一种化合物脱氢根生素的用途的制作方法

本发明涉及从微生物中提取化合物作为除草剂，具体的说涉及一种从弯孢霉(curvulariainaequalis)次级代谢产物中提取的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂的用途。

背景技术：

化学除草剂在农林牧业生产中应用广泛，但是往往对自然环境造成污染。多种人工合成的化学除草剂由于缺乏相应的微生物对其进行分解，容易在自然界中长期留存，从而威胁到人类赖以生存的土壤和地下水资源的安全。而从自然界中提取的天然成分作为除草剂，则因其易于分解、在自然界没有残留而日益受到重视。此外，某些化学除草剂虽然能够在土壤中分解，但是由于被长期大量地应用，杂草逐渐演化出抵抗力，使得药效降低甚至丧失。在这种情况下，研发具有新颖作用靶点和作用机理的除草剂显得尤为重要。自然界里种类丰富、构型各异、作用机理多样的天然产物为此提供了可能。有些天然产物自身的除草活性可与化学除草剂媲美，如，1,8-按树脑；也有多种天然来源的除草剂在被发现之初，其药效无法与化学合成的除草剂相比，但是经过日后的化学结构改造，其药效可大大增强，从而具备商业推广价值，例如由红千层中的植物毒素纤精酮改造而成的磺草酮。

参考文献：1.grovejf.metabolicproductsofstemphyliumradicinum.iii.biosynthesisofradicininandpyrenophorin[j].j.chem.soc.1970，13(13)，1860-1865.报道了采用人工化学合成方法得到了化合物dehydroradicinin，结构式为：

而本发明所述的一种化合物脱氢根生素的用途，该化合物是从弯孢霉(curvulariainaequalis)的次级代谢产物中分离提取得到化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)，所提取的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)的弯孢霉，菌落生长较快，结构疏松，表面呈灰褐色，背面无色或略呈褐色，菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。操作简单，培养快速。通过本发明所述的化合物脱氢根生素的用途，作为除草剂对常见杂草的生长具有抑制作用(植物毒作用)，在国内外文献中均未见报道。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种化合物脱氢根生素的用途，该化合物脱氢根生素是从弯孢霉次级代谢产物中分离提取的，包括菌株的发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化步骤完成，通过本发明所述方法获得的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂，在使用中，即浓度为100μg/ml时，对5种常见一般除草剂难以根除的野生杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及入侵植物意大利苍耳的幼苗生长产生显著抑制，同时配制成不同浓度，在苗前或苗期单独或与其它农药混合使用，广泛应用于各类除草剂的开发中，具有巨大潜在的商业应用价值。

本发明所述的一种化合物脱氢根生素的用途，该化合物脱氢根生素在制备除草剂中的用途，其中该化合物脱氢根生素是从弯孢霉次级代谢产物中分离提取的，采用菌株的发酵、次级代谢产物的萃取和分离纯化，具体操作按下列步骤进行：

菌株的发酵：

a、将弯孢霉菌种移植于试管pda斜面培养基进行活化，将活化后的弯孢霉移入pda平板培养基上培养，然后用直径为5mm的打孔器打取弯孢霉菌饼接入马铃薯葡萄糖培养液中，接入量为2块/100ml，放入摇床振荡培养得到发酵液；

b、将步骤a得到的发酵液，分别用四层纱布和滤纸将菌丝体和发酵液分开，再将发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，减压浓缩，得发酵液萃取物；

c、将步骤b得到的发酵液萃取物用硅胶柱色谱进行梯度洗脱，首先用纯乙酸乙酯进行洗脱得到组分1，组分2，组分3和组分4，将所得组分4用洗脱剂为体积比96:4的氯仿:甲醇进行洗脱，得到组分5，组分6，组分7和组分8，再将所得组分8用高效液相色谱分离纯化，流动相为体积比70:30的甲醇-水，即得到化合物脱氢根生素。

所述化合物脱氢根生素用途，将从弯孢霉次级代谢产物中分离提取的化合物脱氢根生素用95％乙醇溶解后，经稀释10000-20000倍，作为除草剂在野生杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及入侵植物意大利苍耳出苗前后按照喷施浓度500-1000μg/ml喷洒。

所述化合物脱氢根生素的用途，将从弯孢霉次级代谢产物中分离提取的化合物脱氢根生素用丙酮溶解后，经稀释10000-20000倍，作为除草剂在野生杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及入侵植物意大利苍耳出苗前后按照喷施浓度500-1000μg/ml喷洒。

通过本发明所述一种化合物脱氢根生素的用途，作为除草剂可显著抑制新疆野生杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及入侵植物意大利苍耳的幼苗生长，这些野生杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及入侵植物意大利苍耳具有常见除草剂都一般难以根除的现状，采用从弯孢霉次级代谢产物中提取脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂，其生长抑制作用随着浓度的增高而逐渐加强，当浓度达到100μg/ml的浓度下，对反枝苋、苜蓿、早熟禾和稗草及意大利苍耳的根长抑制率分别为48.09％、24.43％、38.43％、73.58％、77.22％；当浓度继续升高至500μg/ml时，对反枝苋、苜蓿、早熟禾和稗草的根长抑制率明显增高，它们分别为89.19％、81.25％、75.56％、89.28％、96.73％；对所有受试植物的苗高的生长影响与根长类似，可见从弯孢霉次级代谢产物中提取的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂具有显著的技术效果。

本发明所述的一种化合物脱氢根生素的用途，通过次级代谢产物的发酵、萃取及分离纯化从弯孢霉中获得，提取的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)在弯孢霉中天然存在，在自然界分解，因此对环境不会造成污染。

通过本发明所述一种化合物脱氢根生素的用途，与常用除草剂一样使用，可以配制成不同浓度，在苗前或苗期单独或与其它农药混合使用；采用以浓度为95％乙醇或丙酮溶解后，在使用前稀释10000-20000倍，于杂草出苗前后按照喷施浓度500-1000μg/ml喷洒。

由于目前尚未有结构类似的除草剂问世，因此，本发明从弯孢霉中提取化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)亦可以作为前体对其进行化学结构改造，进一步提高其除草活性后进行商业化生产。

本发明所述的弯孢霉(curvulariainaequalis)，属于微生物，该真菌是从新疆乌鲁木齐市郊的野外居群中意大利苍耳自然发病植株叶片上分离纯化获得的，采集时间为2016年7月。

本发明的有益效果：

1.通过本发明所述一种化合物脱氢根生素的用途，作为除草剂可显著抑制新疆野生杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及入侵植物意大利苍耳的幼苗生长，这些野生杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及入侵植物意大利苍耳具有常见除草剂都一般难以根除的现状，采用从弯孢霉次级代谢产物中提取脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂，其生长抑制作用随着浓度的增高而逐渐加强，当浓度达到100μg/ml的浓度下，对反枝苋、苜蓿、早熟禾和稗草及意大利苍耳的根长抑制率分别为48.09％、24.43％、38.43％、73.58％、77.22％，当浓度继续升高至500μg/ml时，对反枝苋、苜蓿、早熟禾和稗草的根长抑制率明显增高，它们分别为89.19％、81.25％、75.56％、89.28％、96.73％，且幼苗的根发生明显的扭曲变形，变成黑褐色，提示幼苗已经受到非常严重的毒害。对所有受试植物的苗高的生长影响与根长类似。可见从弯孢霉次级代谢产物中提取的脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂获得显著的技术效果。将本发明提供的从弯孢霉次级代谢产物中提取脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂和常见商业除草剂草甘膦进行比较试验，检测对反枝苋、苜蓿、早熟禾和稗草及意大利苍耳植物的生长抑制作用，结果显示：脱氢根生素(dehydroradicinin)对5种受试植物的综合抑制作用与草甘膦相当。

2.通过本发明所述一种化合物脱氢根生素的用途，作为除草剂适用于农田中进行杂草的防除。由于本发明提供的从弯孢霉次级代谢产物中提取脱氢根生素(dehydroradicinin)为天然成分，在自然界可快速分解，不污染环境，应用于有机农业生产中的杂草防除，对4种常见杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草和入侵杂草意大利苍耳及表现出很强的除草活性，对它们进行有效的防控。同时该化合物可以自弯孢霉中提取，弯孢霉来源广泛，培养弯孢霉操作简易快速。

附图说明

图1为本发明从弯孢霉次级代谢产物中提取的脱氢根生素(dehydroradicinin)对反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草和意大利苍耳根长的抑制作用图，其中作用浓度分别是1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml和500μg/ml。

图2为本发明从弯孢霉次级代谢产物中提取的脱氢根生素(dehydroradicinin)对反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草和意大利苍耳苗高的抑制作用图，其中作用浓度分别是1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml和500μg/ml。

图3为本发明从弯孢霉次级代谢产物中提取的脱氢根生素(dehydroradicinin)对反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及意大利苍耳生长的影响。

图4为商业除草剂草甘膦对反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草和意大利苍耳根长的抑制作用图，其中作用浓度分别是1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml和500μg/ml。

图5为商业除草剂草甘膦对反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草和意大利苍耳苗高的抑制作用图，其中作用浓度分别是1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml和500μg/ml。

具体实施方式

以下结合附图举例说明本发明，但是，本发明并不限于下述实施例。

本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1

从弯孢霉次级代谢产物中分离提取的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)，包括菌株的发酵、次级代谢产物的萃取和分离纯化，具体操作按下列步骤进行：

菌株的发酵：

a、将弯孢霉菌种移植于试管pda斜面培养基进行活化，将活化后的弯孢霉移入pda平板培养基上培养，然后用直径为5mm的打孔器打取弯孢霉菌饼接入马铃薯葡萄糖培养液中，接入量为2块/100ml，放入摇床振荡培养得到发酵液；

b、将步骤a得到的发酵液，分别用四层纱布和滤纸将菌丝体和发酵液分开，再将发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，减压浓缩，得发酵液萃取物；

c、将步骤b得到的发酵液萃取物用硅胶柱色谱进行梯度洗脱，首先用纯乙酸乙酯进行洗脱得到组分1，组分2，组分3和组分4，将所得组分4用洗脱剂为体积比96:4的氯仿:甲醇进行洗脱，得到组分5，组分6，组分7和组分8，再将所得组分8用高效液相色谱分离纯化，流动相为体积比70:30的甲醇-水，即得到化合物脱氢根生素。

实施例2

从弯孢霉次级代谢产物中提取的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂中的用途：

将纯化后纯度达98％的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)用丙酮配制成500μg/ml浓度溶液，然后依次稀释至1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml溶液，在直径6cm的培养皿中放置滤纸，分别加入3ml浓度为1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml和500μg/ml的脱氢根生素(dehydroradicinin)溶液，待丙酮彻底挥发干净后，在每个培养皿中加入3ml蒸馏水，并在每个培养皿中加入10粒反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草和意大利苍耳，每个处理三个重复，用封口膜将培养皿封好后，置于温度25℃培养箱中黑暗培养5天后，测量反枝苋、苜蓿及意大利苍耳幼苗的根长和苗高，置于温度25℃培养箱中黑暗培养7天后，测量早熟禾及稗草幼苗的根长和苗高，根据以下公式计算根长及苗高的抑制率：

抑制率＝(对照平均根长-处理平均根长)/对照平均根长×100％；苗高类似计算；

数据统计方法：首先用单因素方差检测各组数据间的差异是否达到显著，之后用lsd方法分析数据，标记字母不同的组间差异达到显著，水平为p>0.05；

结果：从弯孢霉次级代谢产物中提取化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)可显著抑制新疆野生杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及入侵植物意大利苍耳的幼苗生长，这些野生杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及入侵植物意大利苍耳具有常见除草剂都一般难以根除的现状，采用从弯孢霉次级代谢产物中提取化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂，其生长抑制作用随着浓度的增高而逐渐加强，当浓度达到100μg/ml的浓度下，对反枝苋、苜蓿、早熟禾和稗草及意大利苍耳的根长抑制率分别为48.09％、24.43％、38.43％、73.58％、77.22％；当浓度继续升高至500μg/ml时，对反枝苋、苜蓿、早熟禾和稗草的根长抑制率明显增高，它们分别为89.19％、81.25％、75.56％、89.28％、96.73％，且幼苗的根发生明显的扭曲变形，变成黑褐色，提示幼苗已经受到非常严重的毒害，获得显著的技术效果；对受试植物幼苗苗高的影响与对根长的影响相似，但是由于化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)直接作用于幼苗的根部，因此对苗高的作用强度略弱于对根长的影响，效果参见附图1、附图2和附图3。

实施例3

从弯孢霉次级代谢产物中提取的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂与商业除草剂草甘膦的作用强度比较：

将纯化后纯度达98％的化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)用丙酮配制成500μg/ml浓度溶液，然后依次稀释至1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml溶液，在直径6cm的培养皿中放置滤纸，分别加入3ml浓度为1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml和500μg/ml的脱氢根生素(dehydroradicinin)溶液，待丙酮彻底挥发干净后，在每个培养皿中加入3ml蒸馏水，并在每个培养皿中加入10粒反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草和意大利苍耳，每个处理三个重复，用封口膜将培养皿封好后，置于温度25℃培养箱中黑暗培养5天后，测量反枝苋、苜蓿及意大利苍耳幼苗的根长和苗高，置于温度25℃培养箱中黑暗培养7天后，测量早熟禾及稗草幼苗的根长和苗高，根据以下公式计算根长及苗高的抑制率：

将商业除草剂草甘膦同样配制成1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml和500μg/ml的浓度梯度，在温度25℃下培养反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及意大利苍耳种子，并于5天后，测量反枝苋、苜蓿及意大利苍耳幼苗的根长和苗高，7天后，测量早熟禾及稗草幼苗的根长和苗高，并计算根长及苗高的抑制率；

抑制率＝(对照平均根长-处理平均根长)/对照平均根长×100％；苗高类似计算；

数据统计方法：首先用单因素方差检测各组数据间的差异是否达到显著，之后用lsd方法分析数据，标记字母不同的组间差异达到显著，水平为p>0.05；

结果：从弯孢霉次级代谢产物中提取化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)当浓度达到100μg/ml时，反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及意大利苍耳的根抑制率长依次为56.42％，44.19％，90.14％，81.79％和80.53％，当浓度升高至500μg/ml时，反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及意大利苍耳的根长抑制率依次为71.64％，61.61％，98.66％，93.99％和90.04％，效果参见附图1，附图2和附图3；因此，采用从弯孢霉次级代谢产物中提取化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)作为除草剂与商业除草剂草甘膦进行的比较实验显示，脱氢根生素(dehydroradicinin)的作用与草甘膦相当见图4和图5；

结论：

通过本发明所述的化合物脱氢根生素的用途，作为除草剂显著抑制5种受试杂草反枝苋、苜蓿、早熟禾、稗草及意大利苍耳的幼苗生长，当浓度为100μg/ml时，对反枝苋、苜蓿、早熟禾和稗草及意大利苍耳的根长抑制率分别为48.09％、24.43％、38.43％、73.58％、77.22％，当浓度继续升高至500μg/ml时，对反枝苋、苜蓿、早熟禾和稗草的根长抑制率明显增高，它们分别为89.19％、81.25％、75.56％、89.28％、96.73％，且幼苗的根发生明显的扭曲变形，变成黑褐色，提示幼苗已经受到非常严重的毒害，获得了显著的技术效果；其除草活性与常用商业除草剂草甘膦作用相当，具有较大的开发利用价值；同时该化合物可以自弯孢霉中提取，弯孢霉来源广泛，培养弯孢霉操作简易快速。

此外，由于目前尚未有结构类似的除草剂问世，因此，本化合物亦可以作为前体对其进行化学结构改造，进一步提高其除草活性后进行商业化生产，以应对日益严重的杂草对常见商业除草剂产生抗性的问题。该化合物脱氢根生素(dehydroradicinin)为天然成分，来源于微生物，在自然界可快速分解，不污染环境，可应用于有机农业的杂草防除。