一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法与流程

本发明涉及一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法。

背景技术：

百子莲‘bigblue’(agapanthuspraecoxssp.orientalis‘bigblue’)又名“蓝百合”、“非洲百合”，原产非洲南部，为单子叶多年生草本花卉，具有较强的观赏性。近半个世纪以来，百子莲在国际花卉业发展中脱颖而出，成为风靡全球的鲜切花、盆栽及地被花卉，并体现出极佳的观赏价值。此外，百子莲抗性极强，在道路绿化、土壤修复领域具有巨大的发展空间，目前市场上种苗供不应求。

百子莲在原产地南非常用种子或分株繁殖，但引种国内后存在发芽率低，繁殖周期长，繁殖系数低及后代易分化等缺点。组织培养是保持百子莲优良性状、获得大量种苗的重要途径。目前百子莲的组织培养分为器官发生途径和体细胞胚胎发生途径两大类。其中器官途径已经应用于产业化生产，但也存在诸多问题，例如繁殖系数较低，成苗周期长等。而体细胞胚胎发生途径具有数量多、繁殖快、结构完整、植株再生率高以及不受季节影响等特点，因此被认为是百子莲无性扩繁和种质保存的较佳途径。

因为小花梗无菌处理比较容易，诱导愈伤组织相对快捷，国内以百子莲进行体胚诱导的外植体多选择小花梗，但小花梗的取材有较大局限性，每年仅5～6月份百子莲蕾期方可取材，而且胚性细胞的诱导周期较长，达9个月之久。而百子莲的叶片可取材料多，取材方便，不受发育周期及季节限制，四季均可培养。因此，相对于小花梗，利用叶片诱导出愈伤组织，进而诱导出胚性细胞具有较大的应用价值，以叶片作为外植体的体胚发生途径对百子莲快繁是较佳途径。

国内的一些研究表明，通过叶片作为外植体，以2,4-d作为主要生长调节剂并未获得愈伤组织。在组织培养研究中，单子叶植物通常比双子叶植物更难形成愈伤组织，而pic可以作为外源生长素类物质降低单子叶植物组织培养的难度。碳源是植物组织培养过程中的最重要因素之一，糖作为碳源，不仅为细胞提供合成新化合物的碳骨架，而且为细胞的生理代谢提供底物与能量。植物组织培养一般采用蔗糖、葡萄、麦芽糖、果糖等作为碳源，不同种类及浓度的碳源对愈伤组织的诱导效果也不相同。而百子莲以往的研究中，仅仅以蔗糖作为碳源，其他种类碳源对百子莲组培、体胚诱导的效果并未见报道。

本发明根据前期研究基础，试图改变前期依赖小花梗取材的局限性，利用叶片作为外植体进行愈伤组织的诱导。同时，本发明通过调控激素及碳源的种类和水平，拟解决百子莲胚性细胞诱导周期长、诱导率较低的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法。本发明根据单子叶植物再生潜能细胞的分布特点，利用叶片基部分生区组织作为外植体进行愈伤组织的诱导，突破国内目前愈伤组织只能利用小花梗进行诱导的局限性；本发明利用单子叶植物特异性生长素类物质pic作为主要诱导激素，克服了单子叶植物叶片愈伤组织诱导困难的问题；根据植物体胚发生过程中碳源调控的规律以及单子叶植物体胚发生的特点，本发明利用蔗糖、葡萄糖以及麦芽糖作为碳源，通过种类和浓度配比的切换，改变了传统组织培养和体胚途径仅以蔗糖作为碳源的方法，提高了愈伤组织、胚性愈伤组织的诱导率，缩短了胚性细胞的诱导周期。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，包括以下步骤：

a、取百子莲的叶片冲洗消毒，去除外部2～3片包裹的老叶，并切掉上下两端的组织，得叶片基部组织；

b、将叶片基部组织切块后接种于愈伤组织诱导培养基中进行培养；

c、将经步骤b培养后获得的带有残留叶片组织的愈伤组织块放置在愈伤组织继代培养基上进行继代培养；

d、将经步骤c培养后获得的愈伤组织块防治在胚性愈伤组织诱导培养基上进行培养，得含胚性细胞的愈伤组织块。

优选地，步骤a中，所述百子莲的叶片为离根茎连接部位0～2.0cm处的叶片，大于2cm的部位缺乏分生能力，较难诱导愈伤组织；所述百子莲为2～3年生百子莲。

优选地，步骤a中，所述冲洗消毒的具体步骤如下：将百子莲的叶片流水冲洗90～150min后置于超净工作台，75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddh2o冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddh2o冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddh2o冲洗3～5次。

优选地，所述愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、胚性愈伤组织诱导培养基中均添加外源生长素pic。

优选地，步骤b中，所述叶片基部组织切块后的尺寸为0.5～0.8cm；所述培养条件为：温度22～28℃，暗培养25～35天。

优选地，步骤b中，所述愈伤组织诱导培养基的组分包括：4.43g·l^-1ms固体培养基、1.5～2.0mg·l^-1pic、2.5～3.5％(w/v)蔗糖、0.8～1.0％(w/v)琼脂，所述培养基的ph为5.8。

优选地，所述愈伤组织诱导培养基的制备方法包括以下步骤：

每升ddh2o中加入4.43gms固体培养基干粉，溶解后加入pic溶液、蔗糖、琼脂，调节ph值为5.8；获得的培养基灭菌处理后分装，冷却凝固。

优选地，步骤c中，所述继代培养条件为：温度22～28℃，暗培养，培养周期为55～65d，继代培养2次。

优选地，步骤c中，所述愈伤组织继代培养基的组分包括：4.43g·l^-1ms固体培养基、1.0～1.5mg·l^-1pic、2％(w/v)蔗糖、1％(w/v)麦芽糖、0.8～1％(w/v)琼脂，ph5.8。

优选地，步骤d中，所述培养条件为温度22～28℃，暗培养55～65d。

优选地，步骤d中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组分包括：4.43g·l^-1ms固体培养基、1.0～1.5mg·l^-1pic、2％(w/v)葡萄糖、2％(w/v)麦芽糖、0.8～1％(w/v)琼脂，ph5.8。

本发明中所述愈伤组织(callus)是指植物体局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体多种组织的活细胞。

所述胚性细胞即胚性愈伤组织细胞，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢；从细胞学来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小，原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强，具有萌发成为体细胞胚胎的能力。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

百子莲在国内的组培和体细胞胚胎途径快繁中，一般用小花梗取材，但小花梗取材每年仅可在花期进行，而本发明的叶片取材可进行周年进行。

部分方法采用鳞茎盘作为外植体进行取材，但是鳞茎盘的数量较少，每株仅有一个，而本发明的取材外植体为叶片，数量较多，以2年生幼苗为例，每株都有10片以上的叶片。

部分报道也尝试用叶片取材，但未获得或极少获得愈伤组织，而本发明利用叶片分生区再生潜能细胞特性，愈伤组织诱导率达到了92.60％。

本发明之前，国内没有以叶片为外植体进行胚性细胞诱导的先例，而本发明在叶基部组织诱导愈伤组织的基础上，成功进行了胚性细胞的诱导，胚性细胞诱导率达到76.36％。

小花梗为外植体进行胚性细胞诱导的周期为9个月以上，本发明提供的叶片作为外植体进行胚性细胞诱导的周期为6～7个月。

本发明以pic作为外源生长素，对百子莲愈伤组织诱导的特异性更强。

本发明突破了传统组培仅以蔗糖作为碳源的培养基配方，利用蔗糖、葡萄糖以及麦芽糖作为碳源，通过种类和浓度配比的调控，提高了愈伤组织、胚性愈伤组织的诱导率，并缩短了胚性细胞的诱导周期。

由于取材方便，诱导周期短，本发明进行胚性细胞诱导成苗较快，避免了胚性细胞的长期继代过程，因此减少了畸形苗的发生。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明实施例1中叶片基部诱导愈伤组织图；其中，图1a为叶片作为外植体的愈伤诱导；图1b为图1a的局部放大图；

图2为本发明实施例1中叶片基部诱导胚性愈伤组织图；

图3为本发明实施例1中胚性愈伤组织细胞形态观察；

图4为本发明实施例1中胚性细胞的诱导成苗图；其中，图4a为30d后的形态观察图；图4b为2个月后的形态观察图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，具体步骤如下：

外植体的取材：用手术刀片切取2年生百子莲离根茎连接部位0～2.0cm处的叶片。将百子莲的叶片流水冲洗90～150min后置于超净工作台，75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddh2o冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddh2o冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddh2o冲洗3～5次，无菌滤纸吸干叶片表面的水分，利用手术刀切去叶片外围的组织(包括上下两端的组织以及2～3片包裹的老叶)，用手术刀将所得的叶片基部组织切成0.5～0.8cm的小块。

愈伤组织诱导培养基的制备：每升ddh2o加入4.43gms固体培养基(sigma)干粉，溶解后加入2.0mg·l^-1的pic溶液(母液浓度为100mg·l^-1，用naoh助溶)，调节ph值为5.8，蔗糖浓度为3％(w/v)，琼脂浓度为1％(w/v)。培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌处理25min后拿到超净工作台内分装，冷却凝固后，进行外植体的接种。

愈伤组织的诱导：取0.5～0.8cm的叶片基部组织小块平放状态接种于愈伤组织诱导培养基平板上，培养基组分包括：ms+2.0mg·l^-1pic+3％(w/v)蔗糖+1％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度25℃，暗培养。培养15d可现白色半透明的愈伤组织(图1)生成，愈伤组织诱导率为92.60％，30天后进行愈伤组织的继代培养。

愈伤组织的继代：取经愈伤组织诱导后获得的带有残留叶片组织的愈伤组织块，放置在愈伤组织继代平板培养基上进行继代培养，培养基组分包括：ms+1.5mg·l^-1pic+2％(w/v)蔗糖+1％(w/v)麦芽糖+1％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度25℃，暗培养。以60d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色，部分细胞团现不透明状，表面粗糙。

胚性愈伤组织的转变：取经继代培养后获得的愈伤组织块(不含残留叶片组织)，放置在胚性愈伤组织诱导培养基平板上进行培养，培养基组分为：ms+1.5mg·l^-1pic+2％(w/v)葡萄糖+2％(w/v)麦芽糖+1％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度25℃，暗培养。60d后，多数细胞团现不透明状，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性组织(图2)。胚性细胞诱导率为76.36％。

胚性细胞的细胞染色验证：取3mm大小的细胞团，放入1.5ml的离心管中，加入500μl的醋酸洋红染色液，在室温下静置30min，用移液器吸取染色液，弃去染色液；然后加入超纯水，不断吹打细胞团，用移液器吸取溶液，再次加入超纯水，本步骤重复3次。取载玻片一枚，用1ml吸头剪去顶端2mm处，吸取直径1mm大小的细胞团，放在载玻片上，放置盖玻片，避免产生气泡，然后轻轻压平，放在leicadm2500显微镜下观察并拍照，可观察到细胞核较大，细胞质浓密的胚性细胞(图3)。

胚性细胞成苗诱导验证：取含胚性细胞的愈伤组织块，放置在成苗诱导培养基平板上进行培养，培养基组分包括：4.43g·l^-1ms+2％(w/v)蔗糖+2％(w/v)葡萄糖+1％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度22～28℃，光照培养，光照强度2500lx。15d后，多数细胞团表面出现胚状颗粒物，呈白色不透明状，30d后，胚状颗粒物生长为棒状结构，上部转绿色，下部依然为白色，呈独立分布状(图4a)，2个月后可长成带有根系的体胚苗(图4b)。

实施例2

本实施例提供了一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，具体步骤如下：

外植体的取材：用手术刀片切取2年生百子莲离根茎连接部位0～2.0cm处的叶片。将百子莲的叶片流水冲洗90～150min后置于超净工作台，75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddh2o冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddh2o冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddh2o冲洗3～5次，无菌滤纸吸干叶片表面的水分，利用手术刀切去叶片外围的组织(包括上下两端的组织以及2～3片包裹的老叶)，用手术刀将所得的叶片基部组织切成0.5～0.8cm的小块。

愈伤组织诱导培养基的制备：每升ddh2o加入4.43gms固体培养基(sigma)干粉，溶解后加入1.5mg·l^-1的pic溶液(母液浓度为100mg·l^-1，用naoh助溶)，调节ph值为5.8，蔗糖浓度为3.5％(w/v)，琼脂浓度为0.8％(w/v)。培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌处理25min后拿到超净工作台内分装，冷却凝固后，进行外植体的接种。

愈伤组织的诱导：取0.5～0.8cm的叶片基部组织小块平放状态接种于愈伤组织诱导培养基平板上，培养基组分包括：ms+1.5mg·l^-1pic+3.5％(w/v)蔗糖+0.8％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度22℃，暗培养。培养15d可现白色半透明的愈伤组织生成，愈伤组织诱导率为87.65％，35天后进行愈伤组织的继代培养。

愈伤组织的继代：取经愈伤组织诱导后获得的带有残留叶片组织的愈伤组织块，放置在愈伤组织继代平板培养基上进行继代培养，培养基组分包括：4.43g·l^-1ms+1.0mg·l^-1pic+2％(w/v)蔗糖+1％(w/v)麦芽糖+0.8％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度22℃，暗培养。以65d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色，部分细胞团现不透明状，表面粗糙。

胚性愈伤组织的转变：取经继代培养后获得的愈伤组织块(不含残留叶片组织)，放置在胚性愈伤组织诱导培养基平板上进行培养，培养基组分为：4.43g·l^-1ms+1.2mg·l^-1pic+2％(w/v)葡萄糖+2％(w/v)麦芽糖+0.8％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度22℃，暗培养。65d后，多数细胞团现不透明状，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性组织。胚性细胞诱导率为74.98％。

胚性细胞的细胞染色验证：取3mm大小的细胞团，放入1.5ml的离心管中，加入500μl的醋酸洋红染色液，在室温下静置30min，用移液器吸取染色液，弃去染色液；然后加入超纯水，不断吹打细胞团，用移液器吸取溶液，再次加入超纯水，本步骤重复3次。取载玻片一枚，用1ml吸头剪去顶端2mm处，吸取直径1mm大小的细胞团，放在载玻片上，放置盖玻片，避免产生气泡，然后轻轻压平，放在leicadm2500显微镜下观察并拍照，可观察到细胞核较大，细胞质浓密的胚性细胞。

胚性细胞成苗诱导验证：取获得的含胚性细胞的愈伤组织块，放置在成苗诱导培养基平板上进行培养，培养基组分包括：4.43g·l^-1ms+2％(w/v)蔗糖+2％(w/v)葡萄糖+0.6％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度22～28℃，光照培养，光照强度2500lx。15d后，多数细胞团表面出现胚状颗粒物，呈白色不透明状，30d后，胚状颗粒物生长为棒状结构，上部转绿色，下部依然为白色，呈独立分布状，2个月后可长成带有根系的体胚苗。

实施例3

本实施例提供了一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，具体步骤如下：

外植体的取材：用手术刀片切取2年生百子莲离根茎连接部位0～2.0cm处的叶片。将百子莲的叶片流水冲洗90～150min后置于超净工作台，75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddh2o冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddh2o冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddh2o冲洗3～5次，无菌滤纸吸干叶片表面的水分，利用手术刀切去叶片外围的组织(包括上下两端的组织以及2～3片包裹的老叶)，用手术刀将所得的叶片基部组织切成0.5～0.8cm的小块。

愈伤组织诱导培养基的制备：每升ddh2o加入4.43gms固体培养基(sigma)干粉，溶解后加入1.8mg·l^-1的pic溶液(母液浓度为100mg·l^-1，用naoh助溶)，调节ph值为5.8，蔗糖浓度为2.5％(w/v)，琼脂浓度为1％(w/v)。培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌处理25min后拿到超净工作台内分装，冷却凝固后，进行外植体的接种。

愈伤组织的诱导：取0.5～0.8cm的叶片基部组织小块平放状态接种于愈伤组织诱导培养基平板上，培养基组分包括：4.43g·l^-1ms+1.8mg·l^-1pic+2.5％(w/v)蔗糖+1％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度28℃，暗培养。培养15d可现白色半透明的愈伤组织生成，愈伤组织诱导率为89.93％，25天后进行愈伤组织的继代培养。

愈伤组织的继代：取经愈伤组织诱导后获得的带有残留叶片组织的愈伤组织块，放置在愈伤组织继代平板培养基上进行继代培养，培养基组分包括：4.43g·l^-1ms+1.2mg·l^-1pic+2％(w/v)蔗糖+1％(w/v)麦芽糖+1％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度28℃，暗培养。以55d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色，部分细胞团现不透明状，表面粗糙。

胚性愈伤组织的转变：取经继代培养后获得的愈伤组织块(不含残留叶片组织)，放置在胚性愈伤组织诱导培养基平板上进行培养，培养基组分为：4.43g·l^-1ms+1.2mg·l^-1pic+2％(w/v)葡萄糖+2％(w/v)麦芽糖+1％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度28℃，暗培养。55d后，多数细胞团现不透明状，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性组织。胚性细胞诱导率为58.27％。

胚性细胞的细胞染色验证：取3mm大小的细胞团，放入1.5ml的离心管中，加入500μl的醋酸洋红染色液，在室温下静置30min，用移液器吸取染色液，弃去染色液；然后加入超纯水，不断吹打细胞团，用移液器吸取溶液，再次加入超纯水，本步骤重复3次。取载玻片一枚，用1ml吸头剪去顶端2mm处，吸取直径1mm大小的细胞团，放在载玻片上，放置盖玻片，避免产生气泡，然后轻轻压平，放在leicadm2500显微镜下观察并拍照，可观察到细胞核较大，细胞质浓密的胚性细胞。

胚性细胞成苗诱导验证：取含胚性细胞的愈伤组织块，放置在成苗诱导培养基平板上进行培养，培养基组分包括：4.43g·l^-1ms+2％(w/v)蔗糖+2％(w/v)葡萄糖+1％(w/v)琼脂，ph5.8。培养条件：温度22～28℃，光照培养，光照强度2500lx。15d后，多数细胞团表面出现胚状颗粒物，呈白色不透明状，30d后，胚状颗粒物生长为棒状结构，上部转绿色，下部依然为白色，呈独立分布状，2个月后可长成带有根系的体胚苗。

对比例1

本对比例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于：本对比例采用的各培养基中均不含pic。

采用本对比例的方法，在不含pic的培养基上，叶片组织基本不分化、不生长、不产生愈伤组织，30～60天以后褐化死亡。

对比例2

本对比例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于：本对比例采用的胚性愈伤组织诱导培养基中，碳源采用4％蔗糖。

采用本对比例的方法，在胚性细胞诱导阶段，采用4％蔗糖作为碳源，60d后无单细胞起源的胚性组织产生，愈伤细胞仍为非胚性细胞。

对比例3

本对比例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于：本对比例的外植体取材步骤中，对整片叶片进行取材，直接利用手术刀将叶片切成0.5～0.8cm的小块或小段。

采用本对比例的方法，叶片基部2cm区域具有分生能力，可产生愈伤组织，叶片基部2cm以上的区域为成熟区，没有细胞分化的能力，因此成熟叶片无愈伤组织的产生,更无法诱导胚性细胞。

对比例4

本对比例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于：本对比例的各培养基中，采用1.0～2.0mg·l^-12,4-d作为外源生长素代替pic。

采用本对比例的方法，叶片虽可维持离体生长，但愈伤诱导效果较差，诱导率不足10％，胚性细胞的诱导率为0.00％。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。