本发明涉及植物组织培养技术，特别是，本发明涉及一种国兰茎尖组织培养中切芽外植体的消毒方法。
背景技术：
以下对本发明的相关技术背景进行说明，但这些说明并不一定构成本发明的现有技术。
国兰为兰科兰属多年生地生兰，主要包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰和春剑，广泛分布于我国的东南和西南地区，在我国栽培历久悠久，文化价值丰富，为我国传统十大名花之一。
传统国兰以分株繁殖为主，繁殖速度较慢，繁殖系数低，容易感染，对操作者的技术也要求比较高。而且长期分株繁殖，容易使植株携带病毒，导致品种特性的退化，这些都会限制国兰新优品种和传统名品的推广和保护，更难满足国兰大规模生产的需求。而组织培养技术的应用可以使国兰达到快速繁殖、品种复壮等目的，加快育种进程、拯救珍稀濒危物种，并且利用组培技术可以推进国兰工业化生产，取得巨大的经济效益。
国兰的组织培养分为组培播种繁殖和组培茎尖切芽繁殖。通常，播种繁殖获得的种苗变异较多，种苗生长不一致，不能保证遗传性状稳定；而采用国兰茎尖作为外植体进行组培时，外植体的消毒是组培进行的第一步，也是关乎组培技术成功至关重要的一步。外植体取材的时间、大小，所使用的表面消毒剂的种类，消毒时间长短，都会影响外植体消毒的效果。外植体取材过大，存活率较高，但难以彻底消毒，污染率高，当采用高浓度的消毒剂处理时又容易导致外植体的死亡；外植体取材过小，污染率会相对减少，但较小的外植体容易被消毒剂杀死，同时外植体取材过小还容易分泌过多的酚类、醌类物质，从而导致外植体褐化死亡。此外，国兰切芽组培外植体消毒存在以下问题：
1、以往切芽外植体消毒为减少外植体所携带的微生物，取材时间往往受限于一定季节；而且选取的芽体也通常较小，只有成株的十分之一大小，甚至是刚萌发的新芽，由于外植体较为幼嫩，很容易受到消毒剂的伤害，造成外植体死亡或者褐化严重。
2、以往切芽外植体消毒前缺少预处理或者预处理不到位，由于国兰新芽生长于假鳞茎基部，多与基质接触，常常携带较多的内生菌，普通的表面消毒很难杀灭内生微生物，很容易产生污染，导致整个组培的失败。
3、在消毒剂的选择上，为保证消毒效果，往往选用毒性较大的升汞作为消毒剂，消毒时间稍微过长就容易造成外植体死亡，并且升汞不易清洗干净，容易残留在外植体表面，而且对环境污染较大，不环保。
4、消毒方法一般为单一消毒剂或者多种消毒剂联合单次消毒，但由于国兰新芽外附多层苞叶，很难一次清洁干净，对消毒造成一定的难度。
为了解决上述问题，本申请的发明人团队经过长期的试验获得了一种国兰茎尖组织培养中切芽外植体的消毒方法，其可降低污染率和褐化率，同时提高植体的成活率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出一种能够降低污染率并提高成活率的国兰茎尖组织培养中切芽外植体的消毒方法。
根据本发明的一个方面，一种国兰茎尖组织培养中切芽外植体的消毒方法，其包括下述步骤：(1).选择外植体：选择为成株三分之一大小，已展开二至三叶的新芽作为外植体；(2).对外植体进行切取前预处理：首先，将待切取的所述外植体的植株置于遮光率为75％、湿度为60％-80％的消毒温室环境中隔离，并将新芽的假鳞茎下方5cm基质清除，使其裸露，在隔离期间，每日向所述外植体的植株整体喷洒1-2次1000倍广谱杀菌剂，并不对其进行浇水，控水一至两周的时间；(3).切取及阴干外植体；将前一步骤中预处理过的待切取的所述外植体的植株脱盆，彻底露出芽体，紧贴假鳞茎基部将芽体垂直切下并保证芽体的完整性，之后剥除芽体外部鳞片状苞叶，切除肉质根，削去假鳞茎基部黑褐色的老旧组织，剪切芽体的上部的叶片，保留叶片为原长度的三分之一，之后将芽体放置到温度为18-25℃，湿度为20％-60％的洁净的室内，自然阴干18-24小时；(4).对外植体进行两次消毒：首先，用10％次氯酸钠溶液震荡消毒40分钟，之后用无菌水震荡冲洗两次，每次15分钟；然后将冲洗好的芽体置于无菌滤纸上，吸干表面水分，并剥去芽体表面2-3片苞叶，切除假鳞茎基部表面的黄褐色的老旧组织；再剪切掉第(3)步中剩余叶片长度的三分之二，并将芽体切成2-3cm的大小，然后将处理好的芽体再次置于10％次氯酸钠溶液中震荡消毒30分钟；之后用无菌水再次震荡冲洗三次，每次5分钟；最后将冲洗好的芽体置于无菌滤纸上，剥除芽体表面1-2片苞叶，切除假鳞茎基部所有老旧组织；切除剩余所有叶片；(5).完成消毒后切体及培养：将第四步中完成消毒后的芽体切成以生长点为中心的0.5-0.7cm长度以获得无菌的茎尖生长组织，再转接入适宜的培养基中，并及时置于温度为20-27℃的黑暗环境下以防止褐化并进行培养。
优选地，所述选择外植体的时间可以是一年中的任意时间。
优选地，所述隔离环境为经过熏蒸及地面泼洒石灰水消毒后的环境。
优选地，需要根据季节和天气状况的不同调整所述控水时间和喷洒所述1000倍广谱杀菌剂的次数。
优选地，所述国兰可以是春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰和春剑中的任一种。
根据本发明的国兰茎尖组织培养中切芽外植体的消毒方法在降低污染率的同时，还能够降低褐化率并大幅提高成活率，适用于国兰中的各个品种，能够产生一定的经济效益，具有较强的推广应用价值。
具体实施方式
下面结合具体的示例性实施方式来对本发明进行详细描述。但对示例性实施方式的描述仅仅是出于示范目的，而绝不是对本发明及其应用或用法的限制。
国兰主要包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰和春剑，或者说，这些品种都可统称为国兰。在以下的描述中，所有的步骤方法均适用于上述国兰中的任一品种。换言之，如无特别说明，上述所有的国兰品种均可应用。为描述简便起见，下面统称为国兰。
在根据本发明的国兰茎尖组织培养中切芽外植体的消毒方法的一实施方式中，首先，选择母株及外植体。具体地，选取健壮的、无病虫害的盆栽作为采集外植体的母株。然后，选取为成株三分之一大小，并已经展开二至三片叶的新芽作为外植体。选取的时间可以为一年中的任意时间。
在现有技术的国兰切芽组培中，一般采用体积较小的新芽作为外植体，目的是降低污染率。而在本发明中，采用体积较大的新芽作为外植体，其优点是：由于体积较大也会具有较强的抵抗力，受消毒剂伤害的影响较小，由此可以提高外植体的存活率并降低褐化率。此外在本发明中，由于后续的消毒步骤的独特性，即使较大的外植体也不会提高污染率，其将在后面描述。因而，本发明中，选择成株三分之一大小，并已经展开二至三片叶的新芽作为外植体。
接着，对外植体进行切取前预处理。即，对前一步骤中选取的，长有成株三分之一大小待切取外植体的植株进行预处理。具体地，将选择好的待切取外植体的植株置于通风、遮光率为75％、湿度为60％-80％的消毒温室环境中单独隔离。即，将所选外植体与原有栽培环境隔离开，放入相对独立的温室栽培环境中。此外温室环境还需要经过熏蒸及地面泼洒石灰水等方式进行消毒处理。同时，将新芽假鳞茎下方5cm基质清除，使其裸露。在隔离期间，每日向待切取外植体的植株整体喷洒1-2次1000倍广谱杀菌剂，每次以植株表面均匀的沾满杀菌剂为止，同时隔离期间不再对其进行浇水，控水一至两周的时间。优选地，需要根据季节和天气状况的不同调整控水时间。例如，春秋季节10-25℃时，需要保持空气湿度不低于70％，以防止植株过度脱水，每日喷洒2次1000倍广谱杀菌剂，控水7-10天；夏季高温25-35℃时，湿度较大，每日喷洒2次1000倍广谱杀菌剂，需要加强遮阳，控水10-14天；冬季低于10℃时，控制隔离温室温度在10-15℃，每日喷洒1次1000倍广谱杀菌剂，控水10天。试验证明，该预处理步骤能大大降低表面及内生菌的污染。因而是降低污染率的重要步骤。
第三步，切取及阴干外植体。具体地，在前述预处理步骤后，将外植体适度脱盆，彻底露出芽体，用洁净锋利的手术刀紧贴假鳞茎基部，将芽体垂直切下并保证芽体的完整性，然后清洁芽体，剥除芽体外部鳞片状苞叶，切除肉质根，削去假鳞茎基部黑褐色的老旧组织，剪切芽体的上部叶片，只保留叶片为原长度三分之一，之后将清洁好的芽体放置到温度为18-25℃，湿度为20％-60％的洁净的室内，自然阴干18-24小时。试验证明，该预处理步骤也能大大降低表面及内生菌的污染。因而也是降低污染率的重要步骤。
第四步，两次消毒，即，对外植体进行两次消毒。
首先，将外植体置于超净工作台中，用浓度为10％的次氯酸钠溶液震荡消毒40分钟。之后，用无菌水震荡冲洗两次，每次15分钟；然后将冲洗好的芽体置于无菌滤纸上，吸干表面水分，并剥去芽体表面2-3片苞叶，切除假鳞茎基部表面黄褐色的老旧组织，再剪切掉第三步中剩余的叶片长度的三分之二，并将芽体切成2-3cm大小；然后将处理好的芽体再次置于浓度为10％的次氯酸钠溶液中震荡消毒30分钟；之后用无菌水再次震荡冲洗三次，每次5分钟；将冲洗好的芽体置于无菌滤纸上，剥除芽体表面1-2片苞叶，切除假鳞茎基部所有老旧组织，切除剩余所有叶片。
此处需要说明的是，在前面第三步中，在外植体消毒之前切除的只是表面黑褐色的老旧组织，该黑褐色的老旧组织中通常还包括表面附着的泥土，但并没有切太深，以避免对外植体造成太多损伤。也就是说，在第三步中削去假鳞茎基部黑褐色组织后，里面可能还是黄褐色的，但由于此时没有消毒，所以不需要多切，仅是把暴露在表面的老旧组织切掉了。而在该第四步中，切除的黄褐色老旧组织通常包含有第三步中未切除的部分，此外还有的部分是由于用次氯酸钠溶液消毒时，由于次氯酸钠的强氧化性造成的部分组织被氧化发黄。这一步黄褐色组织切除后，露出的内部洁净组织是乳白色的，即，露出清洁的内部组织，该组织通常呈乳白色。在最后切除假鳞茎基部所有老旧组织的切除处理中所切除的组织通常包括：由于次氯酸钠具有强氧化性，在消毒过程中会造成部分组织被氧化发黄，这部分被氧化了的组织在消毒后是要被切除的；经过次氯酸钠消毒后，要切除假鳞茎基部所有接触到消毒液的部分，要露出内部未接触到消毒液的部分。
第五步：消毒步骤完成后的切体及培养。在第四步的两次消毒处理后，将芽体切成以生长点为中心的0.5-0.7cm长度以获得无菌的茎尖生长组织。然后，转接入适宜的培养基中，并及时置于黑暗环境下，防止褐化。具体地，可以将接有外植体的组培瓶放置在组织培养室中的组培架上，并用不透光的黑色塑料布或者纸箱覆盖，给予黑暗培养的环境以防止褐化。组织培养室温度设定为20-27℃进行培养。
在现有技术中，通常采用单次消毒法，或者用高毒高残留的升汞作为消毒剂做二次消毒，很容易导致消毒不彻底，或者消毒时间过久，使芽体褐化或者死亡。而在本发明中，采用了毒害作用较低的次氯酸钠作为表面消毒剂，并对外植体进行二次消毒，第一次消毒时，由于芽体表面包裹有多层苞叶，内部幼嫩组织受消毒剂影响较小，所以第一次消毒及震荡冲洗时间较长，可以杀灭大部分芽体外层表面所携带的微生物，得到较为干净的芽体，之后在无菌滤纸上将外层苞叶剥去，并切除假鳞茎基部的老旧组织，露出清洁的内部组织，再将处理过的芽体进行第二次消毒及震荡冲洗，由于此时外植体裸露部位组织较为幼嫩，所以二次消毒时间相对较短，以免对外植体造成较大的伤害。最后将洗涤好的外植体再次切割，获得无菌的茎尖生长组织。
根据本发明的国兰茎尖组织培养中切芽外植体的消毒方法，由于对外植体进行了控水阴干预处理，不仅降低了外植体表面所携带的微生物，还大大降低了外植体所携带的内生菌，降低了国兰茎尖切芽外植体的污染率。实验证明，总污染率可降低达11.14％。
此外，根据本发明的国兰茎尖组织培养中切芽外植体的消毒方法，由于采用浓度为10％的次氯酸钠水溶液为消毒剂进行两次消毒，而次氯酸钠的毒性较低、残留较少，所以有利于提高外植体的存活率、降低褐化率。而且在两次消毒步骤中，由于对外植体内层较嫩组织和外层较老的组织分开消毒，从而使得消毒时间更易控制，保证了消毒效果，并且提高了外植体的存活率，减少了褐化现象的发生。实验证明，其存活率可高达78.15％，并且在适宜的初代诱导培养基中，褐化率可降低到3.71％。
更进一步地，根据本发明的国兰茎尖组织培养中切芽外植体的消毒方法，使得切芽组培的外植体取材可在一年中的任意时间进行，即，不再受限于初春季节。在现有技术的国兰组培中，由于选取的新芽个体较小，所以在新芽刚刚萌出的时候就取材，而国兰新芽萌发主要集中在春秋两季，秋季由于刚经历一段夏季的潮湿、高温的时间，植株本身所携带的微生物较多，容易造成污染；而初春季节，刚刚经历一段冬季的干燥、低温的时节，植株本身所携带的微生物含量较低，不易污染，所以多选择初春时节进行外植体取材。采用本发明的技术方案之后，由于设置了“外植体预处理”的步骤，即提前一到两周对外植株进行控水及喷洒杀菌剂，切芽后对外植体阴干处理这两个预处理步骤，使得外植体本身所携带的微生物含量大幅度降低，所以不需要选择特定的季节。而且由于温室中种植的国兰全年都能有新芽萌出，使得切芽组培可以在一年中的的任意时间进行，大大提高了组培的效率。增加了灵活性，提高了经济效益。
更进一步地，通过下面的表格1可以清楚地看到本发明与现有技术相比，在降低污染率、降低褐化率以及提高存活率方面的有益技术效果。
表1
从上面的表1中可以看出，在现有技术1的方法中，虽然污染率略低于本发明，但是其褐化率过高，并且存活率远低于本发明。在现有技术2的方法中，污染率高于本发明并且存活率低于本发明。在现有技术3的方法中，污染率是本发明的两倍多，但存活率还是远低于本发明。在现有技术4的方法中，污染率是本发明的将近两倍，且存活率还低于本发明。在现有技术5的方法中，虽然褐化率低于本发明，但是其污染率远高于本发明，并且存活率低于本发明。由此可见，采用本发明的技术方案，可以实现在降低污染率、褐化率的同时，还可大幅提高存活率，而且根据本发明的技术方案适用于所有的国兰品种，例如，但不限于春兰、蕙兰及墨兰等等。
虽然参照示例性实施方式对本发明进行了描述，但是应当理解，本发明并不局限于文中详细描述和示出的具体实施方式，在不偏离权利要求书所限定的范围的情况下，本领域技术人员可以对所述示例性实施方式做出各种改变。