一种保护菊花知识产权品种的组培方法与流程

本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种保护菊花知识产权品种的组培方法。

背景技术：

菊花，又名金英、九花、鞠花、节花、女华，为菊科菊属的多年生宿根草本植物，我国十大传统名花和世界四大切花之一，在我国有着悠久的栽培历史，是品种最丰富的观赏植物之一。其应用形式多样、用途广泛，主要用作观赏、食用、茶用、药用。菊花在生产中多以扦插和分株两种方法进行繁殖，但对于新品种大规模的种苗生产尤其是专业育种单位来说，这两种方法的繁殖速率远不能满足市场需求。相比之下，组培快繁以其繁殖效率高、增殖系数大、节约育苗空间、受环境影响小等优点成为菊花新品种育苗的主要手段。

正是菊花组培育苗的这些优点，使人们在提高经济效益的同时往往忽略菊花知识产权品种的保护，诸如，一般种苗生产单位在培育出新品种时，基本都通过组培的方法大量繁殖种苗，并且因为组培苗易保存、便于运输等优点，生产单位往往会通过售卖组培苗获取投资回报，但由于购买者在获得一批所需品种的组培苗后，可以通过不断地组培扩繁获得他们所需的品种苗而无需再购买，并且这种组培扩繁的方法简单、经济、繁殖效率高，很容易掌握和应用，因此很多人运用组培的方法扩大品种的生产，超过授权使用的数量，造成市面上出现很多不是正规渠道获得的“盗版”菊花品种，这严重侵犯了知识产权保护单位的合法权益，有的甚至导致我国本土优良菊花品种非法外流。因此，保护菊花知识产权品种，推动安全、和谐的菊花产业发展，具有重要意义。

目前，植物知识产权品种保护的相关法律和制度已经越来越完善，但仍有难以克服的保护问题。除了采用专利和植物品种保护形式，还可采用技术手段保护植物的知识产权，最直接有效的就是通过生产技术，也就是安全有效的组培方法来加以保护。目前，关于菊花组培快繁育苗的研究比较多，技术体系也越来越完善，但大都是以提高生产效率、减少组培苗污染为主要目的，对于以一种组培方法来保护菊花知识产权品种的研究还未见报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种菊花的特殊组培方法，通过此方法，只有拥有品种授予权的育苗单位或个人可以育出健康的无菌苗，其他人无法通过普通组培方法得到。此方法可在快速培育菊花种苗的同时，有效保护菊花知识产权品种，并且培育的菊花苗生长发育状况及炼苗后的表现均正常，具有科学性和实用性。

本发明的目的通过一下技术方案实现：

一种保护菊花知识产权品种的组培方法，包括：

(1)取需要保护的菊花知识产权品种的无菌苗中上部幼嫩茎段，将其接种于普通培养基中进行继代扩繁培养，每瓶接种2-3棵，普通培养基培养直至品种售出前倒数第二次继代；

(2)需要保护的菊花知识产权品种在售出前最后一次培养于接种灰绿青霉菌的抑菌培养基中进行：将无菌苗上部幼嫩茎段接入接种灰绿青霉菌的抑菌培养基，每瓶接种2-3棵，培养直至品种达到售出状态；

其中，所述的抑菌培养基配方为：ε-聚赖氨酸0.05g/l,异噻唑啉酮0.05g/l,链霉素0.05g/l,百菌清0.05g/l,蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ms粉4.74g/l，naoh调节培养基的ph为5.8-7.2。

其中，普通培养基中培养条件优选培养温度为25℃，光周期为16h光照、8小时黑暗，光照强度为4000lux。

普通培养基配方优选为蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ms粉4.74g/l，培养基的ph为5.8-7.2。

步骤(2)中接种用灰绿青霉优选通过以下方法制备：在1/4ms液体培养基中接种灰绿青霉，置于25℃、20r/min的摇床上培养至od值为0.6-0.8，制成悬浊液，使用时将其稀释10000倍。

步骤(2)中每瓶接种灰绿青霉液100微升。

步骤(2)中最后一次培养的条件优选温度为25℃，光周期为16h光照、8h黑暗，光照强度为4000lux。

有益效果本发明提供了一种保护菊花知识产权品种的组培方法，与现有技术相比，其产生的积极效果有：

(1)本发明通过多种抑菌剂组合使用，能有效抑制组培瓶中微生物污染，且对菊花组培苗的生长发育没有明显影响，但由于不同植物对抑菌剂的敏感性不同，本发明抑菌培养基中的抑菌剂及用量目前只针对菊花组培苗。

(2)本发明创新性地向抑菌培养基中接种灰绿青霉，灰绿青霉是分布很广的子囊菌纲中的一属，广泛用于食品和医药研究，其营腐生生活，营养来源广泛，可生长在任何含有机物的基质上，具有易培养和生长快的优势，易从土壤和空气中分离。

小剂量的灰绿青霉加入抑菌培养基后在抑菌剂作用下处于潜伏状态，并不会使组培苗爆发真菌污染，但接种真菌后的组培苗转入普通培养基进行继代培养时，由于缺少抑菌剂的抑制作用而发生染菌现象，这里要注意掌握灰绿青霉的用量。

(3)本发明采用4000lux的较强光照，可有效抑制各种杂菌生长，保证菊花继代组培苗正常生长。

(4)因为灰绿青霉广泛存在于空气中，所以组培苗炼苗后种到土壤中一般不会爆发真菌污染，无害且安全。

(5)本发明可在快速培育菊花种苗的同时，有效保护菊花知识产权品种，并且不影响菊花种苗的品质和培育速率，具有科学性和可行性。

附图说明

图1、不同培养基中菊花组培苗的生长发育状况对比

a：抑菌培养基中培养的菊花无菌苗。b-i:从抑菌培养基中接入普通培养基中继代培养的菊花组培苗。

图2、抑菌培养基与普通培养基中菊花组培苗炼苗后生长发育状况对比

a：抑菌培养基中培养的菊花苗炼苗后生长发育状况。b：普通培养基中培养的菊花苗炼苗后生长发育状况。

具体实施方式

实施例1抑菌剂筛选和培养基配制

抑菌剂筛选：ε-聚赖氨酸、异噻唑啉酮、链霉素、百菌清均为我南京农业大学作物栽培与种质创新重点实验室提前筛选的可用于菊花抑菌培养的单体抑菌剂，将其按1:1:1:1等量混合后配制成含有不同浓度的抑菌剂的ms培养基，其浓度分别为0.025g/l、0.05g/l、0.075g/l、0.1g/l，配好的培养基分装于玻璃组培瓶中，每瓶40ml，于灭菌锅中121℃灭菌30min，冷却凝固后备用。选取灰绿青霉，在1/4ms液体培养基中接种，置于25℃、20r/min的摇床上培养至od值为0.6-0.8，稀释10000倍制成悬浊液(此浓度能确保其中有灰绿青霉的存在)，向含有不同浓度的抑菌剂的ms培养基喷施灰绿青霉菌悬浊液100微升后，在培养温度为25℃，光周期为16h光照、8h黑暗，光照强度为4000lux的条件下培养2个月。并统计培养基的染菌状况。结果发现，1周后0.025g/l处理的培养基开始有少量染菌，0.05g/l、0.075g/l、0.1g/l的组合均无染菌现象，随着时间的推移，2个月后0.05g/l、0.075g/l、0.1g/l的组合也无染菌现象，从节约药品的角度出发，确定0.05g/l为抑菌剂组合的适宜浓度。即抑菌培养基配制为：ε-聚赖氨酸0.05g/l,异噻唑啉酮0.05g/l,链霉素0.05g/l,百菌清0.05g/l,蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ms粉4.74g/l，naoh调节培养基的ph为5.8-7.2。配好的培养基分装于玻璃组培瓶中，每瓶40ml，于灭菌锅中121℃灭菌30min，冷却凝固后备用。

普通培养基配制：蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ms粉4.74g/l，培养基的ph为5.8-7.2。灭菌方式参照抑菌培养基。

实施例2

一种保护菊花知识产权的组培方法，主要针对现有组培苗进行组培扩繁，采用特殊的抑菌培养基与组培方法，具体包括如下步骤：

1)培养基配方

抑菌培养基配制：ε-聚赖氨酸0.05g/l,异噻唑啉酮0.05g/l,链霉素0.05g/l,百菌清0.05g/l,蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ms粉4.74g/l，naoh调节培养基的ph为5.8-7.2。配好的培养基分装于玻璃组培瓶中,装量为40ml/瓶，于灭菌锅中121℃灭菌30min，冷却凝固后备用。

2)菊花知识产权品种扩繁

取需要保护的菊花知识产权品种的无菌苗中上部幼嫩茎段，将其接种于普通培养基中进行继代扩繁培养，每瓶接种2-3棵，保持培养温度为25℃，光周期为16h光照、8小时黑暗，光照强度为4000lux。普通培养基培养直至品种售出前倒数第二次继代。

普通培养基配制：蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ms粉4.74g/l，培养基的ph为5.8-7.2。灭菌方式参照抑菌培养基。

3)灰绿青霉菌液制备

选取灰绿青霉，在1/4ms液体培养基中接种，置于25℃、20r/min的摇床上培养至od值为0.6-0.8，制成悬浊液，使用时将其稀释10000倍。

4)灰绿青霉菌接种

将需要保护的菊花知识产权品种在售出前最后一次培养于灰绿青霉菌接种的抑菌培养基中，即在超净工作台中进行，向抑菌培养基内部均匀喷洒灰绿青霉菌悬浊液100微升后，再将无菌苗上部幼嫩茎段接入培养基，每瓶接种2-3棵。抑菌培养基中抑菌成分的存在可抑制灰绿青霉菌的生长而不抑制菊花的生长。

5)菊花组培苗接种培养

培养温度为25℃，光周期为16h光照、8h黑暗，光照强度为4000lux。培养直至品种达到售出状态。

6)普通培养基中组培扩繁

将抑菌培养基中培养的菊花无菌苗取上部幼嫩茎段接入普通培养基中，每瓶接种2-3棵，与上述抑菌培养基相同的培养条件下培养，观察生长状态。

应用本方法提供的抑菌培养基，培养的菊花组培苗染菌率为0％,诱导生根率为100％，将抑菌培养基中培养的菊花无菌苗接种到普通培养基后，其染菌率达100％，经观察鉴定，所染菌基本为绿色真菌，即灰绿青霉(图1)。在培养过程中我们发现抑菌培养基生长的菊花苗生根时间、生长发育状态与在普通生根培养基中的表现基本一致，将其炼苗后种植到土壤中，其生长状况良好，无灰绿青霉爆发情况，且表型与普通菊花无异(图2)。