的系统研究，并对优化条件下培养的不定根进行eurycomanone物质的检测，最终实现了东革阿里不定根及eurycomanone的大规模生产(20l)。